BamHI酶切位点变异区域性分布在HCV1b型5''''非编码区的研究

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)1b型5'非编码区BamHⅠ酶切位点变异的区域性分布。方法对来自中国4个不同地区的64例HCV1b基因型血清样品进行5'-NCR扩增后,分别用MboⅠ、BamHⅠ限制性内切酶酶切分析,比较不同地区变异株分布的差异。结果测序证实中国HCV1b基因型在117位有BamHⅠ酶切位点。64例血清样品中,BamHⅠ单切点变异株,华南7例(28%),东北1例(10%),华北1例(11.1%),西南0例;MboⅠ及BamHⅠ切点均无的变异株,西南8例(40%),华南2例(4%),东北1例(10%),华北0例。结论证实HCV1b型BamHⅠ变异具有区域性分布特点,华南地区和西南地区变异较多,华北和东北变异较少。而这一变异是否与干扰素治疗耐药有关,尚有待于进一步研究。     

BamH Ⅰ酶切位点变异区域性分布在HCV 1b型5''''非编码区的研究

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)1b型5'非编码区BamHⅠ酶切位点变异的区域性分布.方法对来自中国4个不同地区的64例HCV 1b基因型血清样品进行5'-NCR扩增后,分别用Mbo Ⅰ、BamH Ⅰ限制性内切酶酶切分析,比较不同地区变异株分布的差异.结果测序证实中国HCV 1b基因型在117位有BamH Ⅰ酶切位点.64例血清样品中,BamH Ⅰ单切点变异株,华南7例(28%),东北1例(10%),华北1例(11.1%),西南0例;Mbo Ⅰ及BamHⅠ切点均无的变异株,西南8例(40%),华南2例(4%),东北1例(10%),华北0例.结论证实HCV 1b型BamH Ⅰ变异具有区域性分布特点,华南地区和西南地区变异较多,华北和东北变异较少.而这一变异是否与干扰素治疗耐药有关,尚有待于进一步研究.     

中国东北部延边地区丙型肝炎病毒1a型感染研究

目的初步探讨东北部延边地区HCV基因型分布和1a型的感染状况。方法对44例来自延边地区的HCVRNA阳性样本进行HCV5’非编码区（5’NCR）复合酶切分型分析。将分型结果为1a型的4例样品（分别为Y2、Y4、Y6、Y8）进行5’NCR和NS5B区的扩增,测序,然后与27个HCV全基因参考序列（均来自GenBank）比对并构建遗传进化树。结果44例样品中1a／1b混合型19例（43．1％）,1b型12例（27．3％）,2a／1b混合型8例（18．2％）,1a型4例（9．1％）,2a型1例（2．3％）,2b型以及3～6型未检出。其中,1a型的4例样品Y2、Y4、Y6、Y8分别与各基因型的全基因参考序列相比较,在5’NCR与1a型参考序列HC—J1的同源性最高,分别为0．990、0．990、0．990、0．990,进化树分析也证实为1a型;在NS5B区与1b型参考序列HC—J4的同源性最高,分别为0．936、0．957、0．936、0．936,进化树分析表明为1b型。结论延边地区以1a／1b型混合感染为主,1b型和1b／2a型感染次之,与中国其他地区存在明显差异。对4例1a型HCV病毒株的分析发现,存在HCV5’NCR与NS5B分型结果不一致现象。分析推测可能是HCV基因组在生物进化过程中自然重组的表现,但尚需进一步研究证实。     

华南HCV 1b亚型NS5A插入式复制子重组质粒的构建和序列分析

目的构建来自华南不同慢性丙型肝炎(CHC)患者的HCV NS5A的复制子重组质粒并测序分析,探索HCV NS5A在抗病毒应答中生物学特性。方法以能够高效复制的1b型HCV复制子质粒为骨架,构成带有MIuⅠ和BclⅠ双酶切位点的开关质粒,采用逆转录-聚合酶链反应从不同CHC患者血清中扩增获得HCV 1b亚型NS5A全长片段,克隆到pMD-18载体中,测序分析其中的PKRBD、ISDR、V3和IRRDR区域的变异情况。扩增产物中无MIuⅠ和BclⅠ酶切序列的,在引物中引入相关酶切序列后再扩增,双酶切后将NS5A区段置换入HCV 1b复制子骨架中。结果成功扩增出NS5A全长片段并克隆测序,将NS5A区ISDR-V3区域置换入复制子中,测序结果正确。序列比对显示应答株的ISDR和PKRBD氨基酸变异数目比无应答株高;V3和IRRDR区域存在较高氨基酸突变率。结论成功构建包含华南HCV 1b亚型NS5A核心区域的复制子插入式重组质粒,为研究HCV NS5A生物学特性、干扰素抵抗的机制以及难治性CHC患者的个体化抗病毒治疗分析奠定了基础。     

