P53、P21^WAF/CIP1和Cyclin D1基因蛋白在沥青烟暴露小鼠肺组织中的表达

[目的]探讨沥青烟对小鼠肺组织形态及基因蛋白P53、P21^WAF/CIP1和Cyclin D1表达的影响。[方法]建立沥青烟亚急性染毒小鼠模型，将120只昆明种健康小鼠随机分为3组，即1个对照组和2个染毒组，染毒组进行不同浓度（55、165mg,／m^3）和不同时间（30、60d）染毒，光镜下观察肺组织形态改变，采用免疫组化S-P法，对P53、P21、Cyclin D1染色，观察P53、P21和Cyclin D1基因蛋白表达。[结果]不同浓度、不同时间染毒小鼠肺组织形态有不同程度改变，高浓度染毒组出现不典型增生。小鼠肺组织P53基因蛋白表现为低浓度染毒30d组，未见阳性表达；高浓度染毒60d组呈强阳性表达（P〈0．01）。P21^WAF/CIP1基因蛋白表达低浓度染毒30d呈阳性表达；高浓度染毒60d组表达明显下调（P〈0．01）。Cyclin D1基因蛋白表达同P53基因蛋白表达。[结论]随着染毒浓度和染毒时间的增加，肺组织增生逐渐明显，P53和Cyclin D1基因蛋白的表达呈上升趋势，P21^WAF/CIP1呈下降趋势。     

氯乙烯染毒对大鼠肝细胞P16、CCND1和CDK4基因mRNA表达的影响

目的通过检测氯乙烯(VCM)对大鼠肝脏细胞P16、CCND1和CDK4基因mRNA表达的变化,从细胞周期调控角度,探讨VCM可能的致癌机制。方法选用健康SD大鼠32只,按体重随机分为4组:阴性对照组,5、25、125mg/kg氯乙烯染毒组。采用腹腔注射染毒,隔日染毒,每周3次,连续6周。采用实时荧光定量PCR方法,测定大鼠肝脏细胞P16、CCND1和CDK4基因mRNA表达量。结果氯乙烯对大鼠肝脏细胞CCND1和CDK4基因mRNA表达量随着染毒剂量的升高而降低,且125 mg/kg染毒组与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。P16基因mRNA表达量没有明显改变,差异无统计学意义。结论 VCM对大鼠肝脏细胞周期的影响可能是通过下调CCND1和CDK4基因mRNA的表达。     

硒对镉诱导的雄性SD大鼠肝细胞c-myc和p53蛋白表达及细胞凋亡的影响

目的 探讨不同剂量亚硒酸钠对氯化镉诱导的雄性SD大鼠肝细胞的凋亡率、c-Myc和P53蛋白表达的影响.方法 将65只健康SPF级SD雄性大鼠随机分为13组,分别设对照(生理盐水)组、氯化镉(5.0、10.0、20.0 μmol/kg)组及亚硒酸钠(2.5、5.0、10.0 μmol/kg)+氯化镉(5.0、10.0、20.0 μmol/kg)联合作用组,每组5只.氯化镉采用一次性腹腔注射染毒,亚硒酸钠采用一次性灌胃染毒.染毒后48 h,用流式细胞仪检测细胞凋亡率,免疫组化法测定c-Myc和P53蛋白的表达量.结果 与相同剂量氯化镉组相比,亚硒酸钠剂量为2.5 μmol/kg时,全部联合作用组的大鼠肝细胞凋亡率、c-Myc和P53蛋白表达均降低(P＜0.05或P＜0.01);而亚硒酸钠剂量为5.0、10.0 μmol/kg时,部分联合作用组的大鼠肝细胞凋亡率、c-Myc和P53蛋白表达降低(P＜0.05或P＜0.01).大鼠细胞凋亡率与c-Myc、P53蛋白表达量均呈正相关(P＜0.01).结论 2.5 μmol/kg的亚硒酸钠对氯化镉所诱导的大鼠肝细胞的凋亡及c-Myc和P53蛋白表达的升高具有一定的拮抗作用.     

