IL-18基因转染大肠癌细胞及对其肿瘤原性改变的研究

目的：建立转染人白细胞介素-18（hIL-18）基因的大肠癌细胞株,并研究IL-18基因转染后SW480细胞肿瘤原性的改变。方法：将携带hIL-18的质粒pcDNA3.1-hIL-18转导入人大肠癌细胞系SW480细胞中,通过药物G-418进行筛选,利用RT-PCR和ELISA法对IL-18的表达进行检测;通过裸鼠致瘤实验观察肿瘤原性的改变。结果：IL-18基因成功转导入SW480细胞中并能顺利表达;RT-PCR电泳结果显示IL-18基因在mRNA水平有表达;ELISA结果显示,106个转染细胞在24 h内分泌IL-18的含量是（145.71±4.42）pg;空载体转染的细胞未检测到hIL-18;生长曲线显示转染hIL-18基因后的细胞生长明显减慢;黏附曲线显示SW480-hIL-18组的黏附率在各个时相点均明显升高,而空载体组和空白对照组之间差异无统计学意义（P〈0.05）。裸鼠致瘤实验表明,接种SW480-hIL-18细胞的裸鼠肿瘤体积明显小于SW480组和SW480-pcDNA3.1组;抗瘤实验结果显示,放射灭活的SW480-pcDNA3.1细胞和SW480-hIL-18细胞免疫接种裸鼠后,再接种SW480细胞于裸鼠左侧背部皮下,SW480-hIL-18细胞免疫接种组肿瘤长出的时间比SW480-pcDNA3.1细胞免疫接种组明显延长,并且肿瘤的生长速度明显低于SW480细胞免疫接种组。结论：hIL-18基因能成功整合到SW480细胞基因组中,并且能在转染的肿瘤细胞中持续表达。hIL-18基因转导后的SW480细胞生长受到抑制,黏附能力增强h,IL-18基因转染降低了SW480细胞的肿瘤原性;hIL-18基因修饰的SW480细胞具有明显的抗肿瘤作用,为大肠癌基因工程肿瘤疫苗的研制提供了实验基础。     

RNA干扰survivin联合X线放射对大肠癌SW480细胞的影响

目的探讨RNA干扰技术和X线放射处理对大肠癌细胞survivin基因表达的影响。方法合成靶向人survivin基因的siRNA,转染大肠癌细胞SW480,联合或不联合放射治疗。检测转染前后及放射前后细胞survivinmRNA的表达;细胞抑制率及凋亡率,细胞周期分布,细胞survivin蛋白的表达。结果转染survivinsiRNA后的SW480细胞survivin mRNA及蛋白的表达明显低于对照组;SW480细胞转染survivinsiRNA 48 h后G2/M期细胞达(20.90±2.62)%,survivinsiRNA联合放射处理组细胞生长抑制率达59.8%,FCM显示survivinsiRNA联用放射处理组细胞凋亡率达(35.72±1.07)%。结论靶向survivin的siRNA能有效抑制大肠癌细胞SW480 survivin基因的表达,引起大肠癌细胞SW480 G2/M周期阻滞,抑制大肠癌细胞SW480的生长并能诱导其凋亡,并对大肠癌细胞SW480具有放射增敏作用。     

