短发夹核糖核酸沉默EZH2基因对人脑胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨短发夹核糖核酸（sh RNA）对高表达EZH2的人胶质瘤细胞株U251增殖和侵袭的影响。方法构建针对EZH2的sh RNA重组质粒,采用电穿孔的方法转染至U251细胞中,分为对照组、control-sh RNAGFP空载体转染组和EZH2-sh RNA重组质粒转染组。分别通过逆转录-聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测各组细胞EZH2基因和蛋白的表达,以噻唑蓝法测各组细胞的增殖活性,蛋白质印迹法检测各组细胞的EZH2蛋白表达水平;Transwell小室检测细胞侵袭力。结果对照组、control-sh RNA-GFP空载体转染组、EZH2-sh RNA重组质粒转染组U251细胞EZH2基因的表达分别为1.13±0.05、1.15±0.05、0.19±0.02,U251细胞EZH2蛋白的表达分别为1.03±0.03、0.97±0.06、0.20±0.02,转染后24 h细胞增殖能力分别为100.00%±9.31%、100.03%±9.35%、60.13%±3.15%,转染后48 h细胞增殖能力分别为100.00%±9.13%、99.58%±9.27%、53.01%±3.14%,重组质粒转染组较另两组均明显下降,差异有统计学意义（P〈0.05）;重组质粒转染组转染48 h后细胞磷酸化蛋白激酶B和磷酸化叉头框蛋白O1水平降低、细胞周期蛋白D1表达减少、p27蛋白表达增多,差异有统计学意义（P〈0.05）。Transwell小室侵袭实验显示侵袭至Transwell小室滤膜下表面的细胞数在EZH2-sh RNA重组质粒转染组[（46.00±2.82）个]低于对照组[（60.67±5.71）个]和control-sh RNA-GFP空载体转染组[（61.00±2.48）个],差异有统计学意义（P〈0.01）。结论 EZH2基因沉默能有效抑制人胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力,为深入研究EZH2在胶质瘤中作用提供了研究基础。     

新靶点细胞周期蛋白E干扰RNA对人脑胶质瘤细胞增殖及侵袭的影响

目的探讨新靶点细胞周期蛋白E干扰RNA对人脑胶质瘤细胞的增殖及侵袭转移能力的影响。方法构建4个新靶点的Cyclin E干扰RNA的真核表达载体作为实验组（1至4组）,同时设立U251人脑胶质瘤细胞为对照组（U251组）。对实验组用双酶切和碱基序列测定的方法鉴定载体构建成功与否,转染载体到胶质瘤U251细胞株,通过RT-PCR的结果检测转染后Cyclin E mRNA表达量。对实验组及U251组用M1rr法检测细胞增殖能力的变化,用Transwell小室法检测侵袭能力的变化。结果分别构建了4个新靶点的Cyclin E干扰RNA真核表达载体,CyclinEmRNA表达明显受到抑制（P均〈0．05）,其中实验1组细胞与U251组相比增殖及侵袭能力减弱（P均〈0．05）。结论新靶点Cyclin E干扰RNA使Cyclin E表达下调,从而导致人脑胶质瘤细胞增殖和侵袭能力减弱。     

MicroRNA-664对人脑胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的探究microRNA-664(miR-664)对人脑胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法采用Lipofectamine 2000脂质体法将miR-664模拟剂(miR-664 mimics)、miR-664抑制剂(miR-664 inhibitor)转染至人脑胶质瘤细胞U251中,并设置相应对照组(miR-NC、anti-NC);采用qRT-PCR检测各组细胞中miR-664的表达,MTT法检测各组细胞增殖情况,划痕实验及Tanswell小室法检测各组细胞迁移、侵袭能力,Western blotting法检测各组细胞中核蛋白(Ki67)、增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及MMP-9的表达。结果与miR-NC相比,转染miR-664 mimics后明显上调U251细胞中miR-664的表达,并促进U251细胞增殖、迁移和侵袭能力,并显著上调细胞中Ki67、PCNA、MMP-2及MMP-9的表达(P 0. 05);与anti-NC相比,转染miR-664 inhibitor后明显下调U251细胞中miR-664的表达,并抑制U251细胞增殖、迁移和侵袭能力,并显著下调细胞中Ki67、PCNA、MMP-2及MMP-9的表达(P 0. 05)。结论 miR-664可能通过上调Ki67、PCNA、MMP-2及MMP-9的表达,促进人脑胶质瘤细胞U251细胞的增殖、迁移和侵袭,可作为潜在的肿瘤标志物。     

