针对HBVS区的siRNA的抗病毒活性

目的: 体外观察siRNA对HepG2 2.2.15细胞中乙型肝炎病毒(HBV)S-mRNA及HBsAg,HBeAg产生的影响. 方法: 设计并合成针对HBV S区的三条siRNA,构建含上述siRNA的表达载体pSilencer ZY1,pSilencer ZY2和pSilencer ZY3,pSilencer HK2测序及酶切鉴定后用脂质体介导重组质粒转染HepG2 2.2.15细胞,用酶免分析法对HepG2 2.2.15细胞上清中HBsAg,HBeAg进行检测,用逆转录聚合酶链反应检测HBV S-mRNA.结果: 成功构建了针对HBV S区的siRNA的表达载体,三条siRNA均可程度不同地抑制HepG2 2.2.15细胞上清中HBsAg,HBeAg的分泌,72 h抑制率达高峰,对HBsAg的抑制率分别为81%,29%及78%,对HBeAg的抑制率分别为35%,3%及49%,并有抑制HBV S-mRNA的作用.结论: 针对HBV S区的siRNA能明显抑制HBV的复制.     

阳离子脂质体介导pEGFP-N1转染HepG2.2.15细胞效率初探

目的探讨阳离子脂质体介导绿色荧光蛋白质粒转染HepG2.2.15细胞的转染效率。方法以阳离子脂质体包裹绿色荧光蛋白质粒转染HepG2.2.15细胞,观察不同配比的脂质体与绿色荧光蛋白的转染率。结果对照组未见绿色荧光蛋白表达,各实验组HepG2.2.15细胞均可见绿色荧光蛋白表达,表达量随脂质体浓度增加而增加(P<0.05),最高转染率为23.22%。结论阳离子脂质体能有效地介导绿色荧光蛋白质粒转染HepG2.2.15细胞。     

siRNA抑制乙型肝炎病毒在HepG2.2.15细胞中的复制与表达

目的 探讨靶向HBV S基因的siRNA表达质粒在HepG2.2.15细胞中对HBV病毒的复制与表达的抑制效应及其抗病毒活性.方法 设计并构建了两个靶向HBV S基因的siRNA表达质粒S1和S2,随机设计的用于对照的非同源siRNA表达质粒S3.首先在HepG2.2.15细胞中通过实时荧光定量PCR评估该siRNA表达质粒对HBV mRNA表达的抑制效应,接着在HepG2.2.15细胞中通过ELISA方法进一步枪测它们的抗病毒活性细胞上清液中HBV标志性蛋白HBsAg、HBeAg的表达水平.结果 在siRNA表达质粒转染HepG2.2.15细胞后48 h,HBV S基因mRNA表达量下降64%～88%,HBsAg和HBeAg的表达水平分别降低了60%～82%和56%～78%.S1+S2联合使用转染细胞中显著抑制HBV病毒的复制与表达的效率,而对照组S3无抑制效果.结论 发现靶向HBV S基因的siRNA表达质粒能够在HepG2.2.15细胞中有效的抑制HBV病毒的复制与表达,并能够降低细胞上清液中HBsAg和HBeAg的表达水平.S1+S2联合使用转染细胞中可以显著抑制HBV的复制与表达的效率.RNAi可能成为防治HBV感染有效的全新的抗病毒防御策略.     

RNA干扰抑制HepG2细胞AFP基因表达实验方法建立

目的：筛选较理想的阳离子脂质体META／pGenesil—AFP质粒转染HepG2的方法。方法：将针对两条靶序列AFP1和AFP2的shRNA的DNA模板双链,连接于质粒表达载体,构建质粒载体pGenesil—1—AFP1（含绿色荧光蛋白GEP编码序列）及pGenesil-2-AFP2,用阳离子脂质体META／质粒载体pGenesil—1—AFP1转染HepG2细胞。荧光显微镜观察并计算不同剂量配比的脂质体／质粒载体混合液转染效果及微粒子化学发光免疫分析法检测不同剂量配比转染后对AFP基因表达的影响。结果：剂量比为8μL：2．5μg条件,能有效地转染HepG2细胞,并有效抑制AFP表达且无细胞毒性作用。结论：本研究成功建立了阳离子脂质体META／质粒载体pGenesil—1—AFP1转染HepG2细胞实验方法。     