瘤体内直接注射白细胞介素-7基因抗小鼠乳腺肿瘤免疫效应的研究

目的 观察瘤体内直接注射白细胞介素(IL)-7基因抗小鼠乳腺肿瘤免疫效应.方法 构建IL-7真核表达质粒(pcDNA3-IL-7);建立乳腺癌TM40D细胞BALB/C小鼠移植模型;瘤体内直接注射pcDNA3-IL-7,观察小鼠肿瘤体积变化;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测外周血干扰素(IFN)-γ含量;流式细胞仪检测胞内IFN-γ的分泌量;局部肿瘤经治疗后行常规病理分析.结果 成功构建pcDNA3-IL-7;与对照磷酸盐缓冲液(PBS)组(115.2±11.8) ng/L、pcDNA3组(133.6±9.4) ng/L比较,pcDNA3 -IL-7注射组(242.3±10.1)ng/L外周血IFN-γ明显增高;pcDNA3-IL-7明显抑制肿瘤生长(P＜0.05);流式细胞仪检测显示pcDNA3-IL-7显著促进CD4+T细胞、CD8+T细胞内IFN-γ的分泌量;常规病理显示pcDNA3 -IL-7注射组肿瘤组织大量坏死,炎性细胞和大量淋巴细胞浸润.结论 瘤体内直接注射pcDNA3-IL-7明显抑制小鼠乳腺肿瘤生长,显著促进IFN-γ分泌,增强了小鼠机体抗乳腺肿瘤的免疫效应.     

CDX2基因干扰对人结肠癌细胞在裸鼠体内生长的影响

目的:探讨CDX2基因表达对结肠癌细胞生长的影响。方法:将体外转染CDX2-shRNA慢病毒、空慢病毒载体及无转染的人结肠癌细胞系SW480和HT29接种到裸鼠皮下,制备皮下移植瘤模型,观察各组移植瘤的生长情况,28d后处死裸鼠,剥取移植瘤称重,并分别用免疫组化、Westernblot检测各组移植瘤组织Ki-67与CDX2的表达。结果:与各自空白对照组(无转染的SW480或HT29细胞移植)比较,两个干扰组(转染CDX2-shRNA慢病毒的SW480或HT29细胞移植)移植瘤生长速度均明显加快、移植瘤质量明显增加(SW480:679.11mgvs.379.36mg;HT29:715.78mgvs.427.07mg),瘤组织Ki-67蛋白表达水平明显升高、CDX2蛋白表达明显下调(均P0.05)。两个阴性对照组(转染空慢病毒载体的SW480或HT29细胞移植)的各指标与各自空白对照组间均无明显差异(均P0.05)。结论:抑制CDX2基因的表达能促进人结肠癌细胞的裸鼠体内的生长,故CDX2可能是一种重要的抑癌基因。     

Dpc4基因转染胰腺癌细胞株对裸鼠胰腺癌移植瘤生长的影响

目的 探讨Dpc4基因转染胰腺癌细胞株HS766T对裸鼠移植瘤生长的影响.方法 按pcDNA3,1-Dpc4是否转染人胰腺癌细胞株HS766T将细胞分为pcDNA3.1-Dpc4转染组、pcDNA3.1空载体组和未转染组,RT-PCR鉴定目的基因的表达;将3组细胞分别接种于裸鼠,比较Dpc4基因对裸鼠胰腺癌移植瘤的生长抑制作用,Western blot检测移植瘤中Caspase-3、Bcl-2和Bax的表达.数据以(x)±s表示,组间比较采用方差分析,两两比较采用SNK-q检验.结果 经RT-PCR鉴定,Dpc4基因在pcDNA3.1 -Dpc4中稳定表达.与pcDNA3.1空载体组和未转染组比较,pcDNA3.1-Dpc4转染组胰腺癌细胞HS766T肿瘤体积更小(F=19.43,P＜0.05);pcDNA3,1-Dpc4转染组与pcDNA3.1空载体组的抑瘤率分别为32.3％和4.0％.与pcDNA3.1空载体组比较,pcDNA3.1 -Dpc4转染组Caspase-3和Bax蛋白表达显著升高,而Bcl-2蛋白表达显著降低(F=14.24,13.83,19.50,P＜0.05).结论 Dpc4基因转染可抑制裸鼠胰腺癌移植瘤生长.影响肿瘤细胞的凋亡可能是Dpc4基因抗肿瘤作用之一.     

