健康人外周血树突状细胞诱导培养及鉴定

[目的]从健康人外周血中分离出单个核细胞(PBMC),经体外诱导培养获取树突状细胞(DC)并鉴定其表型.[方法]应用GM-CSF、IL-4、TNF-α等细胞因子自外周血单个核细胞诱导扩增,培养出DC,动态观察细胞形态,流式细胞仪检测其表面标志,采用混合淋巴细胞培养法检测其刺激同种异体淋巴细胞增殖能力.[结果]经诱导培养出具有典型特征的DC,高表达CD86、CD80,DC特征性标志CD1a平均为49.28%,在体外能诱导强烈的同种异体混合淋巴细胞增殖反应.[结论]该方法能可靠地诱导培养出DC,为DC的进一步研究提供实验依据.     

人外周血单核细胞和脐血CD34+细胞来源的树突细胞比较

目的比较从人外周血单核细胞及脐血CD34+细胞诱导树突细胞(DC)的方法及其特性.方法用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞,贴壁法获得单核细胞;经GM-CSF及IL-4诱导获得DC.磁性活化细胞分选系统(MACS)分选脐血CD34+细胞,以GM-CSF、IL-4、TNF-α、SCF、FL、TPO等细胞因子诱导获得DC.用电镜、普通显微镜观察DC形态;流式细胞仪分析DC表型;同种混合淋巴细胞反应(allo-MLR)观察DC刺激T淋巴细胞增殖的能力.结果外周血单核细胞在因子GM-CSF、IL-4、TNF-α,脐血CD34+细胞在GM-CSF、IL-4、TNF-α、SCF、FL、TPO等因子作用下,可生成DC,并表达相应的DC分化抗原CD14、CD80、CD83、CD86、HLA-DR.脐血CD34+细胞具有较强的扩增能力,经2周诱导,体系细胞数可增加173.8士26.7倍,两种来源的DC均能刺激同种异体淋巴细胞的增殖反应.结论外周血单核细胞与脐血CD34+细胞,在体外均可诱导成DC,并具有相应的DC分化抗原和功能.     

慢性乙型肝炎患者树突状细胞培养与功能检测方法

目的:建立从人外周血分离培养树突状细胞(dendritic cell,DC)及检测其表型与诱导淋巴细胞增殖能力的方法.方法:从未接受抗病毒治疗的CHB患者外周血中分离单个核细胞,在含GM-CSF、IL-4、TNF-α的完全培养基中诱导培养为DC,流式细胞仪检测细胞表型,混合淋巴细胞反应检测DC刺激淋巴细胞增殖的能力.结果:CHB患者外周血单核细胞,在体外可诱导出具有典型形态及生物学活性的DC.患者DC的HLA-DR、CD80、CD86的表达率分别为(44.77±8.127)%、(36.65±6.867)%、(32.16±6.340)%,CHB患者DC刺激淋巴细胞增殖的SI为1.39±0.375.与正常人DC相比明显降低(P<0.01).结论:CHB患者单个核细胞能被诱导培养为DC;通过检测DC表型和刺激淋巴细胞增殖能力可以了解CHB患者抗HBV免疫功能.     

负载宫颈癌肿瘤裂解物的树突状细胞诱导的淋巴细胞反应

目的:利用树突状细胞(dendritic cell,DC)递呈肿瘤抗原的生物学特性,观察DC负载宫颈肿瘤裂解物抗原后能否促进同种异体T淋巴细胞增殖,并且活化为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL).方法:宫颈癌患者外周血单核细胞体外经粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)诱导产生DC,肿瘤裂解物和TNF-α共同促其成熟,与异体T淋巴细胞混合共育,以MTT法测定T细胞的增殖程度.结果:宫颈癌患者外周血来源DC无论负载肿瘤组织裂解物还是传代肿瘤细胞裂解物,均可促进异体T细胞大量增殖,二者间无显著差异(P＜0.05).结论:DC能递呈宫颈癌肿瘤抗原,诱导产生大量抗原特异性CTL,提示负载肿瘤裂解物的DC具有为宫颈癌患者进行特异性免疫治疗的临床应用前景.     