NOB1影响胶质瘤细胞增殖、凋亡的实验研究

目的 利用RNA干扰（RNAi）在人胶质瘤U251和U87-MG细胞中沉默NOB1基因的表达,探讨NOB1对恶性胶质瘤细胞增殖以及凋亡的影响.方法 构建NOB1基因的短发卡（shRNA）慢病毒表达载体,包装成病毒颗粒并感染人胶质瘤U251和U87-MG细胞,采用实时定量聚合酶链反应检测NOB1在恶性胶质瘤细胞系中的表达.采用甲基噻唑基四唑（MTT）比色法和克隆形成实验检测细胞增殖和克隆形成能力情况;同时利用PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡情况,观察NOB1基因对U251和U87-MG细胞增殖、凋亡的影响.结果 NOB1基因在人胶质瘤U251、U87-MG细胞系中均明显高表达.NOB1-shRNA慢病毒能有效感染胶质瘤细胞,实验结果显示感染后U251和U87-MG细胞的增殖能力明显下降;U251克隆形成能力明显受到抑制;细胞周期在G0/G1停滞,而且细胞出现显著性凋亡;上述差异均具有统计学意义（P＜0.05）.结论 NOB1在人胶质瘤U251和U87-MG细胞中高表达;降低NOB1基因的表达,可以显著降低胶质瘤细胞的增殖,并促进胶质瘤细胞凋亡;NOB1基因在体外对胶质瘤细胞的发生发展可能具有癌基因的调节作用.     

CM通路AEA对人胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响

目的观察在神经酰胺(CM)通路中,大麻受体激动剂花生四烯酸乙醇胺(AEA)抑制人胶质瘤U251细胞增殖及在诱导细胞凋亡中的作用。方法采用噻唑蓝(MTT)法,分别测定不同浓度的CM(5~20μmol/L)和烟曲霉毒素(FB1)(10μmol/L)预处理24h后对AEA(1~10μmol/L)抑制人胶质瘤U251细胞增殖作用的影响;流式细胞仪Annexin-V/PI双染色法定量分析FB1(10μmol/L)预处理24h后对AEA(10μmol/L)促细胞早期凋亡作用的影响。结果不同浓度的AEA对人胶质瘤U251细胞增殖的抑制作用不同,且与CM具有协同作用;10μmol/L FB1预处理24h后可显著对抗AEA对人胶质瘤U251细胞增殖的抑制作用;AEA(10μmol/L)可诱导人胶质瘤U251细胞发生早期凋亡,而FB1(10μmol/L)预处理24h后凋亡发生率明显下降。结论 AEA可通过CM从头合成通路,与CM呈浓度依赖性协同,从而抑制人胶质瘤U251细胞的增殖并诱导其早期凋亡。     

蛋白酶体抑制剂对胶质瘤U251细胞增殖的抑制作用

细胞内存在两种蛋白降解的途径,一种是通过自噬途径降解大分子的蛋白,另一种是通过泛素-蛋白酶体途径降解,泛素-蛋白酶体（ubiquitin-proteasome system,UPS）途径是细胞内非溶酶体途径蛋白质降解通路,不仅降解变性、异常或起短暂作用的蛋白质,     

