非受体酪氨酸激酶c-Abl/Arg对细胞微管结构的影响

c—abl／Arg非受体酪氨酸激酶的主要生物学功能是参与细胞增殖分化、细胞周期和细胞凋亡的调控,并在氧化应激和DNA损伤修复过程中发挥重要作用。已有研究发现,绝大多数胞质c—Abl的C端可与F-肌动蛋白细胞骨架结合,因而c—Abl在调节肌动蛋白动态平衡、细胞形态以及细胞迁移等方面有着重要的作用。     

RNA干扰p21基因对X射线诱导细胞周期解耦联的影响

目的 研究RNA干扰p21基因对X射线诱导细胞周期解耦联的影响。方法构建RNA 干扰质粒pSilencer3.1-H1 neo-p21,并采用脂质体转染将质粒转入EL-4细胞。 采用单克隆抗体免疫荧光标记及流式细胞术 (FCM) 检测蛋白表达的变化。采用碘化丙啶(PI)荧光标记及FCM检测多倍体细胞数的变化。结果量效实验证实, 1.0~4.0 Gy X射线照射后24 h,EL-4细胞中P21蛋白表达与对照组相比较显著增高。 时效实验证实, 4.0 Gy X射线照射后8~72 h, EL-4细胞中P21蛋白表达与对照组相比较显著增高。 实验证实, 0.5~6.0 Gy X射线照射后,EL-4细胞的八倍体细胞数未见明显变化,X射线照射不诱导EL-4细胞周期解耦联。RNA干扰实验证实, p21基因沉默后, P21蛋白表达于 4.0 Gy照射后24 及48 h, 干扰质粒组与空质粒对照组相比较显著降低;与此同时,干扰质粒组的八倍体细胞数与空质粒组相比较显著增高。结论RNA干扰p21基因使P21蛋白表达抑制后,X射线照射可诱导EL-4细胞周期解耦联。提示,P21蛋白可能在电离辐射诱导细胞周期解耦联中起重要作用。     

中药有效成分通过影响酪氨酸激酶通路抗肿瘤的研究

随着外科手术、放化疗及中西医结合治疗的发展,肿瘤患者生存时间明显延长,但是恶性肿瘤对人类健康的严重威胁仍未得到有效控制。要想提高肿瘤治疗疗效,只有从肿瘤发生发展的机制着手,才能取得新的突破性进展。细胞活性受外部信号控制,细胞信号转导异常可导致恶性肿瘤快速增殖、无限生长,因此,信号转导通路已成为抗肿瘤药物研究的新靶点。中药治疗肿瘤有着悠久历史,随着分子生物学、     

RNA干扰在组织特异性靶向性基因治疗中的研究进展

RNA干扰（RNA interference,RNAI）技术是一种有效的基因沉默技术,由于其高度特异性、高效性以及稳定性等特点,RNA干扰技术在肿瘤基因治疗研究中得到了广泛的应用。靶向性基因治疗是肿瘤生物治疗的一个重要研究方向。本文以RNA干扰技术在靶向性基因治疗中的研究进展进行综述。     

HAVCR2基因沉默对辐射诱发基因组不稳定肝细胞凋亡及细胞周期的影响

目的 研究HAVCR2基因沉默对辐射诱发基因组不稳定肝细胞凋亡及细胞周期的影响。方法 利用慢病毒介导的RNA干扰（RNAi）技术沉默辐射诱发基因组不稳定肝细胞中HAVCR2基因的表达,通过流式细胞术检测HAVCR2基因沉默对细胞周期及凋亡的影响;利用实时荧光定量PCR方法检测HAVCR2基因沉默后p53基因的表达变化。结果 慢病毒介导的RNAi技术能有效沉默HAVCR2基因的表达（t=19.21,P<0.05）,与对照组相比,HAVCR2基因的沉默可导致基因组不稳定肝细胞G₂期阻滞（t=-3.41,P<0.05）,细胞凋亡率降低（t=3.65,P<0.05）;实时荧光定量PCR检测结果表明,HAVCR2基因的沉默诱发基因组不稳定肝细胞p53基因的表达下调（t=4.82,P<0.05）。结论 HAVCR2siRNA使辐射诱发基因组不稳定肝细胞凋亡率降低,使基因组不稳定肝细胞发生G₂期的阻滞。     