鼻咽癌可溶性抗原负载DC诱导CTL杀伤鼻咽癌细胞的体外研究

目的：用负载鼻咽癌细胞(CNE)可溶性抗原的树突状细胞(dendritic cells，DC)诱导自身淋巴细胞，使之活化为鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)特异性细胞毒性T细胞(cvtotoxic T lymphocyte，CTL)，观察其对鼻咽癌细胞的体外特异性杀伤作用。方法：用GM-CSF、IL-4和TNF-α体外诱导健康成人外周血单核细胞，使其分化为高纯度DC。用鼻咽癌细胞(CNE)可溶性抗原负载成熟DC，流式细胞仪检测负载前后DC的表型特征，MLR检测负载前后DC对同种异体T淋巴细胞增殖的能力。在白细胞介素-2(IL-2)的作用下，用负载鼻咽癌细胞可溶性抗原的DC诱导自身淋巴细胞成NPC特异性CTL，通过杀伤活性实验观察它对鼻咽癌细胞(CNE)的特异性杀伤效应。结果：人外周血单核细胞体外在GM-CSF、IL-4、TNF-α诱导下获得具典型表型特征的成熟DC。负载CNE可溶性抗原对成熟DC表面共刺激分子及特异性表面标志无影响，仍有较强的刺激同种异体淋巴细胞增殖能力，所诱导的CTL对鼻咽癌细胞(CNE)有明显的特异性杀伤作用。结论：负载鼻咽癌细胞(CNE)可溶性抗原的DC所诱导的CTL在体外对鼻咽癌细胞有特异性杀伤作用，对NPC的临床治疗有潜在的应用价值。     

梅毒患者外周血单核细胞体外诱导树突状细胞的形态学与功能研究

目的探讨梅毒患者外周血单个核细胞(PBMC)向树突状细胞(DC)分化的形态学与功能特征。方法分别分离健康人(10例,对照组)和梅毒患者(10例,实验组)外周血中PBMC,与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-4(IL-4)共同培养。用倒置显微镜观察细胞形态,用流式细胞仪测定细胞表型,同时进行混合淋巴细胞反应(MLR),观察其刺激同种异体未致敏T淋巴细胞增殖的能力。结果梅毒患者PBMC经GM-CSF与IL-4诱导获得的细胞具有典型的DC形态特征。细胞表面的CD80、CD83、CD86及HLA-DR的表达率分别为77.92%、39.34%、75.78%和95.42%。与对照组相比,CD80表达明显增高(P<0.05)、CD86表达明显降低(P<0.05),CD83及HLA-DR的表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。MLR结果显示,梅毒患者PBMC诱导分化的DC可以刺激同种异体T细胞增殖。结论经GM-CSF、IL-4刺激后,梅毒患者的PBMC可以诱导分化为具有典型形态特征及抗原呈递功能的DC,DC表型的特征可能影响梅毒患者的细胞免疫状态。     

脐血及外周血树突状细胞的体外诱导及比较研究

目的 :体外诱导扩增具典型形态、表型及功能的树突状细胞 (DC) ,以进行相关基础研究及临床应用。方法 :取正常人外周血及脐血 ,以 Ficoll分离取白细胞 ,去除悬浮细胞后 ,分别在以加入 GM- CSF,TNF-α(脐血 )及GM- CSF,IL- 4 (外周血 )的完全培养基中培养 ,在第 3,7,9天表型 (CD1a,CD80 ,CD83,HL A- DR)分析及形态观察 ,1周左右分别做同种异体混合淋巴细胞培养 ,比较激发细胞增殖的能力。结果 :脐血诱导的 DC细胞数大于外周血来源的 DC细胞数 ,两者有显著差异。两种来源的 DC在形态及细胞表型 (第 9天 CD1a脐血 6 7.2± 3.6 % ,外周血 6 9.3± 6 .8% ;CD83脐血 73.7± 5 .5 % ,外周血 75 .6± 4 .9% )无显著差异 ,两者的刺激同种异体淋巴细胞增殖能力无显著差异。结论 :脐血可成功诱导功能性 DC,脐血诱导比外周血诱导效率高 ,且与外周血所诱导的 DC在形态及功能方面差异无显著性     

