小鼠IL－3 cDNA转化细胞移植体内表达的初步研究

随着基因治疗技术的发展和多个细胞因子基因的克隆，人们提出了供细胞因子的基因治疗的设想，以期为肿瘤、老年性痴呆、严重的造血功能障碍等这样一类难治疾病的治疗另辟蹊径。为改善放射损伤小鼠受抑制的造血功能，我们采用基因治疗的方法，将小鼠ＩＬ－３基因ｃＤＮＡ与逆转录病毒载体重组，转染包装细胞ＰＡ３１７，用其分泌的含ＩＬ－３ｃＤＮＡ的复制缺陷逆转录病毒感染、转化ＮＩＨ３Ｔ３细胞，从中筛选可在体外分泌ＩＬ－３的克隆，将可分泌ＩＬ－３的细胞种植到放射损伤小鼠体内后发现：受体小鼠血清中检出了ＩＬ－３的活性；其外周血白细胞计数升至５５万／ｍｍ３，以成熟中性粒细胞为主；肝、脾脏内有大量各个分化阶段的中性粒细胞。这些结果表明：可以利用基因治疗技术，在体内表达ＩＬ－３，改善机体的造血功能。     

白细胞介素11基因治疗促进造血的实验研究

白细胞介素１１是一种具有广泛生物学功能的造血生长因子，体内体外实验均显示ＩＬ－１１具有显著的造血促进作用。为了探讨ＩＬ－１１基因治疗应用于造血功能低下疾病的可能性，构建了含人ＩＬ－１１ｃＤＮＡ的逆转录病毒载体，并转染小鼠成纤维系ＮＩＨ－３Ｔ３，经是筛选获得３株表达ＩＬ－１１ 转染细胞亚克隆。     

小鼠IL—3cDNA逆转录病毒载体的榴建有在NIH3TE细胞中的表达

为了探讨放射损伤小鼠ＩＬ－３基因治疗可能性，本文作者将小鼠ＩＬ－３ｃＤＮＡ亚克隆到逆转录病毒载ｐＬＸＳＮ上。将重组的逆转录病毒载体用电穿孔法和磷酸钙共沉淀法转染双向包装细胞系ＰＡ３１７，经新霉素类抗菌Ｇ４１８选择，得到了多个产病毒细胞克隆。用含有复缺陷病毒的产病毒细胞培养上清转化ＮＩＨ３Ｔ３细胞，得到了数个自发分泌ＩＬ－３的克隆。在去掉Ｇ４１８，传代１５代，约２个月后，这些克隆分泌ＩＬ－３的能力没     

逆转录病毒介导的β－珠蛋白基因在小鼠骨髓单核细胞的表达

从小鼠Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ股骨分离得到骨髓单核细胞（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ，ＢＭＭＣ），并在体外建立了ＢＭＭＣ细胞培养体系。将携带有人β－珠蛋白基因及其增强子的逆转录病毒载体（Ｎ２ＡβＥ３６）经ＤＮＡ磷酸钙共沉淀转染单向性包装细胞系（ψ－２）收集抗Ｇ４１８阳性ψ－２细胞克隆的病毒上清，感染体外培养的ＢＭＭＣ，同时加入白介素－３（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３，ＩＬ－３）、白介素－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６，ＩＬ－６）、红细胞生成素（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｅｐｏ）等造血调节因子以促进造血细胞的增殖及提高基因转移的效率。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析证实在小鼠ＢＭＭＣ中具有β－珠蛋白基因的整合与表达。     