华南HCV 1b亚型NS5A插入式复制子重组质粒的构建和序列分析

摘要：目的构建来自华南不同慢性丙型肝炎（CHC）患者的HCV NS5A的复制子重组质粒并测序分析,探索HCV NS5A在抗病
毒应答中生物学特性。方法以能够高效复制的1b型HCV复制子质粒为骨架,构成带有MIuⅠ和BclⅠ双酶切位点的开关质
粒,采用逆转录-聚合酶链反应从不同CHC患者血清中扩增获得HCV 1b亚型NS5A全长片段,克隆到pMD-18载体中,测序分
析其中的PKRBD、ISDR、V3和IRRDR区域的变异情况。扩增产物中无MIuⅠ和BclⅠ酶切序列的,在引物中引入相关酶切序
列后再扩增,双酶切后将NS5A区段置换入HCV 1b复制子骨架中。结果成功扩增出NS5A全长片段并克隆测序,将NS5A区
ISDR-V3区域置换入复制子中,测序结果正确。序列比对显示应答株的ISDR和PKRBD氨基酸变异数目比无应答株高;V3和
IRRDR区域存在较高氨基酸突变率。结论成功构建包含华南HCV 1b亚型NS5A核心区域的复制子插入式重组质粒,为研究
HCV NS5A生物学特性、干扰素抵抗的机制以及难治性CHC患者的个体化抗病毒治疗分析奠定了基础。
     

HCV NS5 b 套式 PCR在酶切基因分型研究中的应用

目的 :探讨HCVNS5b区酶切分型技术在临床上的应用。方法 :选用了HpaⅡ、Cfr10Ⅰ、AluⅠ、HhaⅠ、HaeⅢ、ApaⅠ、AvaⅡ、TaqⅠ、BstNⅠ、Sau 3AⅠ、StuⅠ、BalⅠ、SmaⅠ等 13种限制性内切酶 ,对已知2 3例 1b型和 17例 2a型样品进行酶切分析和验证。结果 :40例NS5b分型结果表明 2 3例 1b型中有AluⅠ特异切点 ,无 1a的BalⅠ切点和 2b的MboⅠ切点 ,17例 2a型中无A1uⅠ切点和 1a的BalⅠ及 2b的MboⅠ切点。StuⅠ可用于 1b型中基因变异诊断。结论 :HCVNS5b分型结果提示应用该分型技术 ,不仅达到了基因分型效果 ,而且还可检测基因变异 ,证实了我国存在着 1b和 1b混合感染状态     

重庆地区69例丙型肝炎病毒感染基因分型研究

目的：探讨重庆地区HCV流行的主要基因型。方法：提取69份血清标本的HCV RNA，通过逆转录套式PCR（RTnested-PCR)扩增5'端非编码区（5'NCR)，以4种限制性内切酶BstUⅠ，NciⅠ，HaeⅢ,RsaⅠ对扩增产物进行限制性片段长度多态性分析（RFLP），依据不同的酶切电泳图谱确定HCV基因型。结果：69份HCV感染者血清标本有60份可以通过上述方法进行基因分型，其中主要基因型是1b,2a分别占36．24％和31．88％。结论：HCV－1b,2a仍然是重庆地区主要的基因型，但其所占比例不如中国其它地区高，说明HCV的分布呈地域依赖性。     

昆明地区HIV和HCV共感染者丙型肝炎病毒基因型特征

目的分析昆明地区人类免疫缺陷病（HIV）和丙型肝炎病毒（HCV）共感染者丙型肝炎病毒基因型分布。方法对204例经逆转录聚合酶链反应检测HCV病毒栽量,核酸为阳性的样品,利用反向点杂交技术进行HCV基因分型检测,其中60例经免疫印迹试验（WB）确认的HIV感染者,对共感染和非共感染组的丙型肝炎病毒基因型分布进行分析。结果204例HCV患者中3b型85例（HCV感染率最高,为41．6％）;1b型HCV感染在HIV／HCV共感染组中的感染率（30．0％）明显高于单纯HCV感染组感染率（20．0％）（P〈0．05）。而3b型HCV感染在HIV／HCV共感染组中的感染率（35．0％）明显低于单纯HCV感染组感染率（44．2％）（P〈0．05）。1b型,3a型和3b型HCV合并HIV感染的发生率较高;2a型和6a型HCV合并HIV感染的发生率较低。不同丙肝基因型HIV／HCV共感染者间感染途径以静脉药隐为主,其次是性接触。结论昆明地区共感染纽中的HCV流行的基因亚型有1b,3a,3b,6a共4种,1h为流行的主要基因亚型3a,3b和6a型均占相当比例,初步说明昆明地区HCV流行的基因亚型呈现多样性．     