上皮性卵巢癌中P73蛋白、P21~(WAF1/CIP1)蛋白、PCNA蛋白的表达及其相关性

目的:探讨上皮性卵巢癌中P73蛋白、P21WAF1/CIP1蛋白与PCNA蛋白的表达及其相关性,为卵巢癌的临床诊断及治疗包括基因治疗提供实验依据。方法:采用Eli Visionplus免疫组化研究40例上皮性卵巢癌组织、15例正常卵巢组织、25例良性上皮性卵巢肿瘤组织、7例交界性上皮性卵巢肿瘤组织中P73蛋白、P21WAF1/CIP1蛋白与PCNA蛋白的表达。结果:随着上皮性卵巢癌病理学分级及临床分期增高,①P73蛋白表达率增高,差异有统计学意义(P0.05);但不同病理类型之间差异无统计学意义,在良性上皮性卵巢肿瘤与上皮性卵巢癌差异有统计学意义(P0.05);②P21WAF1/CIP1蛋白表达率降低,差异有统计学意义(P0.05);但不同病理类型之间无统计学差异,在良性上皮性卵巢肿瘤与上皮性卵巢癌差异有统计学意义(P0.05);③PCNA蛋白表达率增高,差异有统计学意义(P0.05);但不同病理类型之间无统计学差异,在良性上皮性卵巢肿瘤与上皮性卵巢癌差异有统计学意义(P0.05)。结论:①P73蛋白、PCNA蛋白表达在上皮性卵巢癌中阳性率升高,并随恶性程度增高而增高。②P21WAF1/CIP1蛋白表达在上皮性卵巢癌中阳性率降低,并随恶性程度增高而降低,与P73蛋白表达呈负相关。     

抑癌基因ING_1、P21/WAF_1、P53蛋白在宫颈癌中的表达

目的: 研究ING1、P21 /WAF1、P53基因蛋白在宫颈癌组织中的表达、意义及相互关系。方法: 对 69例宫颈癌鳞状上皮组织、21例宫颈原位癌组织、18例宫颈不典型增生组织应用免疫组化法, 检测P33ING1、P21 /WAF1 和P53的表达情况,并选择 10例正常宫颈组织作对照。分析各指标间的相关性。结果: P33ING1在正常宫颈组织中表达全部为阳性, 而宫颈不典型增生组织中P33ING1的阳性表达率为 72 2% (13 /18); 宫颈原位癌组织中P33ING1的阳性表达率为 57 1% (11 /21); 宫颈浸润癌组织中P33ING1的阳性表达率为 59 4% ( 41 /69 )。PING1在原位癌、浸润癌的表达明显低于正常组织和不典型增生 (P<0 01 )。P33ING1与P21 /WAF1、P53表达有相关性 (P<0 01)。结论: ING1 是抑癌基因, 其蛋白P33ING1在宫颈癌中低表达, 对宫颈癌的发生、发展起重要作用。P33ING1、P21 /WAF1、P53表达具有相关性。     

氯乙烯亚慢性染毒对大鼠肝细胞周期及mir-21和mir-192表达的影响

目的 探讨氯乙烯（vinyl chloride monomer,VCM）亚慢性染毒对大鼠肝细胞周期以及microRNA21（mir-21）和microRNA192（mir-192）表达量的影响。方法 将32只健康斯普拉-道来（sprague dawley,SD）大鼠随机分为三个实验组（5 mg/kg组,25 mg/kg组和125 mg/kg组）与一个对照组（25 mg/kg清洁空气组）,每组8只。采用腹腔注射进行VCM染毒,每周3次（隔日染毒）。染毒12周,处死大鼠并摘取肝组织。制备肝单细胞悬液,使用流式细胞技术检测G0/G1期、S期和G2/M期肝细胞所占百分比;提取肝细胞中的小片段RNA（<200 nt）,采用实时荧光定量PCR技术检测大鼠肝细胞中mir-21和mir-192的表达量。结果 VCM染毒大鼠G0/G1期、S期和G2/M期肝细胞所占百分比在各剂量组间差异均无统计学意义（均有P>0.05）;125 mg/kg组S期细胞与对照组相比明显增加,差异有统计学意义（t=-4.363,P=0.024）。各剂量组之间mir-21相对表达量差异有统计学意义（H=16.064,P=0.001）;与对照组和5 mg/kg组相比,25 mg /kg组及125 mg/kg组mir-21相对表达量均降低,差异均有统计学意义（均有P<0.05）。各剂量组之间mir-192相对表达量差异有统计学意义（H=15.939,P=0.001）;与对照组和5 mg/kg组相比,25 mg/kg组及125 mg/kg组mir-192相对表达量均降低,差异均有统计学意义（均有P<0.05）。结论 VCM亚慢性染毒导致大鼠肝细胞S期比例增加,mir-21和mir-192表达下调,具体调节机制有待进一步研究。     

