镉对蛋白磷酸酶2A-B55δ高表达L02细胞周期和核因子-κB活化影响

目的探讨镉对蛋白磷酸酶2A(PP2A)的B55δ亚基高表达和不同多态性单体型调控高表达的肝细胞周期的影响及其与核因子-kappaB(NF-κB)活化的关系。方法选择永生化人正常肝L02细胞,采用B55δ编码基因PPP2R2D序列构建高表达的L02-2R2Dc细胞、与不同启动子区单体型调控高表达的L02-2R2D-PC1和L02-2R2D-PC3细胞株,以导入空载体的L02-pBabe为对照细胞。各细胞给予5～80μmol/L的氯化镉(CdCl2)处理建立细胞模型。噻唑蓝法检测各细胞生长的抑制作用;流式细胞术检测细胞周期;蛋白免疫印迹(Western blotting)检测细胞核内NF-κBp65蛋白的活化情况;荧光定量聚合酶链反应(QRT-PCR)检测环氧合酶-2(COX-2)基因mRNA水平的改变。结果与对照组比较,CdCl2组各细胞的增殖抑制率随镉水平增高呈剂量依赖性增高(Pearson’s r均P<0.05);与CdCl2组比较,冈田酸+CdCl2组各细胞的增殖抑制率明显增加(P<0.05);与对照组比较,CdCl2组细胞G1期比例下降、S期比例增加(P<0.05);胞核p65蛋白水平增高,COX-2 mRNA水平上调;这种效应在不同细胞株之间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论镉可引起PP2A-B55δ高表达的人肝L02细胞增殖功能抑制并导致细胞周期S期阻滞,这种效应与NF-κB信号通路的活化有关。     

HBV调节胶原三股螺旋重复蛋白1表达的机制探讨

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)对胶原三股螺旋重复蛋白1(CTHRC1)表达的影响及其调节的分子机制。方法将HBV感染性克隆p HBV1.3及其单个基因的质粒分别与CTHRC1基因启动子共转染Hep G2细胞,并测定荧光素酶的活性;采用反转录PCR和Western blot检测CTHRC1 mRNA和蛋白表达的情况。结果 HBV X蛋白能够在Hep G2细胞显著激活CTHRC1基因启动子的活性,并在mRNA和蛋白水平上调CTHRC1的表达。结论 HBV通过X蛋白上调CTHRC1的表达。     

CYP1A2基因沉默及其对三氯乙烯毒性影响

目的 构建细胞色素氧化酶1A2(CYP1A2)基因沉默载体,转染L02人正常肝细胞(简称“L02细胞”),建立CYP1A2沉默细胞株并观察其对三氯乙烯(TCE)毒性的影响.方法 设计合成短发卡RNA(shRNA),连接到pLKO.1-puro质粒中构建CYP1 A2 shRNA慢病毒表达载体,感染L02细胞.筛选CYP1A2沉默细胞株,采用荧光定量聚合酶链式反应和免疫印迹法鉴定.分别采用浓度为0.25、0.50、1.00、2.00和4.00 mmol/L的TCE(设为相应的染毒剂量组)对L02细胞和CYP1A2沉默细胞染毒12h,同时设置二甲基亚砜溶剂对照组(即0.00 mmoL/L染毒剂量组),观察凋亡基因[B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-8、Caspase-9]和癌基因(c-fos、c-myc、K-ras、p53)等基因表达的变化.结果 测序证明插入pLKO.1-puro载体的CYP1A2基因干扰序列与设计的shRNA 序列一致.CYP1A2沉默细胞的CYP1A2mRNA和CYP1A2蛋白相对表达水平分别较L02细胞下降75.9％和82.4％(P＜0.01).TCE染毒后,0.25 ～4.00 mmol/L 4个染毒剂量组CYP1A2沉默细胞Bcl-2表达水平均高于相应染毒剂量组L02细胞(P＜0.01);部分0.25 ～4.00 mmol/L染毒剂量组Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和c-fos、c-myc k-ras、p53相对表达水平均低于相应染毒剂量组的L02细胞(P＜0.05或P＜0.01).结论 CYP1A2沉默降低TCE对L02细胞凋亡基因和癌基因的活化作用.     