口腔癌患者外周血树突状细胞的生物学特性

目的:研究口腔癌患者外周血树突状细胞(DC)的形态、表型和功能性变化及其临床意义. 方法: 口腔癌患者(实验组)及正常人(对照组)15例外周血单个核细胞经GM-CSF,IL-4及TNF-α诱导培养, 获取成熟DC, 光镜和电镜观察细胞的形态,流式细胞仪检测细胞表型如CD1a,CD83,CD80,CD86和HLA-DR等分子的表达变化,用噻唑蓝(MTT)法检测DC与自体和同种异体的混合淋巴细胞反应(MLR)中对淋巴细胞增殖的刺激能力. 结果: 正常人及口腔癌患者的外周血单个核细胞经体外7 d诱导培养,均诱导出具有典型形态和表型的DC,其中实验组细胞的CD83,CD1a表达率分别为49.3±9.5和48.1±7.3,与对照组两者表达率62.1±7.9和60.2±6.8相比,差异有统计学意义(P＜0.05),CD86,CD80和HLA-DR的表达率分别为85.5±8.7,83.2±8.1和78.3±5.4,与对照组三者表达率89.2±6.7,87.7±7.2和82.3±4.1相比无明显统计学差异(P＞0.05);实验组DC细胞CD83,CD1a,CD86,CD80和HLA-DR表达的平均荧光指数(MFI)分别为4.80±2.13,3.96±1.15,12.33±6.75,19.63±8.12和39.44±7.9, 均低于对照组,但差异无统计学意义(P＞0.05);口腔癌患者来源的DC在体外具有诱导同种异体和自体外周血T细胞增殖的能力. 结论: 口腔癌患者外周血单核细胞来源可诱导成为具有功能性的成熟DC,该细胞可应用于口腔癌的免疫治疗.     

慢性乙型肝炎病人外周血树突状细胞的功能研究

目的 比较慢性乙型肝炎病人外周血及正常人外周血两种来源的树突状细胞(dendritic cell，DC)表型及功能上的差异。方法 从慢性乙型肝炎病人及正常人外周血分离单个核细胞，在含有粒单细胞集落刺激因子(GM-CSF)白细胞介素4(IL-4)肿瘤坏死因子α(NFFα)的无血清培养基AVI-M中培养。流式细胞仪检测其表型，并采用MLR方法检测树突状细胞刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结果 慢性乙型肝炎病人外周血单核细胞经诱导可获得成熟的树突状细胞，但CD80表达较正常人低，刺激同种异体T细胞增殖能力低于正常人。结论 慢性乙型肝炎病人的外周血来源的树突状细胞的功能较正常人低。     

