AMD3100抑制胃癌细胞的增殖和侵袭能力及其机制研究

目的:探讨CXCR4特异性非肽类受体拮抗剂AMD3100对胃癌细胞增殖和侵袭能力的影响及其可能的分子机制。方法:Western blot方法检测不同转移潜能胃癌细胞系中CXCR4蛋白的表达水平。以不同浓度的AMD3100处理MKN28-M和MKN28-NM细胞后,采用CCK-8检测胃癌细胞的增殖情况,Transwell实验观察胃癌细胞侵袭能力的变化。Western blot检测AMD3100处理后MKN28-M细胞中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、血管内皮生长因子(VEGF)的表达。结果:Western blot实验结果显示,高转移胃癌细胞MKN28-M中CXCR4的蛋白表达水平明显高于低转移胃癌细胞MKN28-NM,亲本细胞MKN28的CXCR4蛋白表达量很低。CCK-8和Transwell实验检测结果表明,AMD3100通过特异性阻断CXCR4的作用,显著抑制MKN28-M和MKN28-NM细胞的增殖能力(P<0.05)和侵袭能力(P<0.01),且其抑制均呈剂量依赖性。经AMD3100处理后,MKN28-M细胞中MMP-9和VEGF的蛋白表达水平降低。结论:AMD3100可能通过下调MMP-9、VEGF等分子的表达抑制胃癌细胞的增殖,减弱胃癌细胞的侵袭及转移能力。     

lncRNA-uc003uxs在缺氧诱导胃癌侵袭转移中的作用

目的:探讨长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）-uc003uxs在缺氧诱导胃癌侵袭和转移中的作用。方法:三个胃癌细胞系SGC7901、MKN45、MKN28分别经常氧和缺氧孵育 24 h ,提取3例配对的胃癌细胞总RNA,利用高通量lncRNA芯片比较它们之间的表达谱差异,初步筛选与缺氧诱导胃癌侵袭转移相关的关键分子。RT-PCR法检测 lncRNA-uc003uxs在缺氧诱导的胃癌细胞（相对于常氧诱导的胃癌细胞）以及20对胃癌组织（相对于癌旁组织）中的表达水平。通过慢病毒转染,稳定下调SGC7901和MKN28细胞中lncRNA-uc003uxs的表达。通过Transwell迁移和侵袭实验以及裸鼠尾静脉注射内脏转移实验检测lncRNA-uc003uxs下调后对胃癌细胞侵袭和转移能力的影响。结果:高通量芯片分析结果显示:与常氧诱导的胃癌细胞相比,缺氧诱导的胃癌细胞 SGC7901、MKN45和MKN28中有84个共同上调的lncRNA分子以及70个共同下调的lncRNA分子,而多重筛选策略则提示:lncRNA-uc003uxs可能是缺氧诱导胃癌侵袭转移的关键lncRNA分子之一。RT-PCR结果表明:lncRNA-uc003uxs在缺氧诱导的胃癌细胞SGC7901、MKN45和MKN28中显著上调,其在胃癌组织中的表达水平也显著高于癌旁组织。Transwell实验结果显示:缺氧能够显著增加SGC7901和MKN28细胞的迁移和侵袭能力,而下调lncRNA-uc003uxs的表达后,两种细胞的迁移和侵袭能力明显下降。此外,裸鼠尾静脉内脏转移实验也证实lncRNA-uc003uxs的下调抑制了胃癌细胞SGC7901的体内肝肺转移能力。结论:利用高通量芯片筛选,在胃癌细胞中发现了一系列缺氧相关的lncRNA分子。临床标本分析及功能缺失试验证实:lncRNA-uc003uxs是一个缺氧诱导胃癌侵袭转移的关键lncRNA分子。     