hPARP-1高表达HaCaT细胞株的建立

目的建立hPARP-1过表达的HaCaT细胞株,观察过表达该基因后所引起的生物学效应。方法常规提取人皮肤角质细胞HaCaT的总RNA,RT-PCR扩增PARP-1全长cDNA基因片段,构建含PARP-1全长cDNA基因片段的真核表达载体pEGFP-PARP-1,通过BglⅡ、xhoⅠ双酶切及测序鉴定其正确性。利用脂质体将pEGFP-N2和pEGFP-PARP-1分别转染人皮肤角质细胞HaCaT,通过G418加压筛选,建立稳定高表达hPARP-1的HaCaT-PARP-1细胞株,并采用Realtime Q-PCR和Western blotting检测其mRNA和蛋白的表达水平。结果 RT-PCR扩增产物经BglⅡ、xhoⅠ双酶切后,与pEGFP-N2连接构建的重组体经酶切和测序,结果与GeneBank报道序列一致。Realtime Q-PCR及Western blotting结果显示,转染pEGFP-PARP-1质粒的细胞其PARP-1在mRNA及蛋白的表达水平均显著高于对照组。结论 PARP-1高表达细胞株成功建立。     

HBV核心抗原EGFP融合蛋白表达质粒的构建及在Hep G2细胞中的表达

目的探讨采用构建的质粒pHBc-EGFP转染HepG2细胞,瞬时表达HBV核心抗原和增强型绿荧光蛋白的可行性.方法克隆HBV核心抗原基因进入真核表达载体pEGFP-N1中,脂质体法转染HepG2细胞后在荧光显微镜下观察增强型绿荧光蛋白表达,并行RT-PCR及细胞免疫组化分析融合蛋白的表达.结果重组pHBc-EGFP质粒可在HepG2细胞内瞬时表达HBV核心抗原和增强型绿荧光蛋白融合蛋白.结论pHBc-EGFP质粒构建成功,增强型绿荧光蛋白的表达可报告HBV核心抗原表达.     

家兔pEGFP-N1/rCNP质粒的构建及其在人脐静脉内皮细胞中的表达

[目的]构建真核表达载体pEGFP-N1/rCNP并转染体外培养的人脐静脉内皮细胞,观察CNP基因在其中的表达。[方法]利用RT-PCR方法从家兔腹主动脉组织扩增获得CNP基因全场全长编码区,克隆到含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1上,构建重组载体pEGFP-N1/rCNP。利用LipofectaminTM 2000脂质体将重组质粒转染人脐静脉内皮细胞。[结果]重组质粒pEGFP-N1/rCNP构建成功;将其转染人脐静脉内皮细胞,观察到目的基因CNP表达。[结论]成功构建了家兔腹主动脉CNP基因的真核表达载体pEGFP-N1/rCNP,并可转染人脐静脉内皮细胞。     

IEX-1基因转染对人卵巢癌细胞增殖活性及顺铂敏感性的影响

目的:探讨即刻早期反应基因-1(immediate early response gene X-1,IEX-1)转染人卵巢癌细胞SKOV3后,对顺铂药物敏感性的影响。方法:提取并鉴定重组质粒pEGFP-N1-IEX-1,采用脂质体介导将重组质粒转染到人卵巢癌细胞SKOV3,RT-PCR检测转染前后IEX-1mRNA和蛋白的表达情况,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测转染后卵巢癌细胞SKOV3增殖情况以及对顺铂敏感性的变化。结果:成功转染IEX-1基因后可检测到IEX-1mRNA的高表达;转染组细胞的增殖速度增快(P<0.05),但对顺铂的敏感性明显增强(P<0.05)。结论:IEX-1可增强卵巢癌细胞的体外增殖能力,并增强卵巢癌细胞体外对顺铂化疗的敏感性,为肿瘤的有效干预和治疗提供新的靶点。     