青岛地区丙型肝炎基因分型的研究

目的 探讨青岛地区丙型肝炎基因型的分布状况,发现丙型肝炎病毒（HCV）流行优势株,分析丙型肝炎基因型与病人性别、感染途径、炎症活动度、病毒载量等的相关性。方法 应用RT-PCR方法,对46例青岛地区丙型肝炎病人的血清RNA提取物NS5B区和（或）CORE-E1区进行扩增,扩增片段进行基因测序,根据测序结果在PUBMED网站中获得基因分型结果,分析不同丙型肝炎基因型与病人性别、感染途径、肝病程度、HCV RNA含量及谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）水平的关系。结果 46例血清标本,HCV RNA均为阳性,44例可以分型,分型率为95.65%,其中基因1b型28例（63.64％）,2a型14例（31.81％）,3b型2例（4.55％）。丙型肝炎基因型的分布与病人性别、感染途径、肝病程度、HCV RNA含量及ALT、AST水平均无关（P〉0.05）。结论 青岛地区HCV流行株为基因 1b型和2a型,基因1b型为优势株,同时发现3b基因型。基因型与丙型肝炎的疾病进展程度及炎症活动度无关。     

江苏淮阴地区单采浆献血员丙型肝炎病毒分型及发病情况

目的：了解江苏淮阴地区单采浆献血员丙型肝炎病毒（HCV）感染后发病情况和病毒基因分型,方法：应用ELISA法及RT－nested PCR法检测67例单采浆献血员感染HCV后抗－HCV和HCV RNA,并用限制性片段长度多态性分析法（RFLP）进行病毒基因分型,结果：67例单采浆献血员,在感染HCV后,急性丙型肝炎发病率为17．9％（12／67）,最终发展成慢性丙型肝炎者49．3％（33／67）,HCV慢性持续感染68．8％（46／67）,HCV基因分型：1b/ Ⅱ型占95．5％（64／67）,2a／Ⅲ型1．5％（1／67）,1b/2a混合型3．0％（2／67）。结论：淮阴地区单采浆献血员HCV感染以1b/Ⅱ型为优势株,慢性化比例高。     

原发性肝细胞癌与HCV分型的关系

目的：了解原发性肝细胞癌（HCC）患者HCV基因型分布现状及其关系。方法：选择山西省肿瘤医院1996年间住院的HCVRNA阳性，临床上确诊的HCC患者血清标本13份，非肝癌癌症患者血清标本15份，1996年－1997年HCVRNA阳性的公共场所从业人员血清标本15份，用型特异性引物进行RT－PCR基因分型。结果：13例HCVRNA阳性的HCC患者，除1例未能分型外，其余12例均为HCV 1b型（100％）。15例非肝癌癌症患者，除13酌（86．67％）为1b型感染者外，其余均为2a型（13．33％）。15例从业人员中，不仅检出了12b型感染（86．67％），还检出2a型，1／2混合型各1例。所有标本中1b,2a型，1b/2a混合型的构成分别为38／42（90．48％），3／42（7．14％），1／42（2．38％），以1b型的比例最高，未检出1a,2b和3a型。结论：HCVRNA1b型与HCC的关系较为密切，同时也是山西地区HCV的感染优势株。     

西安和郑州地区丙型肝炎患者的HCV基因分型

目的 了解西安和郑州地区丙型肝炎病毒（HCV）感染的基因型，比较了两地基因型分布的差异。方法 采用限制性长度多态性分析（RFLP）法对采自西安地区的46份和郑州地区的40份HCVRNA阳性标本进行HCV基因型分型研究。结果 西安地区46份标本中，25份（54．3％）为1b型病毒，17份（37．0％）为2a型病毒，4份（8．7％）为1b/2a混合型病毒；郑州地区40份标本中，19份（47．5％）为1b型，13份（32．5％）为2a型，3份（7．5％）为1a型，4份（10．0％）为1b/2a混合型病毒，1份（2．5％）为1a/1b混合型病毒。结论 两地的优势株均为HCV1b型，其次为2a型，郑州地区有1a型菌株的发现。     