LncRNA-AK058003在缺氧诱导胃癌侵袭转移中的作用

目的:探讨lncRNA-AK058003在缺氧诱导胃癌侵袭和转移中的作用。方法:SGC7901、MKN45、MKN28三个胃癌细胞系,分别经常氧/缺氧孵育24h后,Trizol法提取3例配对的胃癌细胞总RNA,利用高通量lncRNA芯片比较它们之间的表达谱差异。通过差异倍数、邻近编码基因信息分析、长度特征分析等策略初步筛选与缺氧诱导胃癌侵袭转移相关的关键分子。RT-PCR法检测lncRNA-AK058003在缺氧诱导的胃癌细胞中相对于常氧条件下的表达水平,进一步检测其在20例胃癌临床标本中相对于癌旁组织的表达水平。构建小干扰RNA慢病毒,稳定下调AK058003在SGC7901及MKN45中的表达。Transwell、划痕实验、裸鼠尾静脉注入不同胃癌细胞等体外和体内实验检测抑制AK058003后对常氧和缺氧条件下胃癌侵袭转移的影响。结果:高通量lncRNA 芯片比较发现:缺氧诱导的胃癌细胞SGC7901、MKN45和MKN28与常氧条件下的细胞相比,有84个分子的表达在缺氧诱导的胃癌细胞中显著上调(P<0.05),其中差异倍数在3倍以上的共有5个。多重筛选策略提示AK058003可能是缺氧诱导胃癌侵袭转移的关键lncRNA分子之一。RT-PCR结果显示: AK058003在缺氧诱导的胃癌细胞中显著上调,其分别在SGC7901缺氧16h,MKN45缺氧24h,MKN28缺氧48h时达到峰值。进一步RT-PCR结果发现,AK058003在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织。缺氧条件下的Transwell实验结果显示缺氧能够显著增加SGC7901和MKN45的侵袭转移力,而抑制AK058003的表达后,胃癌细胞侵袭转移力明显下降。结论:通过高通量 lncRNA芯片比较,首次发现了一系列胃癌细胞中缺氧相关的lncRNAs 分子。通过临床标本验证以及功能缺失试验证实lnc-AK058003是系列分子中影响缺氧诱导胃癌侵袭转移的关键lncRNAs分子之一。     

miR-302c在胃癌中表达及对胃癌细胞侵袭和迁移影响的机制研究

摘 要：［目的］ 探讨miR-302c对人胃癌细胞侵袭和迁移能力的影响及机制。［方法］ 实时荧光定量PCR法检测miR-302c在胃癌细胞系和正常胃黏膜上皮细胞中的表达情况。在SGC7901和AGS细胞中分别转染miR-302c mimic和inhibitor后,Tranwell实验检测细胞侵袭和迁移能力变化。实时荧光定量PCR和Western blot法检测转染后环磷酸腺苷反应元件结合蛋白1(CREB1)的变化情况。［结果］与永生化的正常胃黏膜上皮细胞GES-1相比,miR-302c在胃癌细胞系SGC7901、MKN28、N87、MKN45和AGS中表达降低。转染 mimic和inhibitor后,miR-302c在SGC7901和AGS中表达分别明显上调和下调(P＜0.001)。Transwell实验发现,上调miR-302c后,SGC7901细胞的侵袭和迁移能力明显降低,而下调miR-302c后,AGS细胞的侵袭和迁移能力明显增强。进一步研究发现,miR-302c可抑制CREB1的表达。功能挽救实验证明CREB1可部分恢复miR-302c上调对SGC7901细胞侵袭和迁移的抑制作用。［结论］ miR-302c抑制胃癌细胞的侵袭和迁移,其机制可能是通过直接靶向CREB1。     