miR-122对乙型肝炎病毒抗原表达的影响

目的:探讨miR-122对乙型肝炎病毒HBsAg、HBeAg表达的影响.方法:设计合成2务miR-122的反义寡核苷酸(anti-miR-122,LNA-antimiR-122)、hsa-miR-122以及阴性对照anti-GFP,脂质体介导转染HepG2.2.15细胞.取细胞转染24h、48 h后的培养液,时间分辨荧光免疫法检测anti-miR-122组、LNA-antimiR-122组、hsa-miR-122组以及anti-GFP组HBsAg和HBeAg的表达,定量PCR检测各组HBV DNA的表达.转染48 h后,提取细胞内总RNA,Taqman技术实时荧光定量PCR检测各组miR-122的表达.结果:①转染48 h后anti-miR-122组、LNA-antimiR-122组miR-122表达明显受抑制,低于阴性对照组(P ＜0.001).hsa-miR-122组miR-122水平较阴性对照组升高(P＜0.001).②hsa-miR-122组HBsAg、HBeAg表达均低于阴性对照组(P ＜0.001);anti-miR-122组、LNA-antimiR-122组HBsAg、HBeAg表达均高于阴性对照组(P ＜0.001).③转染24 h与48 h后各组HBV DNA表达与阴性对照组比较无统计学意义(P＞0.05).结论:miR-122可调节乙型肝炎病毒抗原表达.     

YTHDF1对HBV蛋白表达和HBsAg和HBeAg抗原分泌的作用

目的:探讨YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白1（YTHDF1）对乙型肝炎病毒（HBV）蛋白表达和抗原分泌的影响。方法:分别以pCD3/Flag-KBE和pSilencer2.1-U6 neo为载体,构建过表达和敲降YTHDF1质粒。在Huh7细胞中过表达HBV蛋白质粒的同时表达pshR-YTHDF1和对照质粒,通过Western印迹检测YTHDF1对HBV蛋白表达的影响。在HepG2.2.15细胞中过表达和敲降YTHDF1, 在Huh7细胞中同时过表达pHBV1.3质粒,通过ELISA检测YTHDF1对HBsAg、HBeAg抗原分泌的影响。结果:与正常肝细胞相比,YTHDF1在肝癌细胞Huh7（t=17.4）、HepG2.2.15细胞中（t=39.6）高表达。成功构建过表达和敲降YTHDF1质粒并验证其有效。敲降YTHDF1抑制HBV基因组编码的HBc蛋白（t=9.5）、HBs蛋白（t=5.2）、preS1蛋白（t=25.7）、preS2蛋白（t=9.0）、HBx蛋白（t=19.7）、HBV DNA Pol蛋白（t=23.0）表达,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。过表达YTHDF1促进HBsAg（Huh7细胞t48 h=5.5,t72 h=5.0;HepG2.2.15细胞 t48 h=5.3,t72 h=27.4）、HBeAg抗原（Huh7细胞t48 h=5.7,t72 h=6.3;HepG2.2.15细胞t48 h=29.0,t72 h=6.6）的分泌,而敲降YTHDF1抑制HBsAg（Huh7细胞t48 h=16.0,t72 h=7.9;HepG2.2.15细胞t48 h=22.3,t72 h=7.0）、HBeAg抗原（Huh7细胞t48 h=9.0,t72 h=14.3;HepG2.2.15细胞t48 h=8.1,t72 h=6.6）的分泌（均P＜0.05）。结论:YTHDF1可能具有增加HBV蛋白表达及促进HBsAg和HBeAg抗原分泌的作用。     