IL－3基因疗法对化疗造血损伤的恢复作用

白细胞介素３（ＩＬ－３）是一种具有很强造血调控作用的细胞因子，本实验观察了成纤维细胞介导的ＩＬ－３基因疗法对大剂量环磷酰胺体内注射后造血功能损伤小鼠的恢复作用。结果表明：接受ＩＬ－３基因疗法的实验小鼠外周血白细胞和血小板数量降低程度减弱，回升速度加快，其脾脏和骨髓ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－ＭＫ、ＣＦＵ－Ｓ水平显著地高于对照小鼠，可见成纤维细胞介导的ＩＬ－３基因疗法可显著地降低大剂量化疗后造血损伤程度，并能显著地促进受损的造血功能尽快恢复，提示若将ＩＬ－３基因疗法与大剂量化疗联合应用将提高肿瘤治疗的效果。     

逆转录病毒介导的IL－2和TNF－α融合基因在卵巢癌细胞中的表达及其对肿瘤细胞生长的影响

ＩＬ－４和ＴＮＦ－α是引人注目的抗肿瘤活性因子，两者在抗肿瘤及免疫调节方面具有协同作用。我们利用逆转录病毒载体Ｘｄ１构建了插入ＩＬ－２和ＴＮＦ－α融合基因的重组逆转录病毒载体ＸｄＦ，融合基因包括编码ＩＬ－２前导肽和ＩＬ－２和ＴＮＦ－α成熟肽的序列。重组载体用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法引入病毒包装细胞ＰＡ３１７，挑选Ｇ４１８抗性克隆，用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒滴度，获得一滴度为１×１０￣４ＣＦＵ／ｍｌ的高滴度克隆。超速离心浓缩这一重组病毒上清，转导人卵巢癌细胞系ＳＫＯＶ３，经Ｇ４１８筛选获得抗性克隆。ＰＣＲ可从融合基因转导的细胞ＤＮＡ中扩增出１．１ｋｂ的融合基因片断，证明目的基因完整的整合在细胞的基因组ＤＮＡ中，测其上清中的ＩＬ－２和ＴＮＦ－α活性结果显示：ＩＬ－２的活性为８－１５Ｕ／１０￣６ｃｅｌｌｓ／２４ｈ，ＴＮＦ－α的活性为１５０－４００Ｕ／１０￣６ｃｅｌｌｓ／２４ｈ。这一结果表明逆转录病毒介导的融合基因可以在卵巢癌细胞中获得有效表达，表达的融合基因产物在体内和体外部对肿瘤细胞的生长具有抑制作用。     

丙型肝炎病毒核心基因疫苗诱导小鼠细胞及体液免疫应答

为了探索丙型肝炎病毒核心区基因疫苗对小白鼠细胞及体液免疫功能的影响。本文将ＨＣＶ核心区基因定向克隆于质粒ｐｃＤＮＡ３巨细胞病毒启动子下游,构建了能在真核细胞内表达的重组基因疫苗ｐｃＤＮＡ３－ＨＣＶ,将此疫苗通过多点肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠。结果发现接种了该疫苗的小鼠出现抗－ＨＣＶＩｇＧ阳性,其抗体水平明显高于对照组,同时Ｔｈ１免疫应答相关的细胞因子ＩＬ－２及γ干扰素水平也明显高于对照组,其结果     

白细胞介素4基因转移的肿瘤细胞体外生物学特性及体内致瘤性的研究

观察了白细胞介素４（ＩＬ－４）基因转移的肿瘤细胞体内致瘤性的变化。构建了含５００ｂｐ的小鼠ＩＬ－４ｃＤＮＡ的真核表达载体ＢＭＧＮｅｏ－ＩＬ－４．用该表达载体将ＩＬ－４基因转移至小鼠Ｂ１６黑色素瘤细胞，通过Ｇ４１８抗性筛选、有限稀释法及ＩＬ－４活性检测，获得了高分泌ＩＬ－４的黑色素瘤细胞克隆株并经Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹鉴定，将其接种于小鼠皮下后观察到肿瘤生长缓慢、小鼠存活期延长，表明高分泌ＩＬ－４的细胞克隆株体内致瘤性显著下降。该结果为进一步研究肿瘤的ＩＬ－４基因治疗打下了基础。     