胃癌细胞uPA表达与腹膜种植潜能的相关性研究

目的探讨不同胃癌细胞系尿激酶型血浆纤溶酶原激活因子(uPA)的表达及其与腹膜种植能力的关系。方法采用半定量RT-PCR、Western blot和ELISA方法,比较不同胃癌细胞系(AGS、SGC7901、MKN45和MKN28)uPA表达和uPA活性的差异。将胃癌细胞直接注入裸鼠腹腔,建立腹膜种植模型,通过观察裸鼠生存时间等方法,比较不同胃癌细胞系的腹膜种植潜能。结果uPA表达以SGC7901细胞最高,uPA活性以MKN45细胞最高,AGS细胞uPA表达和活性均最低。AGS未发生腹膜种植肿瘤;SGC7901和MKN45均出现大小不等的腹膜种植肿瘤;MKN28出现伴有血性腹水且大小相似的腹膜种植肿瘤;但MKN45最早形成腹膜种植肿瘤,并且该组裸鼠的生存时间最短。结论各株胃癌细胞的uPA表达在转录和翻译水平相一致,但uPA的表达量和uPA活性大小有明显差异,并且这二者与腹膜种植能力呈正相关。     

LncRNA-MALAT1在缺氧诱导胃癌侵袭转移中的作用

目的:探讨LncRNA-MALAT1对缺氧诱导胃癌侵袭转移的影响。方法:RT-PCR检测胃癌组织标本和胃癌细胞株中MALAT1的表达;通过基因重组方法构建MALAT1的siRNA载体,并感染人SGC7901及MKN45胃癌细胞,RT-PCR验证siRNA干扰有效;Transwell实验研究其对胃癌细胞SGC7901及MKN45侵袭转移能力的影响。结果:MALAT1在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达高于癌旁组织和胃正常上皮细胞;缺氧能够促进SGC7901及MKN45细胞的侵袭转移能力,而下调MALAT1能够明显抑制缺氧条件下SGC7901及MKN45细胞的侵袭转移能力。结论:MALAT1在促进胃癌细胞的侵袭转移中发挥重要作用,为胃癌靶向治疗提供理论依据。     

lncRNA MALAT1/miR-141-3p/ZEB1 分子轴调控胃癌SGC7901 细胞的侵袭、迁移及上皮间质转化

[摘要] 目的：探究lncRNA MALAT1/miR-141-3p/ZEB1 分子轴对胃癌（GC）SGC7901 细胞侵袭、迁移及上皮间质转化（EMT）的调控作用。方法：收集2014 年4 月至2017 年5 月武汉商职医院普外科手术切除的GC组织（非坏死部分）和配对癌旁组织（距肿瘤组织>5 cm）标本38 例,同时选取正常胃上皮细胞GES1 及GC细胞系SGC7901、HGC27、BGC823、MKN45 和MKN28。qPCR实验检测MALAT1、miR-141-3p 在GC组织和细胞系中的表达水平,CCK-8 和Transwell 实验检测敲降MALAT1 对SGC7901 细胞增殖、迁移和侵袭的影响,WB 实验检测ZEB1、E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 的表达情况。双荧光酶素报告基因验证MALAT1、miR-141-3p 和ZEB1 的靶向关系,CCK-8 和Transwell 实验检测MALAT1/miR-141-3p/ZEB1 分子轴对SGC7901 细胞生物学行为的影响。结果：MALAT1 在GC组织和细胞系中高表达（P<0.05 或P<0.01）。敲降MALAT1 显著抑制了SGC7901 细胞增殖、迁移、侵袭及EMT（P<0.05 或P<0.01）;MALAT1 与miR-141-3p、miR-141-3p 与ZEB1 均具有直接靶向关系;进一步研究表明,同时过表达miR-141-3p 和MALAT1 或ZEB1 能够逆转miR-141-3p 对SGC7901 细胞生物学行为的抑制作用。结论：MALAT1通过靶向下调miR-141-3p 对ZEB1 的抑制作用,进而促进SGC7901 细胞侵袭、迁移及EMT。     