CYP1A2基因在三氯乙烯毒性中的作用研究

[目的]应用分子克隆技术,建立CYP1A2基因沉默细胞株和CYP1A2基因高表达细胞株,研究CYP1A2基因对三氯乙烯毒性的影响.[方法]将三氯乙烯分别染毒L02肝细胞、CYP1A2基因沉默细胞和CYP1A2基因高表达细胞,染毒剂量分别为0.25 mmol/L、0.50 mmol/L、1.00 mmol/L、2.00 mmol/L和4.00 mmol/L,以DMSO作为对照溶剂,染毒12 h,观察凋亡基因(Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9)和癌基因(c-fos、c-myc、k-ras、P53)表达水平.[结果]三氯乙烯染毒CYP1A2基因沉默细胞后,Bcl-2的mRNA表达水平高于对照组(P＜0.01),三氯乙烯部分剂量组凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和癌基因c-fos、c-myc表达水平低于对照组(P＜ 0.05或P＜0.01).三氯乙烯染毒CYP1A2基因高表达细胞后,Bcl-2的mRNA表达水平相比对照组下降(P＜0.01),Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9 mRNA表达水平相比对照组升高(P＜0.01); CYP1A2高表达细胞中癌基因c-fos、c-myc、k-ras表达水平高于对照组(P＜0.01),P53表达水平低于对照组(P＜0.01).[结论]在体内代谢与CYP1A2存在密切关系,沉默CYP1A2基因可以减少三氯乙烯在肝细胞内代谢活化,导致三氯乙烯对凋亡基因和癌基因表达水平下降;三氯乙烯在CYP1A2基因高表达细胞中,表现出对凋亡基因和癌基因的促进表达作用.     

鸭乙型肝炎病毒聚合酶结合模拟肽真核表达载体的构建

目的：构建与鸭乙型肝炎病毒聚合酶(DHBV P)特异性结合的模拟肽的重组真核表达质粒，为进一步将重组质粒转染原代培养鸭肝细胞研究模拟肽的作用奠定基础。方法：以噬菌体肽库中筛选出来的能特异性结合DHBV P的模拟肽基因为模板，扩增模拟肽基因片段，并应用基因重组技术构建其真核表达载体pEGFP-N1-模拟肽基因(pEGFP-N1-M)。结果：经鉴定，目的基因片段以正确的方向插入载体pEGFP-N1中，序列正确，对码正确。结论：成功构建了重组真核表达质粒pEGFP-N1-M。     

戊型肝炎病毒ORF3基因转染HeLa细胞及其稳定表达

目的 将戊型肝炎病毒ORF3基因转染HeLa细胞,建立能稳定表达ORF3蛋白(pORF3)的细胞株.方法 将ORF3基因片段克隆至真核表达质粒pcDNA3,构建重组质粒pcDNA3-ORF3.电穿孔法将其导入HeLa细胞中,G418筛选得到稳定抗性的细胞株,并用RT-PCR和Western印迹法分别从mRNA水平和蛋白水平检测ORF3的表达.结果 成功构建了重组表达质粒pcDNA3-ORF3,并筛选获得能稳定表达pORF3蛋白的HeLa细胞株.结论 pORF3蛋白能够在HeLa细胞中稳定表达,为进一步研究其生物学功能奠定了实验基础.     

NF-κB在砷诱导人正常膀胱上皮细胞COX-2表达中的作用

目的观察NF-κB核转录因子在砷诱导人正常膀胱上皮细胞(SV-HUC-1)环氧化酶-2(COX-2)表达中的作用。方法在细胞培养液中加入不同浓度的NaAsO2,24 h后提取细胞总RNA和核蛋白,用RT-PCR和Westernblot方法分别分析COX-2 mRNA表达和NF-κB蛋白水平;选择COX-2高表达的NaAsO2处理组,再用NF-κB抑制剂(PDTC)处理,观察COX-2 mRNA表达水平的变化。结果 4、8μmol/L NaAsO2处理细胞后,COX-2 mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.05);4μmol/L NaAsO2处理组细胞NF-κB蛋白水平也显著提高,高于对照组,而10μmol/LNaAsO2处理组细胞NF-κB蛋白水平低于对照组(P<0.05);同时用4μmol/L NaAsO2和PDTC共同处理细胞后,COX-2 mRNA表达水平降低,显著低于单纯用4μoml/L NaAsO2处理细胞的COX-2 mRNA表达水平(P<0.05)。结论低剂量的砷能够诱导人正常膀胱上皮细胞COX-2 mRNA和NF-κB蛋白表达水平的增高,砷诱导的核转录因子NF-κB活化在砷诱导的COX-2...     