RNA干扰抑制端粒酶对受照后端粒长度的影响

目的 探索RNA干扰体内表达质粒抑制端粒酶表达的作用,以及端粒酶抑制后射线对端粒长度的影响.方法 构建RNA干扰体内表达质粒,脂质体介导转染A549细胞系,TRAPELISA法检测端粒酶活性,RT-PCR法检测hTERTmRNA表达,端粒限制性片段平均长度分析法检测端粒长度.结果 pPUR/hTERT质粒在A549转染株内表达可下调hTERT mRNA表达,抑制端粒酶活性;A549照射后端粒明显延长,而pPUR/hTERT表达株照射后未见端粒延长,抑制了射线诱导端粒延长作用.结论 RNA干扰体内表达质粒可抑制端粒酶表达及照射后端粒延长,表明射线诱导端粒延长可能是端粒酶在端粒断裂端合成端粒序列的结果.     

RNA的靶向干扰在肝纤维化中应用研究

肝纤维化是肝脏慢性受损的结果，目前还没有更好的方法用于治疗肝纤维化。RNA干扰（RNAi）被称为是一个功能强大的工具后转录基因沉默，可作为肝纤维化基因治疗的新途径。但是它在体内是缺乏特异性的，妨碍了其在肝纤维化治疗中的应用。为了克服此缺点，国内外专家进行了大量实验研究，如流体力学为基础的研究，局部注射，细胞膜表面选择性配体和特异性启动子或增强子等，本文对RNA靶向干扰在肝纤维化应用进行综述。     

体内RNA干扰抑制盘状受体1对急性肝损伤枯否细胞功能的影响

目的 观察体内注射小干扰RNA(siRNA)技术抑制盘状结构域受体1(DDR1)在急性肝损伤时对枯否细胞(KC)功能的影响. 方法 雄性BALB/c小鼠随机分为对照组、肝损伤模型组、Non-silencing siRNA和DDR1siRNA处理组.采用静脉注射刀豆蛋白A(ConA)15 ms/kg诱发小鼠特异性肝损伤模型,按分组情况给予或不给予尾静脉高压注射裸siRNA(50 μg,2.0～2.5 ms/kg)或等渗盐水.Western印迹法分析DDRl蛋白表达变化、ELISA法检测肝内促炎性细胞因子的表达,同时检测血浆丙氨酸氨基转移酶(ALlT)活性和KC的吞噬功能. 结果 肝脏DDR1蛋白在肝损伤早期6 h才开始明显增高,24 h达到高峰,48 h后又逐渐减少.提前给予DDR1siRNA后明显抑制DDR1蛋白表达,刚时抑制了KC吞噬指数、ALT活性的升高和促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β的表达. 结论 采用体内siRNA技术抑制DDRl在肝脏中的表达,可以明显减轻ConA诱发的小鼠特异性肝损伤,其机制可能是通过抑制KC活化减少了炎性细胞凶子的表达,从而减轻了后期肝免疫性损伤.     

TLR4基因RNA干扰载体的构建及其抑制效率比较

目的 构建含有Toll样受体4(TLR4)基因特异性RNA干扰序列的pSliencer4.1-CMV neo载体,比较其对TLR4的抑制效率.方法 通过Ambion公司的在线软件设计TLR4基因(GenBank:NM138554)的RNA干扰(RNAi)序列,按siRNA设计的优化原则筛选靶序列,再选取其中部分序列进行合成,经退火、连接,构建含有TLR4基因特异性RNA干扰序列的pSliencer4.1-CMVneo载体.用脂质体SPort XP-1分别将载体及阳性和阴性对照质粒转染血管内皮细胞系EVC-304细胞,提取细胞总RNA,进行RT-PCR反应,筛选抑制效率较高的载体.结果 共设计出可供选择的序列228条,经BLAST比对后,有30条序列有较好的序列特异性,并根据其在基因中的相对位置选择9条作为siRNA靶序列.RT-PCR结果表明其中有5个载体具有较高的抑制效率,以TS4,TS6,TS8抑制效率最高,分别为89%,90%,88%,其余siRNA的抑制效率均未超过50%.抑制效果较好的5条序列在TLR4基因中的位置分别为444、1 203、1 389、2 774、3 409nt处.结论 成功构建了抑制效率较高的TLR4基因特异性RNA干扰序列的pSliencer4.1-CMV neo载体,筛选出特异性抑制TLR4表达的序列,为TLR4信号转导的研究奠定了基础.     