MiR-195对人脑胶质瘤细胞 U251和 SHG-44增殖的抑制作用

目的探讨 miR-195过表达对体外培养的人脑胶质瘤细胞U251和 SHG-44增殖的影响。方法通过脂质体将miR-195 mimics转染至U251和SHG-44细胞,同时设立空白对照组和阴性对照组,实时荧光定量PCR检测转染前后miR-195的表达水平;用CCK-8法评价细胞的增殖能力;流式细胞仪分析细胞周期。结果胶质瘤细胞转染miR-195 mimics后,发现U251细胞和SHG-44细胞中miR-195的表达分别为5.93＆#177;0.43和6.43＆#177;0.48,较空白对照组和阴性对照组均增高约6倍左右。与空白对照组和阴性对照组相比,转染miR-195 mimics后的胶质瘤细胞的增殖能力明显受到抑制,细胞周期阻滞于G0/G1期,S期细胞减少。结论过表达miR-195可以阻滞胶质瘤细胞周期进展,从而抑制其增殖,为胶质瘤的基因治疗提供新的策略。     

RNA干扰pygo2基因对人脑胶质母细胞瘤U251生物学行为及wnt通路的影响

目的研究pygo2在胶质瘤细胞系U251中的表达、功能及作用机制。方法利用反义pygo2转染U251,下调pygo2的表达,应用流式细胞术和MTT法,评价细胞生长、增殖、凋亡及周期变化;细胞克隆形成试验和transwell侵袭试验分析细胞的克隆形成能力和侵袭能力,采用Western印迹法检测通路蛋白的表达变化。结果转染反义pygo2后,pygo2表达降低,MTT结果显示转染反义pygo2后细胞生长受到抑制且凋亡细胞增加;流式细胞术提示G1期到S期阻滞,细胞克隆形成能力下降,侵袭能力均受到抑制,Western结果表明wnt通路相关蛋白c-myc和Cyclin D1在抑制pygo2表达后下降。结论 pygo2可促进人脑胶质瘤细胞生长、增殖,可能是胶质瘤治疗的有效靶点,其发挥作用可能与wnt通路密切相关。     

miR-9对人脑胶质瘤LN229细胞增殖的影响

目的探讨miR-9对人脑胶质瘤LN229细胞增殖的影响及可能机制。方法对数生长期人脑胶质瘤LN229细胞,随机分为miR-9抑制剂组(转染30 mg/L miR-9小干扰RNA质粒5μL)、空白对照组(转染空载质粒)、乳酸脱氢酶A(labeling recombinant lactate dehydrogenase A,LDHA)激动剂组(转染30 mg/L miR-9小干扰RNA质粒5μL及4 mg/L LDHA激动剂5μL)。转染后培养48 h,3组采用CCK-8法检测细胞增殖率;实时荧光定量PCR法检测miR-9 mRNA、LDHA mRNA相对表达量;氧化酶法测定葡萄糖消耗量;比色测定法测定乳糖产量。结果转染后培养48 h,miR-9抑制剂组、空白对照组、LDHA激动剂组细胞增殖率吸光度值(0.60±0.01、0.90±0.02、1.15±0.05)依次增高(P<0.05);miR-9 mRNA相对表达量在miR-9抑制剂组(0.52±0.01)、LDHA激动剂组(0.53±0.01)低于空白对照组(1.67±0.01)(P<0.05),miR-9抑制剂组与LDHA激动剂组比较差异无统计学意义(P>0.05);miR-9抑制剂组、空白对照组、LDHA激动剂组LDHA mRNA相对表达量(0.64±0.01、0.87±0.01、2.77±0.01)、葡萄糖消耗量[(0.02±0.01)、(0.36±0.01)、(0.77±0.01)nmol/L]、乳糖产量[(43.02±4.01)、(73.02±3.11)、(1562.00±5.44)nmol/L]均依次增高(P<0.05)。结论miR-9通过促进LDHA表达,增强肿瘤细胞有氧糖酵解,促进人脑胶质瘤LN229细胞增殖。     