慢性铝染毒致大鼠神经细胞凋亡及P53磷酸化改变

目的 探讨慢性铝染毒致大鼠神经细胞凋亡及P53磷酸化的变化.方法 40只雄性SD大鼠按照体重随机分为空白对照组和低、中、高剂量AlCl3染毒组(每组10只),染毒剂量依次为10.73、107.33、1073.33 mg/kg,染毒期6个月.染毒组将氯化铝(AlCl3·6H2O)混入饲料中喂养大鼠,对照组无AlCl3饲料饲养.TUNEL法检测大鼠皮质神经细胞凋亡,免疫印迹法检测大鼠皮质P53蛋白及其ser15位点磷酸化蛋白表达.结果 低、中、高剂量组皮质神经细胞凋亡率均明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01).随着染毒剂量的增加,大鼠脑皮质组织中P53和ser15位点磷酸化P53蛋白表达均增加.高剂量组P53蛋白表达量明显高于对照组和低剂量组,差异有统计学意义(P＜0.05);中、高剂量组ser15位点磷酸化P53蛋白的表达量明显高于对照组和低剂量组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 慢性AlCl3染毒可致大鼠皮质神经元P53及磷酸化P53蛋白表达增加,这可能是引起神经细胞凋亡的机制之一.     

燃煤型砷中毒皮肤病变中P16、P21WAF1/CIP1/、CyclinD1蛋白的表达及意义

目的　探讨砷中毒与皮肤病变的关系。方法　用免疫组织化学法检测燃煤型砷中毒患者皮肤病变中P16、P2 1WAF1/CIP1、CyclinD1蛋白的表达情况。结果　P16的表达强度和密度随患者皮肤病变程度的加重而逐渐减弱 ,P16蛋白在癌变组 (A组 )、癌前病变组 (B组 )和过度角化组 (C组 )中普遍缺失表达 ,明显低于一般增生病变组 (D组 )和正常组 ;P2 1WAF1/CIP1、CyclinD1的表达强度和密度随患者皮肤病变程度的加重而逐渐加强 ,P2 1WAF1/CIP1在各病变组中普遍强表达 ,明显高于正常组 ,各病变组间也有不同程度的差异 ;CyclinD1在A、B、C组中普遍强表达 ,明显高于D组和正常组。以上差异具有统计学意义。结论　皮肤过度角化可能是皮肤癌变的先兆 ;P16和CyclinD1蛋白的异常表达可作为皮肤癌变的预警标志 ;P16、P2 1WAF1/CIP1和CyclinD1在燃煤型砷中毒致皮肤病变尤其癌变的过程中共同起重要作用 ,动态监测P16、P2 1WAF1/CIP1和CyclinD1蛋白的表达水平有助于砷中毒致皮肤癌的早期发现、早期治疗和预后判断     

锰对HUVEC-304细胞生长及p53、p21WAF1/CIP1蛋白表达的影响

目的探讨锰对人脐静脉内皮细胞系HUVEC-304细胞生长及p53、p21WAF1/CIP1蛋白表达的影响。方法取指数生长期HUVEC-304细胞,以100、200、400、800μmol/L MnCl2,分别作用24、48、72 h后,以四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色实验检测细胞的存活力,筛选锰对细胞的毒性剂量。流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡,Western blot方法检测p53、p21WAF1/CIP1蛋白的表达。结果100、200、400、800μmol/L MnCl2作用24、48、72 h均对HUVEC-304细胞有显著的抑制作用(P<0.05),且呈剂量-时间效应关系。流式细胞仪检测结果表明锰能诱导HUVEC-304细胞凋亡(P<0.01),Western blot结果显示,随锰浓度的增高,p53蛋白的表达下降(P<0.05);而p21WAF1/CIP1蛋白表达上升,差异有统计学意义(P<0.05),且呈剂量依赖性。结论锰可抑制HUVEC-304细胞的增殖,诱导其发生凋亡,p53蛋白的表达减少及p21WAF1/CIP1蛋白的表达增加是其发生凋亡的机制之一。     