miR-4465调控EZH2的表达抑制胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的机制探讨

目的:探讨miR-4465通过调控EZH2的表达对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法:qRT-PCR检测胃癌组织和细胞系中miR-4465的表达水平;在MKN45细胞中过表达miR-4465或沉默EZH2,采用CCK-8和Transwell检测MKN45细胞增殖活力、迁移和侵袭能力;Western blotting检测EZH2、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达情况;双荧光素酶报告基因检测miR-4465与EZH2的相互作用。结果:与癌旁组织相比,miR-4465在胃癌组织中的表达降低,在胃癌细胞系(MCC-803、SGC7901、MKN45)中的表达水平显著低于人永生化胃细胞RGM-1,且在MKN45细胞系中的表达低于其他细胞。过表达miR-4465明显抑制MKN45细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT);双荧光素酶报告基因结果证实,miR-4465直接靶向作用于EZH2的3’-UTR;进一步实验证明,同时沉默miR-4465和EZH2能够恢复沉默EZH2对MKN45细胞增殖...     

miR-1271-5p在胃癌组织的表达及对胃癌AGS细胞生物学行为的影响

目的 探讨miR-1271-5p在胃癌组织和细胞中的表达及其对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法 收集2011年6月至2014年6月广西医科大学附属肿瘤医院90例手术切除胃癌组织及相应癌旁组织。采用qRT-PCR法检测胃癌组织及相应癌旁组织,人胃癌细胞系（SGC-7901、MGC-803、AGS）和人正常胃黏膜上皮细胞系GES1中miR-1271-5p的表达情况。利用瞬时转染法将miR-1271-5p mimics（过表达miR-1271-5p组）和miR-NC（阴性对照组）分别转染胃癌AGS细胞,建立过表达miR-1271-5p的胃癌AGS细胞系,然后采用CCK-8法检测转染后的胃癌AGS细胞增殖能力,平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。结果 miR-1271-5p在胃癌组织和胃癌细胞（SGC-7901、MGC-803、AGS）中的表达均低于相应癌旁组织及人正常胃黏膜上皮GES1细胞（均P<0.01）。与阴性对照组相比,过表达miR-1271-5p组胃癌AGS细胞增殖活力降低（P<0.01）,细胞集落形成数减少（P<0.01）,迁移和侵袭细胞数量亦减少（P<0.01）。结论 miR-1271-5p在胃癌组织和细胞中低表达,上调miR-1271-5p可抑制胃癌AGS细胞的增殖、迁移和侵袭。     

胃癌细胞株中GnT-V表达水平的检测

目的检测正常胃黏膜细胞株GES-1和胃癌细胞株GnT-V的mRNA和蛋白质的表达水平。方法体外培养胃癌细胞株BGC823、SGC7901、MKN45和正常胃黏膜细胞株GES-1,应用RT-PCR、Real-time PCR、Westem blot等技术检测胃癌细胞株及正常胃黏膜细胞GnT-V mRNA和蛋白质表达的水平。结果检测显示3株胃癌细胞（BGC823、SGC7901、MKN45）均表达CmT-V mRNA,其中BGC823、SGC7901呈高表达,MKN45则低表达GnT-V（P〈0．05）。各细胞相对正常对照组GnT-V的相对表达倍数分别为18．25,13．36,9．25。Western blot结果显示3株胃癌细胞均不同程度的GnT-V蛋白表达,而正常对照组不表达GnT-V蛋白。结论胃癌细胞不同程度表达GnT-V,各细胞中以BGC823表达量最高,SGC7901表达量居中,MKN45呈低表达,提示GnT-V可能对于胃癌的发生发展有一定的影响。     