抑制IGFBP-2基因的表达对U251细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨 RNA干扰技术沉默胰岛素生长因子结合蛋白2（IGFBP-2）对胶质瘤细胞株 U251增殖、凋亡的影响,为胶质瘤的基因治疗提供一个可选择的靶点和方法。方法构建靶向 IGFBP-2基因的 RNAi表达载体;采用脂质体法将 siRNA转染U251细胞,设非特异的 siRNA阴性对照组和未转染 siRNA的阴性对照组;采用RT-PCR法半定量检测 siRNA对 IGFBP-2基因表达的抑制作用;用 MTT法测定 U251细胞增殖变化;流式细胞术检测 siRNA诱导细胞凋亡作用。结果构建的 RNAi表达载体抑制了 IGFBP-2基因的表达（P＜0．01）;RNA干扰沉默 IGFBP-2基因可抑制 U251细胞增殖,促进细胞凋亡。结论在细胞水平上,构建的靶向 IGFBP-2的 siRNA可明显抑制 IG-FBP-2基因的表达,导致胶质瘤细胞凋亡率明显上升（P＜0．01）,为进一步利用 RNA干扰进行胶质瘤的基因治疗研究奠定基础。     

体外实验观察小分子干扰RNA对胶质瘤U251细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的:血管内皮生长因子能促进血管内皮细胞增生和血管形成,而RNA干扰技术可高效特异地导致转录后基因沉默现象。实验针对人血管内皮生长因子基因化学合成小分子干扰RNA,观察其对胶质瘤U251细胞的体外干扰效应。方法:实验于2006-09/2007-02在中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室完成。①实验材料:人类U251胶质母细胞瘤细胞株由上海市肿瘤研究所朱景德教授惠赠。非特异性小分子干扰RNA,绿色荧光标记的FAMnegativecontrolsiRNA(上海吉玛公司)。②实验方法:选择基因序列号为NM0033761的血管内皮生长因子基因cDNA序列上的3个位点设计3条不同序列的小分子干扰RNA,并应用BLAST技术排除其他同源基因。采用脂质体法转染U251细胞,以200nmol/L进行转染,以转染非特异性小分子干扰RNA作为阴性对照组,以未加入小分子干扰RNA作为空白对照组。48h后RT-PCR筛选最佳小分子干扰RNA,将抑制率最高的小分子干扰RNA再分别按50,100,200,300nmol/L进行转染。③实验评估:荧光显微镜及流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR法半定量检测浓度梯度下小分子干扰RNA对U251细胞血管内皮生长因子mRNA表达的抑制效果。结果:①荧光显微镜及流式细胞术检测转染效率:镜下可见胞质内的绿色荧光,同一视野下细胞核呈蓝染,转染效率达95%以上。②RT-PCR检测血管内皮生长因子mRNA的表达水平:不同序列的小分子干扰RNA以200nmol/L转染细胞后血管内皮生长因子mRNA的表达水平均有所下调,以小分子干扰RNA1转染组最为明显(P<0.01),抑制率大于70%,选为最佳特异性小分子干扰RNA。U251细胞转染50,100,200,300nmol/L的小分子干扰RNA148h后,随着转染浓度的升高,小分子干扰RNA1的抑制效果逐渐增强,各浓度转染组血管内皮生长因子mRNA的表达水平可下调16%～73%。结论:以血管内皮生长因子为靶基因、化学修饰合成的特异性小分子干扰RNA,在体外可有效抑制目的基因mRNA的表达。     

lncRNA HCG11-201对肾癌细胞增殖和侵袭的影响

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)HCG11-201在肾癌组织中的表达及影响癌细胞增殖和侵袭的分子机制.方法 生物信息学方法预测HCG11-201表达与肾癌患者预后的相关性.实时荧光定量PCR(qPCR)检测肾癌组织和癌旁正常组织 、肾癌细胞系和正常肾小管上皮细胞中HCG11-201的表达,选择表达最少的肾癌细...     