氯乙烯染毒对大鼠肝细胞色素P4502E1活力和mRNA表达的影响

目的　研究氯乙烯染毒大鼠肝微粒细胞色素P4502E1(CYP2E1)活力和mRNA表达随染毒时间和剂量的变化, 探讨两者可能的关系。方法　大鼠染毒12 周, 低、中、高剂量组的染毒剂量分别为5,10, 20 mg/kg, 分别在第3, 6, 9 和12 周处死动物, 代谢酶CYP2E1 活力测定采用分光光度法, 其mRNA表达用一步法RT PCR测定。结果　低剂量组CYP2E1活力随染毒时间增加而增强(P<0 05);中、高剂量组CYP2E1活力出现先升高后降低的趋势。染毒结束时,中、高剂量组大鼠肝细胞mRNA表达明显高于对照组(P<0 01)和低剂量组(P<0 05)。结论　低剂量组CYP2E1 的活力随染毒时间增加而增强, 而CYP2E1 mRNA的相对表达在本次实验中未出现时间趋势, 但在染毒结束时有明显的剂量-效应关系, 两者变化水平不一致。     

胃癌组织中P16、Cyclin D1、Rb表达及其生物学行为的研究

目的研究P16、Cyclin、D1Rb基因在胃癌中的表达及其与胃癌生物学行为的关系.方法采用免疫组化方法检测10例正常胃黏膜、30例胃癌组织中P16、Cyclin D1、Rb蛋白的表达,并结合其临床资料进行分析.结果P16、Cyclin D1、Rb蛋白阳性表达,正常胃粘膜分别为90%、10%、90%;胃癌分别为36.67%、53.33%、50%,胃癌纽与正常对照组间差异均有显著性(P＜0.05),P16、Cyclin D1蛋白与胃癌分化程度、淋巴结转移与否、远处转移与否呈一定的相关性.结论P16、Cyclin D1、Rb基因与胃癌发生有关,P16、Cyclinp蛋白检测有助于胃癌预后的判断.     

P73、P53、P21~(waf1)及PCNA在胃黏膜不同病变中的表达和临床意义

目的探讨P73、P53、P21waf1及PCNA在胃黏膜不同病变中的蛋白表达与胃黏膜上皮细胞癌变的关系、以及与胃癌临床病理特征之间的关系。方法应用免疫组织化学方法(S—P法)检测39例胃癌及17例萎缩性胃炎、40例慢性炎性息肉中的P73、P53、P21waf1和PCNA的表达情况,并结合临床病理资料进行统计学分析。结果胃癌中P73蛋白高表达,阳性率为64·1%(25/39),与慢性炎性息肉组、萎缩性胃炎组相比较有显著性差异(P<0.05);P73和P53、PCNA的表达呈正相关(P<0.05),和P21waf1呈负相关,P3的蛋白表达与组织学分型、黏膜浸润的深度、TNM分期、淋巴结转移无相关(P>0·05);胃癌中P53蛋白的阳性表达率为64.1%(25/39),与慢性炎性息肉组、萎缩性胃炎组相比较有显著性差异(P<0.05),P53的蛋白表达与胃癌的组织学分型、黏膜浸润的深度、TNM分期、淋巴结转移无相关(P>0.05);胃癌中P21waf1蛋白低表达,其阳性率为20.5%(8/39),胃癌组与慢性炎性息肉组、萎缩性胃炎组与慢性炎性息肉组相比较有显著性差异(P<0.05),P21waf1的蛋白表达与TNM分期及淋巴结转移呈负相关(P<0.05),与组织学分型、黏膜浸润的深度无相关(P>0.05);PCNA蛋白在胃癌中的阳性表达率为79.5%(31/39),与慢性炎性息肉组相比较有显著性差异(P<0.05),PCNA的蛋白表达与组织学分型、黏膜浸润的深度、TNM分期、淋巴结转移无相关(P>0.05)。结论P73高表达可能是一个胃癌发生的热点基因变化,在胃癌中P73蛋白的表达对胃癌的发生发展可能起着重要作用;P73作为抑癌基因有其组织特异性。P73和PCNA蛋白的协同表达,与P53、P21waf1的表达有一定的相关性,提示在胃癌的恶性转化、临床病理过程及判断预后方面有一定的临床意义。P21waf1可能是胃癌发生的一个早期信号,也可能是一个判断预后的指标之一。     