MicroRNA expression signature in gastric cancer

Objective: To identify the miRNA specific signature as novel diagnostic and prognostic tools for gastric cancer. Methods: miRNAs expression profiling of 3 normal gastric tissues, 24 malignant tissues, gastric cancer cell SGC7901 and normal gastric cell GES-1 were detected using microarray technology. The hierarchical clustering algorithm of the Cluster software was used to analyse the miRNAs expression of all samples. The expression levels of miR-433 and miR-9 which were significantly down-regulated in gastric cancer tissues and SGC7901 cells by microarray technology were validated by quantitative Real-time PCR (qRT-PCR).Results: Differential expressions of 26 individual miRNAs between normal samples (including 3 normal gastric tissues and GES-1 cells) and carcinomas (including 24 malignant tissues and SGC7901 cells) were discovered,19 of them showing down-regulation and 7 up-regulation in carcinoma samples. Hierarchical clustering of the cancer samples by their miRNA expression accurately separated the carcinomas from normal samples and further their histotypes of carcinomas. The expression levels of miR-433 and miR-9 were significantly down-regulated in gastric cancer tissues and SGC7901cells Conclusion: The differential expression of miR-433 and miR-9 may be used as a novel diagnostic tool for gastric cancer.     

KLF8在缺氧诱导胃癌细胞多药耐药中的作用

目的:探讨KLF8（Kruppel-like factor 8）在缺氧诱导胃癌细胞多药耐药表型中的作用。方法:利用Western blot和实时定量PCR的方法检测三株胃癌细胞系MKN28、MKN45、SGC7901在常氧及缺氧条件下KLF8的表达水平。Western blot和实时定量PCR检测胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR、SGC7901/ADR和亲本细胞系SGC7901中KLF8的表达水平。构建KLF8正义表达载体及KLF8小干扰RNA的慢病毒载体,将其转染入实验细胞中,用Western blot和实时定量PCR的方法检测KLF8表达量的变化。MTT、Annexin V/PI染色法及阿霉素蓄积量与潴留实验检测KLF8在缺氧诱导胃癌细胞多药耐药表型中的作用。结果:缺氧可诱导胃癌细胞系MKN28、MKN45、SGC7901中KLF8的表达升高。与胃癌亲本细胞系相比,KLF8在胃癌耐药细胞系中的表达升高,并且在SGC7901/VCR细胞中表达升高的更为明显。外源性转染KLF8后可显著增加胃癌细胞中KLF8的表达量,KLF8小干扰RNA可有效降低常氧及缺氧条件下胃癌细胞中KLF8的表达。常氧条件下,外源性转染KLF8的正义表达载体可增加胃癌细胞对不同化疗药物的耐受性,降低化疗药物诱导的胃癌细胞凋亡指数,同时可增加细胞内阿霉素的泵出率。缺氧条件下,KLF8小干扰RNA能够逆转胃癌细胞中上述现象的发生。结论:初步实验结果发现了一个新的缺氧反应分子-KLF8。表型试验证实该分子在缺氧诱导胃癌多药耐药中发挥作用。     

Methylation of miR-129-5p CpG island modulates multi-drug resistance in gastric cancer by targeting ABC transporters

Recent studies have reported that hyper-methylation in the promoter region of miRNAs could silence the expression of tumor suppressive miRNAs and might play significant roles in the process of tumor development. However, the potential mechanisms regarding how methylation of miRNA CpG Island could regulate cancer cell chemo-resistance have not yet been studied. Using microarray and BSP (Bisulfate Sequencing PCR) assays, we found that compared with the parent SGC7901/VCR cells, expression of miR-129-5p was restored in SGC7901/VCR gastric cancer multi-drug resistant cell line treated by de-methylation reagent (5-AZA-dC). Using gain or loss of function assays, we found the over-expressed miR-129-5p reduced the chemo-resistance of SGC7901/VCR and SGC7901/ADR cells, while down-regulation of miR-129-5p had an opposite effect. Furthermore, three members of multi-drug resistance (MDR) related ABC transporters (ABCB1, ABCC5 and ABCG1) were found to be direct targets of miR-129-5p using bioinformatics analysis and report gene assays. The present study indicated that hyper-methylation of miR-129-5p CpG island might play important roles in the development of gastric cancer chemo-resistance by targeting MDR related ABC transporters and might be used as a potential therapeutic target in preventing the chemo-resistance of gastric cancer.     