不同大肠癌细胞裂解物负载健康人外周血DC瘤苗的体外试验研究

目的探讨3种大肠癌肿瘤细胞裂解物负栽的健康人外周血树突状细胞（DC）刺激同体和异体T淋巴细胞增殖活化的作用。方法对血站来源的健康人外周血采用密度梯度离心法,分离获得DC前体细胞,用临床应用药物GM—CSF、TNF—a和试验用试剂rhlL-4联合诱导培养扩增Dc,制备3种大肠癌细胞裂解物,体外致敏DC,显微镜观察Dc形态演化过程,电镜拍摄微观形态特征,流式细胞仪鉴定DC表型,ELlSA法检测肿瘤抗原致敏DC分泌IL-12水平,检测致敏DC刺激T淋巴细胞分泌的IL—lO和IF阿7水平,3H—TdR法检测成熟DC（mDC）诱导同体和异体T淋巴细胞增殖能力。结果DC形态学呈现典型树突状分化特征,mDC表达特征性免疫表型CDla、CD83,共刺激分子CD86、HLA—DR,分泌高水平IL—12,mDC与同体和异体T淋巴细胞共培养均能有效刺激T淋巴细胞增殖活化,T淋巴细胞不分泌IL-10,分泌较高水平IFN-了,3W480细胞株在各项指标上都具优势,3H—TdR法检测提示mDC不仅可以刺激同体淋巴细胞增殖,同样有效激活异体T淋巴细胞。结论来源于血站的健康人外周血是-种方便的DC前体细胞原料。联合细胞因子的培养方法可以成功诱导出成熟的DCl型细胞,引起Thl型细胞免疫反应;3种大肠癌肿瘤细胞裂解物,尤其是Sw480细胞株裂解物抗原性质稳定,能够有效促进DC分化,提高DC成熟度;负载裂解物的DC不仅刺激同体T淋巴细胞增殖,也可有效激活异体T淋巴细胞增殖,因此应用健康人异体来源的DC瘤苗刺激患者T淋巴细胞增殖,从而产生抗肿瘤免疫反应的设想是可行的。     

人外周血树突状细胞体外诱导培养及表型鉴定

目的从健康人外周血中分离单个核细胞（peripheral blood mononuclearcell,PBMC）,经体外诱导培养获取成熟树突状细胞（dendritic cell,DC）.方法取健康人新鲜外周血,经密度梯度离心法分离,获得单个核细胞,在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养.置37℃、5%CO2培养箱内静置培养2 h后除去悬浮细胞.培养液中加入rhGM-CSF和rhIL-4继续培养贴壁细胞5 d,然后加入TNF-α促进其分化成熟.倒置显微镜下观察DC形态,流式细胞仪（flowcytometer,FCM）对其进行表型鉴定.结果显微镜下观察DC细胞形态不规则,表面有大量的毛刺状突起;成熟DC细胞表面CD83、CD80分子表达明显增高.结论用rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α联合培养可以从健康人外周血诱导培养出成熟的树突状细胞.     

猪苓多糖经TLR4刺激小鼠骨髓来源的树突状细胞成熟

目的：研究猪苓多糖（polyporus polysaccharides,PPS）诱导小鼠骨髓树突状细胞（dendriticcell,DC）表型及功能成熟的分子机制。方法：从小鼠骨髓中分离单个核细胞（MNC）,用rmGM-CSF、IL-4培养5 d后将其分为三组：实验组中加入50μg/mL PPS;阳性对照组中加1μg/mL LPS;加等量RPMI 1640培养基作为阴性对照组,继续培养48 h。苏木精-伊红（HE）染色观察细胞形态;流式细胞仪（FACS）分析DC表面CD80、CD86及MHC II（I-A/I-E）表达情况;经20μg/mL Toll-like receptor（TLR）4、TLR2单抗作用1 h后,ELISA法检测培养上清中IL-12 p40含量;混合淋巴细胞反应（MLR）检测DC对T淋巴细胞的刺激能力。结果：PPS处理的DC具有毛刺状突起,呈典型的DC形态;细胞表达MHC II、CD80及CD86增加;对T淋巴细胞刺激能力增强;分泌IL-12增加且可被抗TLR4单抗所阻断。结论：PPS通过TLR4促进体外培养的小鼠骨髓DC表型与功能成熟。     