硫酸镉对FL/P450 1A1细胞中人肺癌易感基因P450 1A1的影响

目的　观察重金属化合物硫酸镉 (CdSO4 )在体外对人羊膜FL/P45 0 1A1细胞内P45 01A1DNA序列的改变作用 ,了解镉化合物对肺癌易感基因的影响。方法　利用不同剂量的CdSO4 处理FL/P45 0 1A1细胞 ,其半数抑制浓度 (IC50 )为 2 4.5 5mg/ml。以 1/ 4IC50 终浓度CdSO4 处理FL/P45 0 1A1细胞 48h后提取细胞pREP 9/P45 0 1A1质粒。由于 pREP 9缺少通用序列 ,BamHI酶切 ,低熔点琼脂糖电泳分离P45 0 1A1cDNA片段。BamHI酶切 pGEM～ 3Zf( ) ,CIP处理 ,并与 2倍摩尔P45 0 1A1cDNA片段混合 ,乙醇沉淀 ,沉淀物加入 18μlTE ,加 2 μl 10倍连接酶缓冲液 ,混匀 ,加10UT4DNA连接酶 ,混匀 ,12℃保温 16～ 2 0h。凝胶电泳分析连接结果。鉴定合格连接物转化DH5α菌 ,X gal喷洒对重组子进行蓝 /白颜色筛选。选择含重组子的宿主菌进行P45 0 1A1cDNA测序。结果　在体外 ,CdSO4 未引起FL/P45 0 1A1cDNA序列改变。结论　CdSO4 对FL/P45 0 1A1细胞中肺癌易感基因P45 0 1A1cDNA没有影响     

P16蛋白和细胞周期素D1在子宫内膜癌中的表达及其临床意义

目的:探讨细胞周期素D1、P16蛋白在子宫内膜癌中的表达及其临床意义。方法:采用免疫组化法(SP法)检测CyclinD1、P16蛋白在52例子宫内膜癌和26例正常子宫内膜中的表达,并对比两者在子宫内膜癌不同的病理分级、肌层浸润、临床分期中的表达差异。结果:CyclinD1基因在子宫内膜癌组织中阳性表达率为55.8%(29/52),显著高于对照组的11.5%(3/26)(P<0.01)。子宫内膜癌CyclinD1阳性表达患者的肿瘤细胞分化程度低且多有肌层浸润。P16蛋白在内膜癌组阳性表达率为57.7%(30/52),显著低于对照组的88.5%(23/26),其在子宫内膜癌不同组织分化程度、不同临床分期及有无淋巴转移组间表达阳性率比较有统计学差异(P<0.05)。内膜癌组CyclinD1与P16协同异常表达率为30.8%,协同正常表达率为32.7%。经等级相关分析,CyclinD1与P16表达未见相关关系。结论:子宫内膜癌组织中P16蛋白和CyclinD1的表达异常,检测结果有助于分析子宫内膜癌的分化程度、转移侵蚀及预后。两者协同异常表达表明肿瘤发生是多因素、多步骤、多阶段、多种癌基因和抑癌基因参与的复杂病理过程。     

二氧化硫对大鼠肝和肺细胞色素P4502B1和2E1 mRNA表达及活性的影响

目的探讨二氧化硫(SO2)对肝、肺微粒体细胞色素P450两种亚型CYP2B1和CYP2E1mRNA表达及活性的影响。方法采用SO2动式染毒技术使雄性Wistar大鼠染毒7天,每天6h,SO2的染毒剂量分别为14、28和56mg/m3。采用分光光度法测定大鼠肝、肺微粒体CYP2E1活性,采用荧光分光光度法测定肝、肺微粒体CYP2B1活性,采用RT-PCR方法测定各组大鼠肝、肺组织中CYP2B1和CYP2E1mRNA表达水平。结果在肝中,较高剂量的SO2(28和56mg/m3)可使CYP2B1活性及mRNA水平降低,肝微粒体CYP2E1活性及mRNA在各剂量组均未发生显著改变。肺组织中CYP2B1活性在56mg/m3剂量组显著降低,但其mRNA水平在28及56mg/m3剂量组均显著降低;肺微粒体CYP2E1活性及mRNA水平在28及56mg/m3SO2处理组均降低显著。结论SO2可降低大鼠肝中CYP2B1和2E1及肺中CYP2B1和CYP2E1的活性及mRNA水平。     