广西地区丙型肝炎病毒的基因分型及其临床意义

目的：探索广西地区丙型肝炎病毒（HCV）基因型的分布特征。方法：收集广西地区137例HCV—RNA阳性患者的血清样本,采用逆转录巢式PCR法扩增HCVNS5B区段,对PCR终产物纯化测序,测序结果与Genbank中的标准株全基因序列比对,并构建HCVNSSB区段系统进化树。结果：广西地区137例样本中,主要基因型为1b型（58．4％）,其次是6a型（12．4％）,3b型（10．2％）,la型（7．3％）,2a型（7．3％）,3a型（4．4％）。进一步分析表明,HCV基因型分布与性别无关（P〉0．05）,而与年龄有关（P〈0.05）,3型及6a型主要见于年轻患者。结论：构建HCVNSSB区段系统进化树能得到准确的HCV基因型;广西地区HCV基因型呈多样化,以1b型为主,6a型和3b型次之,且新发现6例3a型;基因分型为不同基因型的HCV感染者的治疗和疗效预测提供了理论依据。     

贵州地区丙型肝炎病毒基因分型的研究

目的：了解贵州地区丙型肝炎病毒（HCV ）基因型的分布特点及其与感染途径、性别、年龄因素的关系。方法在198份抗HCV抗体和HCV RNA均阳性的血清标本中,分别提取HCV RNA ,通过逆转录巢式PCR（RT nested-PCR）扩增C基因的羧基端至E1基因的氨基端长度为474 bp的片段,测定其核苷酸序列,与GenBank中已知的 HCV序列进行系谱分析,确定HCV基因亚型。结果198例患者中,HCV 1a型4例（2．0％）;1b型例71例（35．9％）;2a型9例（4．6％）;3a型29例（14．7％）,3b型47例（23．7％）,6a型37例（18．7％）,6d型1例（0．5％）。各基因型在男女性别分布比较,差异无统计学意义（χ2＝6．518, P＝0．885）;不同年龄人群 HCV基因型分布比较,差异有统计学意义（χ2＝49．056,P＝0．005）;不同感染途径人群 HCV基因型分布比较,差异有统计学意义（χ2＝99．245,P＝0．005）。结论贵州地区 HCV 基因型主要为1b型,其次为3b、6a、3a型,同时还存在1a、2a和6d等基因型。HCV基因型与其感染途径有关,基因亚型呈现多样性。     

保定市丙型肝炎病毒基因型分布特征及临床意义

目的 了解保定市丙型肝炎病毒（HCV）基因型分布特征及其与丙型肝炎病毒核糖核酸（HCV-RNA）载量、肝病程度的相关性,为其防治提供依据。方法 对2010年1月—2017年9月758例HCV-RNA阳性者进行HCV的基因型检测,分析其基因型与HCV-RNA含量和肝病程度的相关性。结果 758例HCV感染患者中1b型和2a型分别为50.79%（385/758）和36.68%（278/758）。HCV基因型的分布特征与性别、感染途径及种族差异均无统计学意义（P>0.05）。1b型患者ALT、AST、GGT及HCV-RNA水平均高于2a型和其他型患者,差异有统计学意义（P<0.05）。不同程度肝病患者的HCV基因型分布差异有统计学意义（P<0.05）,1b型丙肝肝硬化及肝癌比例高于其他基因型,差异有统计学意义（P<0.05）。1b型患者对长效干扰素加利巴韦林治疗的ETVR应答率（57.92％ vs 83.09％）和SVR应答率（24.68％ vs 60.79％）均明显低于2a型患者（P<0.05）。相关分析显示,1b型患者ALT与HCV-RNA呈正相关（r=0.685,P<0.01）。结论 保定市丙型肝炎病毒基因型流行株为1b型和2a型,其中1b型与丙肝肝硬化、肝癌的产生有一定的相关性。     

慢性丙型肝炎患者对NS3／4A蛋白酶抑制剂预存耐药的研究

目的对我国南方184例无抗病毒治疗史的慢性丙型肝炎患者进行NS3／4A蛋白酶抑制剂相关耐药位点检测。方法NS3／4A蛋白酶抑制剂相关的耐药位点分析采用自行设计型别特异性引物行巢式PCR．PCR产物经纯化后采用直接测序法鉴定。结果184例样本中有162例扩增成功,其中125例（77．16％）患者共检出266个变异位点。HCVlb型A156S变异率为18．33％,V170I为16．67％;HCV2a型V36L、Q80G、V170I变异率为100％,A156S为64．29％;HCV6a型Q80K变异率为95．45％,V170I为98．86％。结论未使用抗病毒药的慢性丙型肝炎患者对NS3／4A蛋白酶抑制剂也存在预存耐药,变异率因HCV基因型而不同。1b型发生变异较少,HCV2a型及6a型普遍发生变异。     