应用IL—2和IL—3联合基因疗法对骨髓移植后造血及免疫…

以大剂量化疗后骨髓功能严重损伤再给予同基因骨髓移植的小鼠为实验模型，动态观察了联合应用成纤维细胞介导的ＩＬ－２基因疗法和ＩＬ－３基因疗法对同基因骨髓移植后实验小鼠骨髓造血免疫功能重建的影响。结果表明，ＩＬ－２基因疗法对造血重建无明显效果，ＩＬ－３基因疗法对免疫重建无明显作用，但联合应用ＩＬ－２基因疗法和ＩＬ－３基因疗法能显著加快骨髓ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－ＭＫ及ＣＦＵ－Ｅ恢复过程及提高骨髓细胞ＮＫ、     

IL—3基因疗法对化疗造血损伤的恢复作用

白细胞介素３（ＩＬ－３）是一种具有很强造血调控作用的细胞因子。本实验观察了成纤维细胞介导的ＩＬ－３基因疗法对大剂量环磷酰胺体内注射后造血功能损伤小鼠的恢复作用。结果表明：接爱ＩＬ－３基因疗法的实验小鼠外周血白细胞和血小板数量降低程度减弱，回升速度加快，其脾脏和骨髓ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－ＭＫ、ＣＦＵ－Ｓ水平显著地高于对照小鼠，可见成纤维细胞介导的ＩＬ－３基因疗法可显著地降低大剂量化疗后造     

脂质体介导的IL－2基因疗法的建立及其免疫增强作用

用反相蒸发技术制备出包裹有ＩＬ－２ＤＮＡ的脂质体，将其直接注射至小鼠腹腔中，经１０ｄ后发现，腹腔细胞体外培养的上清中含有较高水平的ＩＬ－２，腹腔巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的活性明显增强，脾细胞体外增殖、脾细胞ＮＫ活性及体外诱导的ＬＡＫ活性均明显高于对照组；同时经脂质体转染ＩＬ－２基因的脾脏细胞具有较高的内源性ＬＡＫ活性。这表明，脂质体能将目的基因经腹腔途径直接转染体内细胞，表达出基因产物──ＩＬ－２。这种靶细胞表达的基因产物可作用于体内免疫系统，调节机体的免疫功能。本文结果为细胞因子的基因治疗的研究提供了一种简便有效的方法。     

人白细胞介素2基因转移对小鼠B16黑色素瘤细胞生长转移特性…

为开展人白细胞介素２基因转移瘤苗地抗肿瘤作用的研究。须首先获得能较稳定分泌ＩＬ的转基因肿瘤细胞，交了解其生长转移特性。应用ＸＭ６逆转录病毒载体将人ＩＬ２ｃＤＮＡ转入小鼠Ｂ１６黑色素瘤细胞。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实获得ＩＬ２基因转移的Ｂ１６细胞。     

重组人IL－6对大鼠急性白血病细胞体外增殖的抑制

我们已报道重组大鼠ＩＬ－３和小鼠ＧＭ－ＣｓＦ对ＬＴ１２白血病细胞的增殖有不同程度的抑制活性。本研究发现重组人ＩＬ－６在１０００～５０００Ｕ／ｍｌ呈剂量依赖性抑制ＬＴＩ２白血病祖细胞集落形成及ＤＮＡ合成。５０００Ｕ／ｍｌ对ＣＦＵ－Ｌ的抑制率达５２．９％，而对ＤＮＡ合成则为４１．３％，此外，ＩＬ－６还明显增加ＩＬ－３和ＧＭ－ＣＳＦ对ＬＴ１２细胞的抑制活性，对ＣＦＵ－Ｌ的抑制强弱依次为ＩＬ－６＋ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－３＋ＧＭ－ＣＳＦ、及ＩＬ－６＋ＩＬ－３，ＩＬ－６＋ＩＬ－３＋ＧＭ－ＣＳＦ三因子的结合并不能增加抑制效应；对ＤＮＡ合成的抑制作用为ＩＬ－６＋ＩＬ－３＋ＧＭ－ＣＳＦ＞ＩＬ－６＋ＧＭ－ＣＳＦ＞ＩＬ－３＋ＧＭ－ＣＳＦ＞ＩＬ－６＋ＩＬ－３。提示上述造血因子除刺激正常造血外，在白血病的治疗中可能具有一定意义。     