WTp53基因联合TK/GCV、CD/5-Fc系统治疗人结肠癌的实验研究

目的：观察WTp53基因联合TK／GCV、CD／5-Fc系统对人结肠癌的治疗效果，并探讨其作用机理。方法：采用培养细胞移植法，将人结肠癌细胞系SW480接种于裸鼠背部皮下，建立裸鼠人结肠癌移植瘤模型，将32只裸鼠随机分为4组：对照组、WTp53组、TK、CD组、WTp53与TK、CD组，每组8只，WTp53采用脂质体介导，TK、CD采用逆转录病毒介导。将WTp53、TK、CD注入移植瘤体内，瘤内注射TK、CD的裸鼠同时腹腔注射GCV、5-Fc治疗，观察各组小鼠的生存状况及肿瘤体积、瘤重、肿瘤生长抑制率、常规病理、生存期等指标，比较观察各治疗组的治疗效果及对荷瘤裸鼠存活的影响。结果：各治疗组裸鼠人结肠癌移植瘤的生长均受到显著抑制，裸鼠存活期显著延长，联合基因治疗组效果更好，WTp53、与TK、CD有交互协同作用。结论：WTp53、TK／GCV、CD／5-Fc对人结肠癌SW480细胞有明显抑制作用，WTp53基因联合TK／GCV、CD／5-Fc系统效果更强。     

癌胚抗原启动子正调控白细胞介素-15表达质粒载体的构建及其在肿瘤细胞中的靶向表达

目的 构建癌胚抗原(CEA)启动子正调控人白细胞介素-15(IL-15)真核表达质粒载体,观察其在肿瘤细胞内的靶向性表达.方法 基因克隆技术构建巨细胞病毒(CMV)启动子正调控质粒pHi2-IL-15-CMV-TAT和CEA启动子正调控质粒pHi2-IL-15-CEA-TAT;再以IL-2信号肽(SP)置换IL-15SP构建质粒pHi2-IL-2SP-IL-15-CMV-TAT和pHi2-IL-2SP-IL-15-CEA-TAT;阳离子脂质体介导法体外转染CEA阳性结肠癌SW480细胞和CEA阴性乳腺癌MCF-7细胞,酶联免疫吸附方法(ELISA)检测转染后48h细胞培养上清液中IL-15表达.结果 质粒均成功构建.ELISA检测结果:(1)以IL-2SP置换IL-15SP可提高转染细胞的IL-15表达4.8～5.9倍(P＜0.01);(2)转染SW480细胞后,CEA启动子正调控的两质粒(pHi2-IL-15-CEA-TAT和pHi2-IL-2SP-IL-15-CEA-TAT)与相对应的CMV启动子正调控质粒(pHi2-IL-15-CMV-TAT和pHi2-IL-2SP-IL-15-CMV-TAT)之间的IL-15表达无统计学意义(P＞0.05),其效应等同于CMV启动子正调控质粒;(3)转染MCF-7细胞后,CEA启动子正调控的两质粒IL-15表达显著低于CMV启动子正调控质粒(P＜0.01).结论 CEA启动子正调控IL-15质粒,尤其是质粒pHi2-IL-2SP-IL-15-CEA-TAT在CEA阳性细胞中高表达IL-15,CEA阴性细胞中低表达IL-15,实现了IL-15基因高效、靶向性表达.     

TK／GCV、CD／5-Fc双自杀基因系统治疗结肠癌的实验研究

目的观察胸苷激酶／丙氧鸟苷（TK／GCV）、胞嘧啶脱氨酶／5-氟胞嘧啶（CD／5-Fc）双自杀基因系统对结肠癌的治疗效果，并结合研究结果进行作用机理的分析。方法采用培养细胞移植法，将人结肠癌细胞系SW480接种于裸鼠背部皮下，建立裸鼠人结肠癌移植瘤模型。将32只裸鼠随机分为4组：空白对照组，TK／GCV治疗组，CD／5-Fc治疗组，TK／GCV＋CD／5-Fc联合治疗组，每组8只。TK／GCV＋CD／5-Fc采用逆转录病毒介导，采用瘤体内直接注射法，同时腹腔注射GCV、5-Fc治疗，观察各组小鼠的生存状况及肿瘤体积、瘤重、肿瘤生长抑制率、常规病理、生存期等指标，比较观察各治疗组的治疗效果及对荷瘤裸鼠存活的影响。结果各治疗组裸鼠人结肠癌移植瘤的生长均受到显著抑制，治疗后各组体积数增加（P〈0．05），治疗组裸鼠存活期显著延长，TK／GCV＋CD／5-Fc联合治疗组效果最好，疗效q值=1．675〉1、15，即TK／GCV、CD／5-Fc有交互协同作用。结论TK／GCV与CD／5-Fc对人结肠癌SW480细胞有明显抑制作用，TK／GCV、CD／5-Fc双自杀基因系统效果更强。     