pEGFP-smac重组质粒的构建及在sw-480结肠癌细胞中的表达

目的构建一种含凋亡激活因子(second mitochondrial activator of caspase,SMAC)的重组质粒pEGFP-smac,观察其在结肠癌细胞中的表达,为探讨SMAC在结肠癌中抗凋亡作用的分子机制,为结肠癌的治疗提供理论依据。方法从sw-480结肠癌细胞中提取总RNA,以RT-PCR技术扩增SMAC全长基因后,与绿色荧光表达质粒pEGFP-N1构建pEGFP-smac重组质粒,转染sw-480细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光的表达,并对表达产物进行Western blot鉴定。结果 RT-PCR产物及含有重组质粒的菌落PCR产物经琼脂糖电泳,在预期位置(720 bp)处均有目的条带出现;重组质粒成功转染sw-480细胞,在荧光显微镜下强绿色荧光蛋白表达,Western blot鉴定结果显示pEGFP-smac上的SMAC基因在sw-480细胞中正确表达。结论成功构建pEGFP-smac重组质粒,可为进一步研究SMAC蛋白的功能提供重要的分子工具。     

NALP1基因与骨肉瘤细胞的相关研究

目的:探讨NALP1基因在骨肉瘤细胞株MG-63、U-2OS中的表达,以及高表达NALP1基因对于骨肉瘤细胞体外凋亡的影响.方法:使用RT-PCR、Western-blot法检测骨肉瘤细胞株MG-63、U-2OS中的mRNA及蛋白表达水平并与人成骨细胞株hFOB1.19比较.将NALP1基因转染质粒PcDNA3.1,将重组质粒转染骨肉瘤细胞,分成高表达基因组、空质粒组及对照组,加入抗肿瘤药物顺铂及甲氨蝶呤促使肿瘤细胞凋亡,使用流式细胞仪测定各组肿瘤细胞凋亡率.结果:通过统计分析,骨肉瘤细胞株MG-63、U-2OS中的mRNA及蛋白表达水平均低于人成骨细胞株hFOB1.19 (P＜0.05),NALP1高表达组的肿瘤细胞凋亡率明显高于空白质粒组及对照组.结论:上调骨肉瘤细胞株MG-63、U-2OS中的NALPl的表达量可以促进肿瘤细胞凋亡.     

LYRM1基因绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达

[目的]构建LYRM1基因绿色荧光蛋白融合载体,进而观察LYRM1基因编码蛋白在细胞内的定位情况.[方法]运用RT-PCR技术从人网膜脂肪组织中分离LYRM1基因的完整编码框,将其亚克隆到绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N2,脂质体转染3T3-L1前体脂肪细胞,激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白的表达情况.[结果]PCR、酶切鉴定及测序结果表明重组质粒构建正确.激光共聚焦显微镜下观察到pEGFP-N2转染的细胞中绿色荧光均匀分布于整个细胞,而pEGFP-LYRM1转染的细胞中绿色荧光主要集中在细胞核区域.[结论]成功构建了LYRM1绿色荧光蛋白融合载体,LYRM1编码蛋白在细胞中定位于胞核中.     