应用IL-2和IL-3联合基因疗法对骨髓移植后造血及免疫功能重建的影响

以大剂量化疗后骨髓功能严重损伤再给予同基因骨髓移植的小鼠为实验模型，动态观察了联合应用成纤维细胞介导的ＩＬ－２基因疗法和ＩＬ－３基因疗法对同基因骨髓移植后实验小鼠骨髓造血免疫功能重建的影响。结果表明，ＩＬ－２基因疗法对造血重建无明显效果，ＩＬ－３基因疗法对免疫重建无明显作用，但联合应用ＩＬ－２基因疗法和ＩＬ－３基因疗法能显著加快骨髓ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－ＭＫ及ＣＦＵ－Ｅ恢复过程及提高骨髓细胞ＮＫ、ＬＡＫ活性和ＣｏｎＡ刺激的骨髓细胞增殖反应。提示联合应用成纤维细胞介导的ＩＬ－２和ＩＬ－３基因疗法能显著加快骨髓移植后造血及免疫重建过程，从而有可能提高骨髓移植成功率。     

IL-2基因修饰成纤维细胞对肝癌荷瘤小鼠的治疗实验

目的研究双顺反子逆转录病毒载体介导ＩＬ－２基因转导成纤维细胞对小鼠肝癌的治疗作用。方法利用双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ／ＩＬ－２将ＩＬ－２基因转导小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３，然后将分泌ＩＬ－２的成纤维细胞与６０Ｇｙγ射线照射的肝癌Ｈ２２细胞皮下植入三天前５×１０５或２．２×１０５肝癌Ｈ２２细胞皮下注射的ＢＡＬＢ／ｃ鼠。结果分泌ＩＬ－２的成纤维细胞治疗组能明显增加荷瘤小鼠的生存率（Ｐ＜０．０２５），抑制肿瘤生长（Ｐ＜０．０５），在肿瘤植入第７０天无肿瘤形成的小鼠再次注射１×１０６Ｈ２２细胞仍然不发生肿瘤。５１Ｃｒ释放试验表明来自照射Ｈ２２与分泌ＩＬ－２成纤维细胞混合液注射的小鼠脾细胞与５１Ｃｒ标记的Ｈ２２细胞共培养后，５１Ｃｒ特异释放明显高于对照组（Ｐ＜０．０５）。结论实验结果表明ＩＬ－２基因修饰的成纤维细胞能诱导针对肝癌的特异免疫反应。     

小鼠白细胞介素6的cDNA克隆及其在昆虫细胞中的表达

本文采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从ＬＰＳ刺激后的小鼠腹腔巨噬细胞，扩增小鼠ＩＬ－６ｃＤＮＡ，并克隆构建ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）ＩＬ－６质粒，继将小鼠所得ｃＤＮＡ克隆到ｐＶＬ１３９２载体上，利用杆状病毒ＡｃＮＰＶ表达系统在Ｓｆ９中进行瞬间表达，用ＩＬ－６依赖细胞株ＭＨ６０·ＢＳＦ２检测其表达活性，结果表明，感染后４８ｈ后就具有明显ＩＬ－６表达，由此可见，利用该系统可成功地表达小鼠ＩＬ－６基因。     