骨科术后切口感染LC-3和Beclin-1与P62表达水平及临床意义

目的探讨骨科术后切口感染患者微管相关蛋白1轻链3(LC3)、自噬特异性基因Beclin-1、P62表达水平及临床意义。方法选取2017年1月-2019年12月海南医学院第二附属医院收治的行骨科外科术后切口感染患者102例(研究组),选取同期行骨科外科术后未出现切口感染患者96例(对照组),免疫组化法检测创面组织LC3、Beclin-1、P62表达水平并分析其临床价值,分析骨科切口感染危险因素。结果与对照组相比,研究组年龄≥60岁、体质量指数(BMI)≥28 kg/m~2、手术时间≥2 h、术中出血量≥1000 ml、住院时间≥2周构成比、降钙素原(PCT)、白细胞计数(WBC)、C-反应蛋白(CRP)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-ɑ)水平和P62免疫组化评分均升高(P<0.05),LC3、Beclin-1免疫组化评分降低(P<0.05)。LC3、Beclin-1免疫组化评分与感染严重程度呈负相关(P<0.05),P62免疫组化评分与感染严重程度呈正相关(P<0.05);LC3免疫组化评分与CRP水平呈负相关(P<0.001),Beclin-1免疫组化评分与PCT、WBC、CRP水平均呈负相关(P<0.05),P62免疫组化评分与CRP水平均呈正相关(P<0.05)。年龄≥60岁、BMI≥28 kg/m~2、手术时间≥2 h、术中出血量≥1000 ml、住院时间≥2周是骨科患者切口感染的危险因素(P<0.05)。结论LC3、Beclin-1、P62表达水平与切口感染严重程度存在相关性,年龄、肥胖、手术时间、术中出血量及住院时间延长会增加切口感染风险。     

New monoclonal antibodies specific for mammalian protamines P1 and P2

ABSTRACT

The expression of protamines and the binding of these small arginine-rich proteins to DNA complete the process of spermatid chromatin reorganization and the global inactivation of the male’s haploid genome that occurs during the final stages of sperm development in mammals. While a number of anti-protamine antibodies have been created during the last 40 years, only a few have proven useful for detecting the presence of the protamines, determining the timing of their expression and deposition in chromatin, and investigating their structure and function in both maturing spermatids and sperm. The aim of this effort was to develop an additional set of monoclonal antibodies (MAbs) that not only recognize new P1 and P2 protamine epitopes but also work well as IHC reagents for detecting and identifying mammalian protamines in testicular tissue and ejaculated sperm. Using a combination of native and synthetic human protamines as antigens, 38 hybridoma clones recognizing human protamine P1 or P2 were generated. Antibodies produced by the 12 best clones were screened for selectivity by enzyme-linked immunosorbent assay, and two were found to recognize only human protamine P1 or P2, while a number of the others bound to both the human and mouse proteins. One MAb recognized every protamine tested. All the antibodies, including one recognizing stallion P1 and another recognizing stallion P2, bound to the native protamines in the chromatin of spermatids or sperm. While the majority labeled only elongating spermatids or sperm, several of the antibodies were found to also bind to the cytoplasm or nuclei of cells that lack protamine, which indicates these MAbs must recognize epitopes present in the protamines that are also found in other proteins. Thirteen overlapping human protamine P1 peptides were synthesized and subsequently used to identify the epitopes recognized by the six best antibodies.

Abbreviations: BSA: bovine serum albumin; ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay; HCl: hydrochloric acid; IHC: immunohistochemistry; i.p: intraperitoneal; LIS: lithium diiodosalicylate; MAb: monoclonal antibody; PBS: phosphate buffered saline