Expression of delayed rectifier potassium channels and their possible roles in proliferation of human gastric cancer cells

Voltage-gated potassium (Kv) channels have been reported to be involved in the proliferation of many types of cells, including tumor cells. The overexpression of the Kv channels and related channel activity are involved in the neoplastic process. Our previous study has shown the existence of delayed rectifier potassium (I(K)) current in gastric cancer cells SGC7901. However, the expression and function of most delayed rectifier potassium (K(D)) channel subunits in gastric cancer cells are not completely resolved. Here we examine expression of K(D) channel subunits in Kv1-Kv3 families in immortalized gastric epithelial cells GES and various gastric cancer cells (including AGS, KATOIII, MKN28, MKN45, MGC803, SGC7901, SGC7901/ADR and SGC7901/VCR), and their roles in cell proliferation. RT-PCR analysis reveals that all cell lines examined express Kv1.3, Kv1.5, Kv1.6, Kv2.1 and Kv2.2. However, Kv1.2 and Kv3.2 genes are barely detectable in any given cancer cell lines. Kv1.5 protein, high mRNA levels in all cell lines examined, is also expressed in some cancer cells lines and more frequently detected in gastric cancer tissues. Downregulation of the expression of Kv1.5 in SGC7901 with RNA interference significantly inhibited the proliferation and tumorigenicity of SGC7901 cells. Moreover, in Ca(2+)-containing rather than Ca(2+)-free medium, KCl (50mM) stimulated a rapid increase in the concentration of cytosolic calcium in empty vector transfected cells that was blocked by verapamil. Likewise, decrease the expression of Kv1.5 with short interfering RNA also blocked the depolarization-induced influx of Ca(2+). This finding suggests that more than one kind of K(D) channel subunits are expressed in various gastric cancer cell lines. Kv1.5 may be involved in tumor cells proliferation by controlling Ca(2+) entry, and the interference of K(D) channels expression and/or activity could provide a novel strategy to reverse the malignant phenotype of gastric cancer cells.     

miR-103与胃癌多药耐药作用机制探讨

目的 既往研究肿瘤耐药均集中在DNA水平,而DNA又影响mRNA及蛋白质表达.但是mRNA与编码蛋白质的表达并不成比例,而非编码RNA恰好能解释两者之间的不平衡.非编码RNA即微小RNA(microRNA,miRNA),是一类内源性短链非编码小分子核糖核苷酸,长度约18~25个核糖核苷酸,是转录后基因表达调节的关键分子,参与胃癌的发生发展.本研究旨在探讨miR-103在胃癌多药耐药中作用及其分子机制.方法 miRNA芯片筛选SGC7901/ADR及SGC7901细胞差异表达miRNA,应用qRT-PCR验证miR-103表达;将miR-103的拟似物及抑制物分别转染SGC7901/ADR及SGC7901细胞,MTT法检测转染前后对多柔比星敏感性变化;蛋白质印迹法检测miR-103对caveolin-1表达的影响.结果 miR-103在SGC7901/ADR细胞中表达(0.32±0.04)显著低于SGC7901细胞.miR-103拟似物转染SGC7901/ADR细胞后对多柔比星的敏感性较对照组显著提高,IC50由(18.83±0.32) μg/mL下降到(4.54±0.29) μg/mL,t=1.04,P<0.05;而miR-103抑制物转染SGC7901细胞后对多柔比星的敏感性显著降低,IC50由(1.65±0.03) μg/mL上升到(15.27±0.26) μg/mL,t=1.25,P<0.05.miR-103靶向作用于caveolin-1的3'-UTR,并在转录后水平负向调控caveolin-1表达.结论 miR-103通过靶向负调控caveolin-1表达,增加SGC7901/ADR细胞对多柔比星敏感性,从而逆转胃癌多药耐药.