人C型利钠肽基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的：为开展C型利钠肽基因治疗，克隆人C型利钠肽基因并构建其真核表达载体。方法：通过RT-PCR从人胎盘组织中克隆人C型利钠肽基因全长编码区，将该DNA片段亚克隆至克隆载体pBS-T中，用SmaⅠ单酶切筛选出负向插入片段，用HindⅢ和BamHⅠ双酶切将目的DNA片段定向克隆至真核表达质粒pcDNA3．1（＋）中，然后用双酶切、PCR鉴定和DNA序列测定三重鉴定方法对重组质粒进行鉴定。结果：酶切、PCR及测序鉴定证实，人C型利钠肽基因全长编码区被准确插入至pcDNA3．1（＋）酶切位点HindⅢ和BamHⅠ之间，并且未发现有碱基突变或移位。结论：含人C型利钠肽基因真核表达质粒的成功构建并鉴定，为开展C型利钠肽基因治疗奠定了物质基础。     

广州地区丙型肝炎患者HCV基因分型研究

目的研究广州地区丙型肝炎患者HCV基因型分布的变化情况。方法收集207例HCV RAN阳性丙型肝炎患者血清,对其HCV Core区(C区)和NS5B区基因序列进行RT-nPCR扩增,两区扩增成功的PCR产物进行基因测序,测序结果分别与相应的参照株序列比对,构建系统进化树,两区基因分型结果一致者确定HCV基因亚型。结果 185例HCV C区和NS5B区都扩增成功,其中179例两区基因分型结果一致。共检出1、2、3、6型4种基因型和8种基因亚型,其中1b型占40.78%(73/179),6a型占27.37%(49/179),3b型占11.73%(21/179),3a型占8.94%(16/179),2a型占6.15%(11/179),1a型占3.91%(7/179),2b型占0.56%(1/179),6n型占0.56%(1/179)。1b株可分为A、B、C三大簇,A簇与中国广泛流行1b株接近、B簇与中国中部及南部地区流行1b株接近,6a株分为Ⅰ、Ⅱ两大簇,与献血人群及静脉吸毒人群中6a型株接近。结论广州地区丙型肝炎患者HCV基因型以1b、6a、3型为主,存在多种亚型;1b型株包含中国大部分地区的1b型株,6a、3型已取代2a型分别成为第二、三主要流行基因型;未发现6型变异株。     

丙型肝炎病毒基因NS5区酶切分型研究

目的：了解丙型肝炎病毒（HCV）感染的基因型及其与临床的关系。方法：用逆转录套式聚合酶链反应（RT－PCR）和限制性片断长度多态性（RFLP）分析的方法,对78例HCV感染患进行HCV NS5区基因分型。结果：HCV1b型感染71例（91％）,HCV2a型7例（9％）,未发现其它基因型;丙型肝炎患有无输血史,是否重叠HBV感染,其基因分型构成比均无显性差异（P＞0．05）;1b型HCV血清ALT异常（63．4％）明显多于2a型（14．3％）（P＜0．05）。结论：本组HCV感染的基因型多数为1b型,少数为2a型,1b型更易致肝细胞损伤,并可能与活动性肝病有关。     

丙型肝炎病毒2a型E2区基因cDNA的变异分析

目的 了解丙型肝炎病毒2a型基因组E2区序列的一级结构及变异特征，为进一步研究HCV包膜蛋白的生物学功能打下基础。方法 用逆转录套式多聚酶链反应(RT-nPR)法从1例NANB型肝炎患者血清中扩增出一条约1100bp的片段，以限制性内切酶EcoRI、HindⅢ双酶切后连入pUC19载体中，转化感受态细胞，经限制性内切酶长度多态性分析(RFLP)和PCR法证实为阳性克隆后，用全自动序列分析仪测序。结果 测得约1100bp的核苷酸序列，其核苷酸序列及其编码的氨基酸序列分别与HCV-1、HC-C2、HCV-BK、HC-J6、HC-J8相应序列作比较，显示分离株HCV在核苷酸水平上与以上分离株的同源性分别为63．1％、64．2％、64．1％、86．9％、69．3％，在氨基酸水平上的同源性分别为69．6％、70．7％、69．6％、86．2％、83．1％。结论 分离株(HCV-JF)与HC-J6同属2a型。