应用重组PCR技术克建人单链白细胞介素12融合基因

目的 构建人单链白细胞介素１２（ｈｓｃＩＬ－１２）融合基因并在真核细胞中进行表达,为进一步研究ｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白的生物学活性奠定基础。方法 应用重组ＰＣＲ技术将ｈＩＬ－１２ｐ４０和ｐ３５亚单位两段编码序列的ｃＤＮＡ通过一疏水性多肽接头（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３碱基序列进行前后拼拼（ＩＬ－１２ｐ４０－多肽接头－ｐ３５）,构建ｈｓｃＩＬ－１２融合基因,并进行核苷酸序列测定,进一步将ｈｓｃＩＬ－１２融合基因插入ｐｃＤＮＡ３．１真核表达载体中,转染ＣＯＳ－７细胞表达ｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白,并行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。结果 该融合基因经ＤＮＡ序列分析表明：ｐ４０、ｐ３５、ｌｉｎｋｅｒ的连接顺序、方向及序列完全正确,融合基因可在ＣＯＳ－７细胞中表达ｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ显示该融合蛋白分子     

人IL-12的克隆、表达及生物活性的鉴定

目的：克隆中国人ＩＬ－２ｐ４０基因,构建ＩＬ－１２的真核基因表达载体。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ从北京地区人脐血树突状细胞（ＤＣ）中克隆ＩＬ－１２ｐ４０ｃＤＮＡ基因,并进行序列分析。利用ｐｃＤＮＡ３．１和ｐＬＸＰＸＳＮ构建ＩＬ－１２表达载体,转染人肝癌细胞后对其进行生物学和免疫学分析。结果：北京地区人ＤＣ中ＩＬ－１２ｐ４０ｃＤＮＡ基因２１０位密码子有独特的结构,为ＧＣＣ（Ａｌａ）。并且２３９和２９１位     

逆转录病毒载体介导IL-2基因转染人肝细胞的建立及其部分生物学性状

目的　　建立ｈＩＬ－２基因修饰的人肝细胞株并探讨对其生物学活性的影响。　方法应用重组逆转录病毒载体ｐＬＮＣＩＬ－２，将ｈＩＬ－２基因导入人肝细胞系Ｌ－０２，观察其形态及克隆形成率的变化，检测细胞培养上清中ｈＩＬ－２的含量，以及进行转染细胞基因组ＤＮＡ　ＮｅｏＲ基因片段的ＰＣＲ扩增。结果Ｌ－０２／ＩＬ－２细胞的增殖速度和克隆形成率低于Ｌ－０２／Ｎｅｏ细胞和Ｌ－０２细胞。Ｌ－０２／ＩＬ－２细胞的培养液中ｈＩＬ－２的含量达３２　０００　ｐｇ／１０６ｃｅｌｌｓ·ｄ，并可持续表达１０　ｗｋ以上。从Ｌ－０２／ＩＬ－２细胞和Ｌ－０２／Ｎｅｏ细胞基因组ＤＮＡ中，均扩增到ＮｅｏＲ基因片段（７９０　ｂｐ）。结论应用重组逆转录病毒载体成功地建立了Ｌ－０２／ＩＬ－２细胞株，为进一步进行肝细胞移植动物实验奠定了基础。     

人IL—4选择性剪接变异体（IL—4δ2）cDNA的克隆和序列测定

在对多种细胞因子的激活条件进行对比实验的基础上，我们成功地构建了人外周血激活淋巴细胞ｃＤＮＡ单链库。并采用ＩＬ－４特异引物和ＲＴ－ＰＣＲ技术，在从此库中克隆出了ＩＬ－４ｃＤＮＡ的同时，也获得了其选择性剪接变异体（ＩＬ－４δ２）ｃＤＮＡ。测序结果表明，所克隆的ＩＬ－４δ２ｃＤＮＡ含有成熟ＩＬ－４蛋白的外显子１，３，４编码区和前导肽编码序列，唯编码１６个氨基酸的外显子２在转录后被剪接掉。这一研究为今后进一步探究细胞因子选择性剪接变异体的工作奠定了基础。