RNA干扰的研究及其应用

RNA干扰是近几年才兴起的一种新技术,它是由双链核糖核酸引起的抑制基凶表达的一种现象。从提出至今,虽然只有短短几年时间,但这项技术已应用于多个领域,并取得了突飞猛进的发展。人们发现,RNA干扰在许多牛命科学领域都发挥着重要的作用。fH是同时,RNA十扰的应用还存在着许多问题和限制,这些都有待于研究解决。本文就有关RNA干扰的研究现状及应用予以综述。     

A549肿瘤细胞中特异性hTERT-siRNA的干扰作用研究

目的 研究hTERT特异的siRNA对肿瘤细胞端粒酶活性及细胞生长的抑制作用。方法 设计和构建由U6启动子驱动的产生特异hTERT的siRNA表达质粒,转染至A549肺肿瘤细胞,以TRAP-ELISA方法观察细胞端粒酶活性,Western blot检测端粒酶蛋白的表达,MTT法检测对细胞生长的影响。结果 构建的针对hTERT基因745靶位点的U6表达质粒具有明显的干扰效果,受到特异hTERT-siRNA干扰的A549肿瘤细胞端粒酶表达下调,细胞生长受抑。结论 应用RNA干扰技术可阻止hTERT基因的表达,有望成为肿瘤基因治疗新的研究方向。     

慢病毒载体介导RNA干扰沉默Livin基因对大肠癌裸鼠移植瘤放射敏感性的影响

目的 探讨慢病毒载体介导RNA干扰沉默Livin基因表达,对大肠癌HT-29细胞裸鼠移植瘤生长及放射敏感性的影响。 方法 选取36只BALB/c(nu/nu)裸鼠,按随机区组法分为空白对照组、阴性对照组及实验组,将HT-29细胞接种于裸鼠,建立皮下移植瘤裸鼠模型,观察裸鼠体重及瘤体积的变化。RT-PCR、免疫组织化学分析Livin mRNA及蛋白表达的变化,原位末端标记法(TUNEL)法检测细胞凋亡的变化;瘤内注射生理盐水、空载慢病毒和干扰慢病毒,同时均给予10 Gy 6 MV X射线照射,绘制裸鼠体重和移植瘤生长曲线。结果 实验组体积抑瘤率为(50.04±0.07)%,瘤体重量明显减轻(F=4.85,P<0.05), 瘤重抑瘤率为(50.27±0.17)%。实验组Livin mRNA表达水平为(17.75±0.08)%,明显低于空白对照组的(67.60±0.05)%和阴性对照组的(68.54±0.03)% (F=89.97, P<0.01)。实验组Livin蛋白表达水平为(36.00±3.40)%,明显低于空白对照组的(85.00±3.15)%和阴性对照组的(80.33±3.08)%(F=107.32,P<0.01)。实验组凋亡率为(23.67±2.25)%,明显高于空白对照组的(5.00±1.50)%和阴性对照组的(8.33±1.82)%(F=56.94,P<0.01)。与射线联合时,裸鼠移植瘤体积在分组之间总体存在差异(F=10.70,P<0.01),实验组肿瘤体积变化小于阴性对照组和空白对照组(F=7.01~9.32,P<0.01)。结论 慢病毒载体介导RNA干扰沉默Livin基因表达能抑制大肠癌HT-29细胞裸鼠移植瘤的生长,并增加移植瘤对放疗的敏感性。     

RNA干扰肝癌MHCC97-H细胞N-Ras基因对放射敏感性的影响

目的 探讨RNA干扰(RNAi)N-Ras基因增强人肝癌MHCC-97细胞的放射敏感性.方法 通过构建干扰N-Ras基因siRNA,采用免疫组织化学法、实时荧光定量RT-PCR、Western blot、MTT法观察RNAi前后肝癌MHCC97-H细胞RNA水平、蛋白水平、生长情况等变化,照射后用细胞克隆计数实验检测放射敏感性变化.结果 MHCC97-H细胞株RNAi后mRNA表达抑制率为96.9%±0.159%,RNAi前后差异有统计学意义(t=40.377,P＜0.05),蛋白表达抑制率为89.8%±0.012%,RNAi前后差异有统计学意义(t=31.595,P＜0.05),免疫组织化学显示90%表达被抑制,细胞生长抑制率为21.9%,RNAi前后差异均有统计学意义(F=4.63,P＜0.05).MHCC97.H细胞RNAi后增敏比(SER)=1.15.结论 RNAi肝癌MHCC97-H细胞N-Ras基因可以达到放射增敏的目的.