慢病毒介导的hGM—CSF修饰的肿瘤疫苗免疫活性研究

目的构建编码人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（humangranulocyte—macrophage colony stimulating factor，hGM—CSF）的慢病毒载体，研究编码hGM—CSF的慢病毒载体对树突状细胞（dendritic cell，DC）疫苗抗肿瘤活性的增强作用。方法以质粒pORFhGM—CSF为模板，采用PCR方法扩增出hGM—CSF基因片段；通过BamHI和XhoI限制性内切酶位点。将hGM—CSF基因定向克隆到慢病毒连接载体L166中构建重组载体L166-hGM—CSF。将重组载体L166-hGM—CSF和包装载体L205以及包膜载体L311共同转染慢病毒包装细胞293T，72h后收集病毒上清液获得编码hGM—CSF的慢病毒颗粒Lenti—hGM—CSF。从脐血中分离出单核细胞，rhGM—CSF、rhIL-4和α—TNF诱导获得DC，通过相差显微镜和流式细胞仪鉴定。应用反复冻融法制备可溶性肿瘤抗原，分别将负载肿瘤抗原的DC疫苗和慢病毒Lenti—hGM—CSF感染的负载肿瘤抗原的DC疫苗与T淋巴细胞共同培养，MTT方法检测并比较两者所诱导的CTL对反应细胞的体外杀伤活性。结果编码hGM—CSF的慢病毒载体L166-hGM—CSF成功构建，获得了编码hGM—CSF的慢病毒。该慢病毒的Hela细胞上清液中hGM—CSF的表达明显高于未感染者。从脐血中分离出的DC，显示其高表达CD80（87.2％）和CD86（92．8％），而单核细胞标志CD14的表达率较低（3．56％o慢病毒介导的分泌hGM—CSF的树突状细胞肿瘤疫苗刺激同种T淋巴细胞增殖的能力和抗肿瘤活性较普通DC疫苗明显增强（P〈0．01）。结论本实验制备的慢病毒Lenti—hGM—CSF感染反应细胞后能够显著增强DC肿瘤疫苗刺激同种T淋巴细胞增殖的能力及其诱导的CTL细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，为hGM—CSF修饰的DC肿瘤疫苗的临床应用提供了一定的实验依据。     

紫杉醇对人树突状细胞的生物活性的影响

目的 探讨常用化疗药物紫杉醇（TAX）对人树突状细胞（DC）生物活性的影响及作用机制,为化疗联合生物免疫治疗抗肿瘤提供理论基础.方法 体外实验：分别在紫杉醇5 ng/mL（b组）、10 ng/mL（c组）、20 ng/mL（d组）、40 ng/mL（e组）的浓度下及不加紫杉醇的条件下（a组）培养DC细胞,检测各组DC细胞的存活率、细胞成熟标志物及细胞因子分泌量,探究紫杉醇对人树突状细胞生物活性的影响,同时通过乳酸脱氢酶释放法（LDH）测定与紫杉醇处理的树突细胞共培养的细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）对肺癌A549细胞株的杀伤作用,测定紫杉醇对树突细胞抗原呈递作用的影响.体内实验：采用人肺癌细胞株A549的肿瘤组织块,皮下接种于裸鼠腋下,建立裸鼠肺癌模型.2d后将30只裸鼠随机分成5组,分别为A组（对照组）：细胞株A549＋盐水（NS）;B组：细胞株A549＋DC＋CIK;C组：细胞株A549＋CIK＋TAX;D组：细胞株A549＋TAX;E组：细胞株A549＋TAX＋DC＋CIK.每3天检测1次肿瘤大小、裸鼠存活时间.结果 体外实验：在共培养6d的前提下,b、c组第6天存活率与第0天存活率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）,d、e组第6天存活率与第0天存活率比较,差异有高度统计学意义（P＜0.01）,e组存活率仅为17.5％.c组和e组CD86、CD40、MHCⅡ的表达以及IL-12的分泌与正常组相比有显著增加（P＜0.05）,d组除了CD86,其他检测指标较正常组差异均有统计学意义,b组中只有MHCⅡ较正常组差异有统计学意义,经10 ng/mL紫杉醇处理的细胞在效靶比5∶1和10∶1的情况下,杀伤效果明显高于未经紫杉醇处理的细胞.其中紫杉醇处理组的细胞在效靶比为10∶1的情况下,杀伤活性已经到达（91.37±5.24）％.体内实验：B、C、D、E组的平均存活时间分别为33.0、34.0、31.8、41.8 d,明显高于对照A组（23.8 d）（P＜ 0.05）.E组平均存活时间大于41.8 d,明显高于B、C、D组（P＜ 0.01）,其中E组中,45 d仍有3只存活,D组在前25 d体现出较好的治疗效果,但是25 d后瘤体增长速度增加,与B组差异无统计学意义.结论 低中浓度的紫杉醇可促进树突状细胞的成熟并提高其抗原呈递能力.高浓度紫杉醇可杀死树突状细胞,抑制其免疫活性.中浓度紫杉醇能促进树突状细胞分泌白介素12.紫杉醇、DC、CIK联合应用可提高荷瘤裸鼠生存时间.     