Effect of TIMP1 Gene in Proliferation of Human Colon Carcinoma Cells

目的 采用体外试验探讨基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)基因对人结肠癌(HCT-8)细胞增殖的影响.方法 构建TIMP1基因的真核表达载体和RNA干扰质粒(pcDNA3.1-TIMP1-K、TIMP1 RNAi、pcDNA3.1和空白对照),将TIMP1基因真核表达质粒和RNA干扰质粒分别瞬时转染入HCT-8细胞48～72h后,采用Real TimePCR方法检测TIMP1基因在HCT-8细胞中基因转录表达水平,并用Western blot方法检测TIMP1基因在HCT-8细胞中蛋白表达水平,采用MTr试验检测TIMP1基因过表达和干扰后对HCT-8细胞增殖的影响.结果 成功构建了TIMP1真核表达质粒和RNA干扰质粒.与空白对照比较,质粒pcDNA3.1-TIMP1-K在HCT-8细胞中mRNA和蛋白的相对表达含量较高,质粒TIMP1 RNAi的mRNA和蛋白表达含量较低,差异均有统计学意义(P＜0.05).构建过表达质粒(pcDNA3.1-TIMP1-K)转染HCT-8细胞后,与空白对照相比,第1～4天HCT-8细胞的活性无显著变化(P＞0.05),第5～7天TIMP1基因过表达能够促进HCT-8细胞的增殖活性(P＜0.05);构建干扰质粒(TIMP1 RNAi)转染HCT-8细胞后,与空白对照相比,第1～4天HCT-8细胞生长无显著变化(P＞0.05),第5～7天TIMP1基因过表达能够抑制HCT-8细胞增殖(P＜0.05).结论 TIMP1基因过表达后能够促进人结肠癌细胞的增殖,在一定条件下还能够抑制人结肠癌细胞的增殖.     

溴氰菊酯及6-羟基多巴胺对PC12细胞Nrf2/ARE通路影响

目的 探讨溴氰菊酯(DM)与6-羟基多巴胺(6-OHDA)对转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)通路作用的影响及差异.方法 用10 μmol/L溴氰菊酯处理PC12细胞1 h或用100 μmol/L 6-OHDA处理PC12细胞17 h后,用RT-PCR方法检测细胞Nrf2基因和其驱动的靶基因-γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS,由重亚单位GCSh和轻亚单位GCS1组成)和血红素氧合酶(HO-1)基因mRNA表达水平,蛋白印迹(Western blot)方法检测细胞Nrt2蛋白水平,免疫荧光细胞化学技术检测细胞HO-1蛋白水平.结果 DM染毒诱导转录因子Nrf2 mRNA表达、激活Nrf2,Nrf2可能参与DM对Nrf2下游基因GCSh、GCS1以及HO-1表达的调控;6-OHDA能诱导PC12细胞Nrt2 mRNA和蛋白的表达以及激活Nrf2;6-OHDA也诱导细胞HO-1或GCSh mRNA和蛋白的表达.结论 DM与6-OHDA对Nrf2/ARE通路的作用相似,DM是可干扰Nrf2/ARE通路的神经毒物.     

广东人群PP2A-B亚基基因5'-侧翼区多态性连锁不平衡和单体型分析

目的 探讨蛋白磷酸酶2A(PP2A)的调节B/PR5δ亚基基因5'-侧翼区多态性的连锁不平衡和人群单体型分布特征.方法 选取经体检排除急慢性疾病的50例广东汉族健康人群为调查对象,以人PPP2R2D基因5'-侧翼区中-1684 A>G(rs11146169)、-1196 C>T(rs9419202)、-462 G>A(...     

人卵泡抑素基因真核表达载体构建和体外表达

目的:体外构建携带人卵泡抑素基因(FS)cDNA的真核表达载体,并观察其在幼年叙利亚地鼠肾细胞(BHK21)中的表达。方法:从新鲜人卵泡抽提液细胞中提取RNA,应用RT-PCR方法扩增人FScDNA序列,克隆到pMD-18T载体中,构成pMD-FS重组克隆质粒。经测序鉴定后,双酶切得到人FS基因cDNA序列,插入到真核表达载体pEGFP-N1中,构成pEGFP-FS重组表达质粒。pEGFP-FS重组表达质粒经酶切和PCR鉴定,通过脂质体2000介导瞬时转染BHK21细胞,并检测绿色荧光蛋白(GFP)的荧光表达。结果:成功构建pMD-FS重组克隆质粒,FScDNA序列测序结果与GenBank中公布的序列(Genbank NM_013409.1)同源性为100%;成功构建pEGFP-FS重组表达质粒,将其转染BHK21细胞后,观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:本实验成功构建了人FS的pMD-FS重组克隆质粒和pEGFP-FS重组表达质粒,为进一步研究FS对哺乳动物卵泡发育的影响奠定了基础。     