Abstract：

Objective To investigate the radiosensitivity of silencing N-Ras by RNA interference in hepatoma carcinoma cell MHCC-97.Methods N-Ras RNA interference (RNAi) vector was constructed by using pcDNA 6.2-GW/EmGFP-mir plamid.The RNAi effect was detected by RT-PCR,Western bolt,immunohistochemisty and MTT method.Survival curve for each cell line were obtained by measuring the clone forming abilities of irradiated cell populations.Results After silencing the N-Ras by RNAi,The expression level of N-Ras mRNA,N-Ras protein,immunohistochemisty were decreased 96.9% ±0.159%(t=40.377,P＜0.05),89.8%±0.012% (t=31.595,P＜0.05),90%,respectively,and The survival of hepatoma carcinoma cell MHCC-97 line were inhibited 21.9% (F = 4.63,P < 0.05).Which have significant difference in statistics.The SER of hepatoma carcinoma cell MHCC-97 line after interference was 1.15.Conclusions RNAi targeting silence N-Ras may increase the radiosensitivity of hepatoma carcinoma cell MHCC-97 line.     

RNA干涉治疗脑胶质瘤的研究进展

RNA干涉(RNAi)是由双链RNA引发序列特异性的转录后基因沉默.RNA干涉(RNAi)技术的出现为胶质瘤基因治疗的研究提供了新的策略.在研究过程中,不断有新的可能用于RNAi治疗脑胶质瘤的靶标基因被发现,其治疗脑胶质瘤作用主要通过抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡、导致肿瘤细胞周期阻滞或增加肿瘤细胞化疗敏感性的机制来实现.     

酪氨酸代谢物对肺癌细胞增殖、周期及化疗药物敏感性的影响

目的 探讨4种酪氨酸代谢物对肺癌细胞增殖、周期及化疗药物敏感性的影响.方法 不同浓度的酪氨酸代谢物——酪氨酸、4-羟苯丙酮酸(HPPA)、尿黑酸(HGA)、延胡索酸(FA)分别处理A549细胞,通过高内涵实时监测肺癌细胞的增殖,流式细胞仪检测肺癌细胞周期的变化及对化疗药物的敏感性,Western印迹检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达.结果 4种酪氨酸代谢物对A549细胞的增殖及周期均无影响.HGA可降低吉非替尼(Gefitinib)诱导的A549细胞凋亡,抑制Bax表达,同时上调Bcl-2的表达水平;FA则可增加其诱导的A549细胞凋亡,促进Bax表达,同时下调Bcl-2的表达水平.酪氨酸和HPPA对Gefitinib诱导的细胞凋亡均无明显影响.结论HGA与FA可调节肺癌细胞化疗药物的敏感性,揭示了酪氨酸代谢通路对肺癌细胞的调控作用,为肿瘤代谢异常的研究奠定了基础.     

RNA干扰组蛋白去乙酰化酶1对人胰腺癌细胞增殖、凋亡的调控机制研究

目的观察沉默组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)基因对人胰腺癌PaTu8988细胞增殖、凋亡的影响及可能机制。方法胰腺癌PaTu8988细胞株分为空白对照组(不予任何处理)、阴性对照siRNA组(予以30nmol/L阴性siRNA)、siRNA1组(予以15nmol/LHDAC1siRNA)和siRNA2组(予以30nmol/LHDAC1siRNA)。siRNA转染48h后,用相对实时定量RT-PCR法和West-ernblotting检测HDAC1基因表达情况;相对实时定量RT-PCR法检测细胞增殖凋亡相关基因p21、Bcl-2、Bax的表达;WST-8法检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡变化。结果转染HDAC1siRNA48h后人胰腺癌PaTu8988细胞中HDAC1mRNA表达量在siRNA1组和siRNA2组分别为46.1%±6.1%和32.3%±1.4%,均显著低于空白对照组(100.0%±3.4%)和阴性对照siRNA组(87.4%±28.3%,P<0.05)。Westernblotting显示HDAC1蛋白表达量亦明显下降,以siRNA2组表达量最低(P<0.05)。WST-8法检测显示4组细...     