人外周血来源的成熟树突状细胞的体外无血清培养

目的探讨无血清条件下健康人外周血单个核细胞（PBMC）快速诱导生成成熟树突状细胞（dendritic cell,DC）的体外培养方法。方法分离获取健康者外周血PBMC,将细胞分为血清组和无血清组：设血清组A组为对照组,B、C、D组为无血清组。A组加入10%FCS的RPMI1640完全培养液,B组加入单核/巨噬细胞无血清培养液MΦ-SFM,两组均加入rhGM-CSF＋IL-4＋rhTNF-α培养9d;C组加入钙离子载体（CI）A23187,D组加入rhGM-CSF＋A23187,两组细胞均培养于MΦ-SFM中48h。于倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞术分析细胞表型,MTT比色法检测各组细胞刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结果在无血清条件下,单独给予A23187或A23187＋rhGM-CSF联合刺激48h,均可诱导PBMC分化成具有典型形态的DC;与血清组细胞相比,细胞表面标志CD80、CD86和CD83分子具有相似的高表达（P〉0.05）,对同种异体T淋巴细胞的刺激能力无显著性差异（P〉0.05）。结论在无血清培养条件下配合使用钙离子载体A23187,可以更快速、有效地诱导健康人PBMC分化成更成熟、功能更强的DC。     

非小细胞肺癌EMPE来源树突状细胞的分离培养

目的：建立非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）渗出性恶性胸腔积液（exudativemalignantpleuraleffusions,EMPE）来源树突状细胞（dendritic cells,DCs）的分离培养方法,观察DCs的形态学及对其进行表型鉴定。方法：用密度梯度离心的方法,从非小细胞肺癌EMPE中分离获得胸腔积液中的单个核细胞,用白细胞介素-4（IL-4）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）培养,应用倒置显微镜、光镜观察细胞形态;用流式细胞仪对DCs进行表型鉴定。结果：建立了PEDCs的分离培养方法。培养9d的DCs高表达人类白细胞抗原-DR（human leucocyte antigen,HLA-DR）、CD83、CD86、CD80。结论：从EMPE中分离的PEDCs体外培养后不仅在形态上成熟,而且高表达特异性表面分子。     

分泌IFN-γ的杀伤性树突状细胞的体外诱导培养及鉴定

目的从体外诱导的骨髓来源的树突状细胞（dendritic cells,DC）中分离分泌IFN-γ的杀伤性树突状细胞（IFN-γproducing killer dendritic cells,IKDC）.方法取C57BL/6小鼠骨髓细胞,以小鼠重组GM-CSF和IL-4协同诱导下培养.培养第6天,加LPS刺激.培养第7天,收集细胞,通过流式细胞仪（flowcytometer,FCM）分选出CD11clowB220＋NK1.1＋的细胞,FCM进一步鉴定其表型.并将其与肿瘤细胞系B16F10共培养24 h后,CBA（cytometric bead array）法检测共培养上清中IFN-γ的分泌水平.结果体外培养的骨髓来源的DC中,FCM检测存在CD11clowB220＋NK1.1＋的细胞,进一步鉴定发现其高表达CD49b,低表达MHC II类分子,不表达Gr-1分子;并且与肿瘤细胞B16F10共培养后可分泌大量IFN-γ.结论通过FCM分选的方法可从体外培养的骨髓来源的DC中获得IKDC.     