APOBEC3G真核表达载体构建及抗HBV复制的初步研究

目的构建人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G（APOBEC3G）真核表达载体,并探讨其抗乙型肝炎病毒（HBV）复制的作用。方法采用RT-PCR法从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因编码区片段,构建pcDNA3.1-A3G真核表达载体,利用脂质体转染法将pcDNA3.1-A3G转染HepG2.2.15细胞,分别于转染后第24、48、72 h收集细胞培养上清液和细胞总蛋白,Western blot检测HBx蛋白表达情况,ELISA法检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg表达情况。结果测序结果显示pcDNA3.1-A3G真核表达载体中APOBEC3G编码区序列存在1处碱基同义突变;HepG2.2.15细胞经APOBEC3G蛋白干扰后,HBx、HBsAg和HBeAg表达量逐渐降低,于72h表达量显著降低。结论成功构建了APOBEC3G真核表达载体pcDNA3.1-A3G;APOBEC3G在体外可以抑制HBV复制,为深入研究APOBEC3G作为抗HBV药物提供了实验基础。     

siRNA沉默HBx基因对肝癌细胞YKL-40蛋白表达影响的研究

目的 观察HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒X(HBx)基因沉默对酿酒酵母YKL-40蛋白表达的影响.方法 构建靶向HBx基因的siRNA真核表达载体pRNAT-HBx和阴性对照质粒,同时设空白对照组,采用Lipofectinamine 2000脂质体转染法转染人肝癌细胞系HepG2.2.15细胞.采用RT-PCR检测各组中HBx和YKL-40的mRNA水平,Western blot、细胞免疫荧光检测各组中HBx蛋白和YKL-40蛋白的表达.结果 pRNAT-HBx明显抑制HepG2.2.15细胞中HBx基因的表达,同时YKL-40的mRNA和细胞内蛋白表达水平也随之相应下调.结论 抑制HBx基因的表达能下调HepG2.2.15细胞中YKL-40蛋白的表达,提示HBx蛋白对YKL-40蛋白的表达具有一定的激活作用.     

SIRNA表达载体与阳离子脂质体复合物转染HEPG-2细胞的实验研究

目的 观察针对HIF1 α的SIRNA表达载体Genesil-HIF1 α与阳离子脂质体复合物对HEPG-2细胞增值及其对HIF1 α表达的影响.方法 以pGenesil表达载体分别设计阳性对照(pG-shRNA-Hif-1 α),阴性对照(pG-shRNA-HK),未处理细胞为空白对照(KB).用3 μg:15μl配比的pGenegil-SIRNA与阳离子脂质体的复合物转染HEPG-2细胞,G418 400mg/ml培养转染后的细胞10天,拍荧光照片.37℃、5%CO2、5%O2、90%N2培养36小时,用RT-PCR测定HIF-1 α mRNA的表达,用cck-8测细胞增殖.结果培养36小时的阳性对照组Hif-1 α mRNA表达明显减低(P<0.05),对Hepg-2细胞增殖抑制作用明显(P<0.05);结论 3μg:15 μl计量配比组pGenesil-hif-1 α与阳离子脂质体复合物可以有效转染Hepg-2细胞,能有效抑制HEPG-2细胞Hif-1 α的表达,并抑制其增殖.     

外源性microRNA介导的RNA干扰抑制HBV复制和表达

目的 设计并构建靶向HBV的外源性microRNA表达载体,观察其对HBV表达和复制的抑制作用.方法 以HBV P基因和X基因为靶基因,根据pcDNA6.2-G/W-miR载体要求,设计靶向HBV的microRNA序列,进行直接合成获得目的 片段并克隆到载体中,测序正确的载体通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RT-PCR、乙肝五项定量和荧光定量PCR检测其对HBV mRNA和HBV DNA的抑制作用.结果 质粒的转染效率为50%～60%,在这种状态下,外源性microRNA表达载体在HBV mRNA和HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平上均能显著抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制和表达(P＜0.05).结论 外源性microRNA表达载体构建成功,并能抑制HBV靶基因的表达,为其在慢性HBV感染基因治疗中的应用奠定了基础.