Survivin siRNA联合紫杉醇对肺癌细胞株的生长抑制作用

目的探讨survivin siRNA对肺癌A549细胞化疗敏感性的影响。方法将A549细胞分为siRNA转染组、N-siRNA转染组、阴性对照组、空白对照组,用MTT法检测不同浓度紫杉醇联合siRNA对细胞存活率的影响。将A549细胞分为阴性对照组、siRNA组、紫杉醇组、siRNA 紫杉醇组,采用MTT法检测siRNA联合紫杉醇作用不同时间对细胞存活率的影响;采用Western blot检测细胞内survivin、p21、PARP蛋白表达变化;采用流式细胞仪分析各组细胞周期和凋亡变化的差异。结果Survivin siRNA可增加A549细胞对不同浓度紫杉醇的敏感性,但以低浓度(0.1、1、10nmol/L)最显著(P<0.05);survivin siRNA与10nmol/L紫杉醇共同处理A549细胞48h后,对细胞增殖的抑制具有协同或相加的效果(q值分别为1.34、1.03、1.02)。siRNA不仅可以抑制A549细胞内源性survivin表达还可以抑制紫杉醇诱导的survivin表达,阴性对照组、紫杉醇组、siRNA组和siRNA 紫杉醇组中survivin蛋白条带相对强度分别为0.244、0.99、0、0;survivin siRNA和紫杉醇联合作用后,对凋亡的诱导也有轻度相加作用,阴性对照组、紫杉醇组、siR-NA组和siRNA 紫杉醇组凋亡率分别为0.47%、9.50%、4.78%、19.81%;与对照组相比,siRNA和紫杉醇联合作用对细胞周期的影响表现为G1期、G2/M期细胞增加,S期细胞比率明显减少,对PARP的裂解和p21蛋白的表达也有促进作用。结论Survivin过表达可能参与了紫杉醇获得性耐药的形成,siRNA阻抑survivin表达是增加肺癌细胞对紫杉醇敏感性的有效途径。     

载体介导的siRNA对SGC-7901胃癌细胞中hPOT1表达的抑制作用

目的构建人端粒保护蛋白（hPOT1）基因的短链干扰核糖核酸（siRNA）表达载体，观察其在胃癌细胞中抑制hPOT1基因表达的作用，为进一步研究hPOT1在胃癌细胞生长增殖中的作用打下基础。方法设计并化学合成64nt编码hPOT1 siRNA基因片段的寡核苷酸，退火成双链后将其连接到pSUPER质粒的H1 RNA启动子下游，构建psiRNA-hPOT1重组质粒。经酶切、测序鉴定后，用脂质体介导的基因转染方法，转人SGC-7901胃癌细胞，用半定量RT-PCR检测hPOT1表达水平的变化。结果测序结果表明重组质粒psiRNA-hPOT1 64个碱基成功插人到预定位置，并且序列完全一致。hPOT1 siRNA表达载体psiRNA-hPOT1转入胃癌细胞后，可明显抑制SGC-7901细胞hPOT1的表达。结论构建的hPOT1基因的siRNA表达载体psiRNA-hPOT1重组质粒能显著抑制hPOT1基因在SGC-7901胃癌细胞中的表达。     

电离辐射对不同肿瘤细胞细胞周期的影响

目的 研究电离辐射对不同肿瘤细胞细胞周期的影响为肿瘤放疗及化疗提供科学依据。方法 处于细胞周期各时相的细胞百分数采用流式细胞术进行检测。结果 研究表明：电离辐射作用后,ＨｅｌａＳ３和Ｓ１８０细胞发生了Ｓ和Ｇ２期阻滞,而ＤＬ－４细胞则发生Ｇ１和Ｇ２期阻滞,Ｂ１６各时相细胞数无列出较高的辐射抗性。结论 电离辐射作用后,不同肿瘤细胞的辐射抗性、即辐射敏感性有较大差异。其细胞周期的变化规律亦不相同。     

RNA干扰HIF-1α对人肺腺癌细胞SPCA-1摄取18F-FDG的影响

目的探讨RNA干扰乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)对人肺腺癌细胞SPCA-1摄取18F-脱氧葡萄糖(FDG)的影响.方法构建干扰HIE-1α质粒pSUPER-HIF-1α,采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western印迹法观察有氧与乏氧状态下RNA干扰后HIF-1α的变化,用γ计数仪检测其对SPCA-1细胞摄取18F-FDG的影响.结果RNA干扰HIF-1α,在乏氧和常氧状态下致mRNA表达分别下降76%和64%,空载体对照组分别为5%和0%;在乏氧状态下,蛋白质的表达下降,SPCA-1细胞对18F-FDG的摄取明显降低(P＜0.05).结论在乏氧状态下,RNA干扰HIF-1α明显降低SPCA-1细胞对18F-FIDG的摄取.