体外诱导培养健康成人外周血单核细胞源树突状细胞及鉴定

目的：建立体外从健康成人外周血单核细胞（Mo）诱导培养成熟的树突状细胞（DE）的方法。方法：采用连续贴壁法分离正常人外周血单核细胞,在GM-CSF和IL-4的完全培养基中培养。培养5天后收集细胞,重新铺板后继续在TNF-α的完全培养基中培养48小时后,收集细胞和上清液,采用流式细胞术检测DC表型CD80、CD83、CD40的表达;用ELISA法检测上清液中细胞因子IL-12的浓度;用倒置显微镜动态观察DC形态变化。结果：采用连续贴壁法和用GM—CSF、IL-4和TNF—α联合培养可以从人外周血诱导培养出大量的树突状细胞,且高表达CD80、CD83、CD40,表达率分别为84．29％、90．73％、92．38％。DC分泌的细胞因子IL-12浓度为38．52±11．34pg／ml。结论：采用连续贴壁法和用GM．CSF、IL-4和TNF-α联合培养可以从人外周血诱导培养大量的树突状细胞,检测表型CD80、CD83、CD40的表达率和细胞因子IL-12浓度可以鉴定树突状细胞。     

无血清培养富集乳腺癌干细胞的初步研究

目的：探讨富集乳腺癌干细胞的方法,以获得稳定数量的肿瘤干细胞。方法：（1）采用无血清悬浮培养方法,从乳腺癌MDA-MB-435细胞中筛选和培养肿瘤干细胞。（2）采用相差显微镜观察含胰岛素和不含胰岛素的无血清培养基中干细胞球形成大小、数量及随时间生长变化情况。（3）采用荧光显微镜观察Hoechst33342染料对MDA-MB-435肿瘤干细胞染色情况。（4）将MDA-MB-435肿瘤干细胞转人有血清培养基培养诱导分化,观察是否能有分化现象。结果：（1）采用无血清悬浮培养方法筛选和培养MDA-MB-435肿瘤干细胞成功。（2）发现不含胰岛素的无血清培养基中,形成的肿瘤干细胞团数量多且体积大。（3）随着培养时间延长,肿瘤干细胞球数量逐渐增多,体积逐渐变大。（4）Hoechst33342染料对肿瘤干细胞染色鉴定,约有90％肿瘤干细胞蓝色荧光染料较弱,呈暗淡区。（5）MDA-MB-435肿瘤干细胞经含血清培养基再次培养,具有分化功能。结论：含生长因子的无血清培养基培养MDA-MB-435细胞,可生成肿瘤干细胞球;不含胰岛素的无血清培养基更适合作为筛选肿瘤干细胞的培养基。     

自体树突状细胞来源的Exosome活化HBV携带者PBMCs的体外研究

目的探讨负载HBcAg的树突状细胞（DCs）来源的Exosomes（DEXs）体外活化自体外周血单个核细胞（PBMCs）的能力,并对慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者与自然免疫获得者来源的DEXs的功能进行比较。方法培养PBMCs来源的DCs,分级离心法收获DEXs,电镜及Western blot分析DEXs结构及蛋白成分,MTS和ELISPOT法检测负载HBcAg的DEXs体外活化自体PBMCs增殖及产IFN-γ的能力。结果负载HBcAg的成熟DEXs体外刺激自体PBMCs增殖能力强于未成熟者（P〈0.01）,自然免疫者与慢性感染者间差异无统计学意义;成熟DEXs刺激PBMC产IFN-γ能力亦强于未成熟者[（182±7）vs（14±2）,P〈0.05],且自然免疫者刺激PBMCs产IFN-γ能力强于慢性感染者（68±12,P〈0.05）。慢性感染者mDCs联合mDEXs刺激PBMCs产IFN-γ能力强于单用mDCs[（326±3）vs（275±23）,P〈0.05],相当于自然免疫获得者联合组（396±15,P〉0.05）。结论 mDEXs可有效活化自体PBMCs,且自然免疫者mDEXs活化PBMCs能力强于慢性感染者,这一现象可能与慢性感染者体内T细胞活化过程存在缺陷有关。