C-myb、PKCa在脑胶质瘤侵袭作用中的相关性研究

目的研究脑胶质瘤侵袭性生长过程中,C-myb的作用及其与蛋白激酶Ca之间的相互关系.方法Wistar大鼠35只,随机分为实验组(30只)和对照组(5只).实验组每只大鼠于右侧大脑皮质运动区种植C6胶质瘤细胞10μl(3×107个/μl),对照组则注入10μl生理盐水,于术后10天将大鼠全部处死取材,进行大体观察、HE染色及免疫组织化学检查,并将实验组侵袭性量化为0～Ⅳ级,分别检查对照组和实验组肿瘤侵袭性中,各组C-myb、PKCa的表达,并对其进行评分.结果1.实验组大鼠均可见肿瘤生长,其中28只表现为侵袭0～Ⅳ级;2.C-myb表达越强,脑胶质瘤侵袭的级别越高,呈正相关(P＜0.01);3.肿瘤区C-myb与PKCa表达在肿瘤各级中均为高度一致;4.在肿瘤0～Ⅳ级侵袭中,瘤周区及边缘区的C-myb、PKCa二者表达评分密切相关(P＜0.05);5.对照组中,C-myb、PKCa均为阴性表达.结论本组资料表明,C-myb是脑胶质瘤侵袭性的重要癌其因,脑胶质瘤的侵袭性生长是临床术后复发的根本原因.     

CDK2干扰RNA对人脑胶质瘤细胞质蛋白质组的影响

目的构建人CDK2的干扰RNA真核表达载体,稳定转染人脑胶质细胞瘤SHG44细胞,经RT-PCR检测后,运用双向电泳-图像分析-质谱技术研究人脑胶质瘤细胞质蛋白质组的改变,探讨CDK2在SHG44细胞中的作用,为人脑胶质瘤的发生、发展的研究及诊断与治疗提供有价值的资料。方法 (1)构建CDK2干扰RNA真核表达载体并用双酶切和测序鉴定。(2)G418筛选阳性转染细胞克隆,制备稳定转染的SHG44细胞系。(3)通过RT-PCR比较转染后CDK2mRNA的表达量。(4)双向凝胶电泳-质谱技术-数据库搜索,比较转染前后细胞质蛋白质组的变化。结果 (1)成功构建了CDK2干扰RNA真核表达载体PGPU6/GFP/Neo-CDK2-1。(2)获得稳定转染细胞系,命名为PCDK2-1-SHG44细胞。(3)通过双向电泳-图像分析-质谱技术得到细胞质未见表达的蛋白质5个,包括醛缩酶A、波形蛋白等蛋白质。结论成功建立稳定转染CDK2干扰RNA的SHG44细胞系。质谱鉴定得到的这些差异表达的蛋白质涉及细胞的增殖、细胞凋亡的信号转导调节、正常细胞的恶性转化及发育调控以及肿瘤的发生、发展和耐药性形成。     

锌指基因1对脑胶质瘤细胞增殖及凋亡能力的影响

目的:研究过锌指基因1(JAZF1)对脑胶质瘤细胞增殖、凋亡能的影响及其信号通路。方法:体外培养脑胶质瘤细胞株,分为对照组、空载组和过表达组;分别于无血清的RPMI 1640培养基中,加入AdvJAZF1-GFP或空载体Adv-GFP,对照组不予转染腺病毒。MTT法检测细胞活力,使用流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot法检测糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、β-连环蛋白(β-catenin)、腺瘤性结肠息肉病相关基因(APC)、Bax和Bcl-2蛋白表达量。结果:对照组和空载组细胞活力和凋亡率差异无统计学意义(P>0.05),过表达组细胞活力低于其他2组、细胞的凋亡率高于其他2组(均P<0.05);对照组和空载组β-actenin、GSK-3β、APC、Bax和Bcl-2蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05),过表达组β-actenin、GSK-3β、APC和Bax蛋白表达低于其他2组,Bcl-2蛋白表达高于其他2组(P<0.05)。结论:过表达JAZF1可能可通过作用于Wnt/β-catenin信号通路,调控β-catenin、GSK-3β、B...     