宿主因子CD63对人轮状病毒SA11体外复制的影响

目的 测定轮状病毒2种宿主细胞内CD63的高低表达对病毒体外复制的影响,为探究轮状病毒与宿主因子CD63的相互作用机制奠定基础。方法 构建CD63沉默表达质粒shRNA - 4038、shRNA - 4041和过表达质粒pcDNA3.1（+） - CD63 - flag（CD63 - Flag）。质粒转染轮状病毒2种宿主细胞CV - 1和MA104,采用实时定量PCR（RT - qPCR）和western blot检测CD63 mRNA和蛋白的表达,筛选CD63高表达细胞株（CD63 - H）和低表达细胞株(CD63 - L)。轮状病毒SA11感染CD63 - L、CD63 - H、正常对照细胞组（CNr）及空白对照细胞组（shNC）,采用RT - qPCR、western blot检测病毒基因拷贝数和病毒蛋白表达。结果 细胞转染shRNA - 4038和shRNA - 4041质粒后, CD63的表达明显抑制,其中CV - 1细胞mRNA和蛋白水平抑制效率分别为69.7%和39.8%,MA104细胞mRNA和蛋白水平抑制效率分别为76.4%和49.3% ;CD63 - H组细胞内CD63的mRNA和蛋白表达明显增加（P＜0.05）。采用滴度为8logFFU/ml的SA11病毒感染细胞后,CD63 - L组病毒基因拷贝数下降32.6%（CV - 1）和35.7%（MA104）;病毒蛋白表达水平下降41.6%（CV - 1）和44.7%（MA104）;CD63 - H组病毒基因拷贝数和蛋白表达水平明显增加,对照组病毒表达量无明显变化（P＜0.05）。结论 宿主因子CD63高表达能够促进病毒复制,而CD63抑制表达后,病毒复制明显下降。宿主因子CD63的表达与轮状病毒复制呈现正相关。     

Ei sh单纯疱疹病毒1型ICP34.5在Vero细胞的 表达及对Bax/Bcl-2的影响

摘要:目的　构建单纯疱疹病毒1 型（HSV-1）真核表达载体pmR-mcherry-ICP34.5,验证ICP34.5对宿主细胞Bax、Bcl-2 mRNA相对表达量及对Bax/Bcl-2的影响。方法　以提取HSV-1病毒DNA为模版,PCR扩增HSV-1 ICP34.5序列,双酶切连接至pmR-mcherry真核表达载体上,并对重组真核表达载体进行验证,然后重组载体瞬时转染Vero细胞,mRNA水平表达用逆转录PCR方法检测,融合蛋白的表达的检测用荧光显微镜,MTT检测对Vero的细胞活性,喜树碱诱导凋亡后,实时定量PCR检测Bax、Bcl-2 mRNA在细胞中的相对表达量。结果　转染后RT-PCR 验证有目的基因的转录,荧光显微镜观察到融合蛋白在转染的Vero细胞中表达。重组质粒可以抵消空质粒对细胞的损伤作用,转染重组质粒的Vero细胞和正常细胞的中Bax mRNA表达量和Bcl-2 mRNA表达量相差不大,但Bax/Bcl-2得比值明显低于转染pmR-mcherry空质粒的Vero细胞和正常加药的Vero细胞。结论　pmR-mcherry-ICP34.5 真核表达载体能在Vero细胞中高效表达,并能减弱空质粒转染对细胞活性作用,ICP34.5能使Vero细胞中Bax/Bcl-2稳定性增强,使细胞抗凋亡。