鞘内转染白细胞介素-10基因对神经病理性疼痛大鼠的镇痛作用

目的 探讨鞘内转染白细胞介素-10（IL-10）基因对神经病理性疼痛大鼠的镇痛作用。方法雌性SD大鼠，体重230～250g，坐骨神经压榨性损伤（CCI）后3d出现热痛觉过敏大鼠随机分为基因治疗组（pcDNA3．1-IL-10组）、真核表达载体组（pcDNA3．1组）、生理盐水组（NS组）和CCI组（n=12），前3组分别经蛛网膜下腔注射pcDNA3．1-IL-10/脂质体复合物、pcDNA3．1/脂质体复合物或生理盐水30μl，另取12只雌性SD大鼠为假手术组（Sham组），仅暴露右侧坐骨神经而不予压榨，亦不行蛛网膜下腔注射。转染后2、7、7、10、14d热辐射法测定大鼠热痛阈；RT-PCR检测转染后3d坐骨神经、腰段脊髓、海马组织IL-10mRNA的表达，ELISA法检测上述组织、血浆及转染后1-10d脑脊液中IL-10水平；细胞毒性法检测转染后14d坐骨神经、腰段脊髓、海马和血浆TNF-α水平。结果转染后2～14dCCI组热痛阈长于Sham组，而pcDNA3．1-IL-10能逆转热痛阈延长；pcDNA3．1-IL-10组转染后3d坐骨神经、腰段脊髓、海马等组织可检测到IL-10mRNA，且IL-10含量升高，脑脊液IL-10浓度在转染后1～7d升高，转染后14d坐骨神经、腰段脊髓、海马等TNF-α含量降低（P〈0．05）。结论鞘内转染IL-10能通过抑制炎症反应在一定程度上减轻大鼠神经病理性疼痛。     

基因转染表达小鼠白细胞介素-33及其抗肿瘤机制研究

目的 建立分泌小鼠白细胞介素-33(IL-33)的基因转染细胞株,分析其特性并探讨IL-33在肿瘤微环境中的抗肿瘤作用.方法 构建含有人CD8信号肽基因序列的IL-33融合基因,经BamH I和EcoR I双酶切后插入pCDEF3真核表达载体构建成为pCDEF3-IL-33重组子,采用脂质体法以重组质粒pCDEF3-IL-33和空质粒pCDEF3分别转染小鼠乳腺癌细胞株4T1,经G418长期加压筛选后,使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测基因转染细胞株培养上清中小鼠IL-33的分泌和IL-33体外对效应性CD8+T细胞干扰素(IFN)-γ的分泌;活细胞计数和羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)掺入法检测基因转染细胞生长与增殖的均一性.结果 基因转染细胞4T1-pCDEF3-IL-33能稳定分泌小鼠IL-33分子,其培养上清中的表达量为28 μg/L;与4T1及转染了空质粒pCDEF3的4T1-vec比较,其生长和增殖差异无统计学意义(P＞0.05);体外刺激试验表明,IL-33能显著地促进效应性CD8+T细胞分泌IFN-γ,对照组为125 μg/L,实验组为300μg/L,差异有统计学意义(P＜0.05);体内实验研究表明,分泌于肿瘤微环境中的IL-33能显著抑制肿瘤的生长和转移,第30天时肿瘤直径对照组为(18.0±2.5) mm,实验组为(6.5±0.9)mm,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 建立了稳定分泌小鼠IL-33的基因转染细胞株,微环境中的IL-33对肿瘤具有显著的抑制作用.