电离辐射对人脑胶质瘤细胞中Ataxin-1基因表达的影响

目的探讨电离辐射对人脑胶质瘤细胞株U251、U87中Ataxin-1基因表达的影响。方法采用Western blot实验检测脑胶质瘤细胞株中A172、U251、U373、U87中Ataxin-1表达水平的差异,选取U251、U87为研究对象,采用RT-PCR和Western blot法检测各组Ataxin-1m RNA及蛋白表达水平的变化。结果 4种脑胶质瘤细胞中Ataxin-1的表达水平存在明显差异;U251、U87在不同剂量的X射线照射后24 h,其Ataxin-1蛋白及m RNA表达量与对照组相比均明显增加(P<0.05);不同时间检测提示,在X射线照射后4 h,Ataxin-1蛋白及m RNA的表达量即开始上升,并持续到照射后48 h(P<0.05)。结论Ataxin-1在不同脑胶质瘤细胞中表达水平存在明显差异;Ataxin-1基因有可能作为临床脑胶质瘤放疗靶基因,对临床放疗疗效的判断具有一定的应用潜力。     

JAG2基因沉默影响大肠癌细胞株侵袭能力的研究

目的 Notch信号在肠上皮细胞种系分化和引发肠腺瘤和肠癌中起着关键的作用。本文试图探讨Notch信号的配体JAG2在大肠癌中的作用。方法 Real-Time PCR和Western blot分别检测JAG2特异性si RNA对JAG2 m RNA及蛋白表达的抑制率,细胞增殖实验和细胞侵袭实验观察si RNA对细胞增殖及侵袭能力的影响,人类肿瘤转移RT2 Profiler?PCR Array用于筛选JAG2下游靶基因,并应用特异性抑制化合物抑制靶蛋白活性。结果特异性si RNA对JAG2 m RNA及蛋白的表达具有抑制作用(P<0.05),对细胞增殖无明显影响(P>0.05),对细胞侵袭能力明显抑制(P<0.05),而组织蛋白K(CTSK)活性降低可能参与了这一过程。结论 JAG2基因可能对大肠癌细胞的侵袭转移能力起促进作用。     

大蒜素抑制人脑胶质瘤U251细胞生长的实验研究

目的探讨大蒜素对体外培养的人脑胶质瘤U251细胞增殖及诱导凋亡的作用。方法用不同浓度大蒜素作用于体外培养的U251细胞12h、24h及48h,CCK-8法检测细胞存活率;流式细胞术(FCM)检测细胞周期及细胞凋亡。结果大蒜素能明显抑制细胞生长,呈量-效和时-效关系(P<0.001);FCM检测表明,细胞主要被阻滞在G0/G1期;大蒜素诱导细胞凋亡率较对照组明显增加(P<0.001),有浓度依赖性。结论大蒜素能抑制U251细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

circNRIP1对宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响研究

目的 探讨环状RNA核受体相互作用蛋白1(circNRIP1)在宫颈癌组织中的表达,并初步考察其对宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。方法 采用荧光定量PCR(qPCR)检测circNRIP1在宫颈癌组织和癌旁组织中的表达水平,并通过细胞增殖实验(MTS法)、细胞划痕实验和Transwell Matrigel实验分别考察circNRIP1对宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。结果 与癌旁组织相比,circNRIP1在宫颈癌组织中的表达显著升高(P<0.001);circNRIP1在HeLa细胞系中表达水平最低,在SiHa细胞系中表达水平最高,与其他细胞系circNRIP1表达水平比较差异均有统计学意义(P<0.001)。在SiHa细胞系中,与NC组比较,shRNA1、shRNA2、shRNA3慢病毒均可显著降低circNRIP1的表达水平,其中shRNA2的敲低能力最高,在HeLa细胞系中,与OV-NC组比较,circNRIP1在OV-cNRIP1组的表达水平更高(P<0.01)。MTS实验结果显示,在HeLa细胞系中,与OV-NC组比较,OV-cNRIP1组的H...