人线粒体核糖体蛋白S17 cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达和纯化

目的克隆人MRPS17cDNA,并在大肠杆菌中表达纯化。方法从人原代培养毛乳头细胞中分离总RNA,采用RTPCR及序列测定等方法获得人MRPS17cDNA,然后克隆至原核表达载体pET28a,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;C末端融合了6×His纯化标签的表达产物行Western印迹法分析并用Ni2 NTA离子交换树脂进行纯化;纯化蛋白行SDSPAGE纯度分析。结果获得了人MRPS17cDNA,与GenBank报道的序列一致,并成功构建了高效原核表达质粒pET28aMRPS17;Western印迹结果表明,经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达了分子量约13kD的目的蛋白;表达产物经Ni2 NTA离子交换树脂纯化,纯度>90%。结论克隆得到了人MRPS17cDNA,并在E.coli中成功表达和纯化了MRPS17蛋白,为后续研究奠定了基础。     

重组人α-半乳糖苷酶A在CHO细胞中的表达及鉴定

目的 构建重组人α-半乳糖苷酶A(GLA)真核表达载体,并在中华仓鼠卵巢细胞CHO中表达重组的人GLA.方法 利用RT-PCR方法从人肝癌细胞中克隆人GLA cDNA,并构建到哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1/myc-His A中.将重组质粒转染CHO细胞并用G418筛选.用丁酸钠诱导G418抗性细胞,检测培养上清中的GLA活性,筛选高表达GLA的细胞株.采用HisTrapTM FF纯化培养上清中的GLA蛋白并利用Western 印迹进行鉴定.结果 成功构建了哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1/myc-His A-GLA,并在中华仓鼠卵巢细胞CHO中表达,得到高表达量的单克隆(蛋白比活为1935 U/mg).纯化后的培养上清在50×103(Mr)附近出现单一条带,通过Western 印迹确定为GLA蛋白.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.1/myc-His A-GLA,获得了具有生物活性的重组人GLA,为临床上治疗法布莱病奠定了一定基础.     

Acrp30基因的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达

目的 :克隆人Acrp30基因 ,并在大肠杆菌中表达。方法 :提取人脂肪组织总RNA ,经RT_PCR扩增目的cDNA片段 ,进行核苷酸序列分析 ;将该基因克隆入原核表达载体pQE_30 ,在大肠杆菌M15中表达 ,用Ni2 + 固相化的螯合SepharoseFastFlow亲和层析纯化重组蛋白 ;并用Western印迹检测所制备多克隆抗体的特异性。结果 :从人脂肪组织总RNA中扩增得到 736bp的目的cDNA ,其序列与已报道的序列完全一致 ,并在大肠杆菌中成功获得高水平表达 ,蛋白相对分子质量大约为 30× 10 3,其表达量占菌体总蛋白的 15 %左右。重组蛋白经Ni2 + 固相化的螯合SepharoseFastFlow亲和层析纯化 ,纯度 >90 %。Western印迹试验证实所制备多克隆抗体具有较高特异性。结论 :本研究为进一步探讨Acrp30在肥胖症和糖尿病患者中的表达情况以及Acrp30的作用机制奠定基础     

人CDK7基因真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建带Myc标签的细胞周期蛋白依赖性激酶7（cyclin－dependent kinase 7, CDK7）的真核表达载体,获得其表达产物,并验证该激酶与已知相互作用蛋白P53之间的相互作用。方法应用PCR技术从人乳腺文库中扩增出CDK7全长编码区基因,将其克隆到pXJ－40载体中;继而重组质粒转染人胚肾293 T细胞,以SDS－PAGE和Western印迹鉴定表达情况;免疫共沉淀检测Myc－CDK7与FLAG－p53的相互作用。结果双酶切和基因测序鉴定显示,Myc－CDK7真核表达质粒克隆构建成功;SDS－PAGE和Western印迹结果表明,Myc－CDK7转染人胚肾293T细胞后成功表达;免疫共沉淀显示,重组Myc－CDK7与已知相互作用蛋白P53在蛋白质水平上具有相互作用,证实其具有生物学活性。结论成功构建Myc－CDK7的真核表达载体,为进一步探讨Myc－CDK7对细胞周期的调控奠定了实验基础。     

人转化铁受体基因的克隆和表达

目的探讨人转化铁受体基因（hTfR）克隆和高效表达的方法及临床意义。方法用RT-PCR法从人胚肝、肺组织中克隆hTfR基因，构建重组表达质粒pcDNA3-hTfR和pEGFP-C1-hTfR，转染人胚肾上皮HEK293细胞。用Western印迹法检测pcDNA3-hTfR转染HEK293细胞后hTfR蛋白的表达情况；用荧光显微镜和共聚焦荧光显微镜观察重组pEGFP-C1-hTfR质粒转染HEK293细胞后hTfR蛋白的表达水平及亚细胞定位。结果经过DNA测序证实，克隆的hTfR基因为全长cDNA序列（2332bp）。Western印迹法检测到转染细胞能有效表达190×10^3的hTfR蛋白，荧光显微镜和共聚焦荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白（GFP）-hTfR融合蛋白主要定位于细胞膜。结论从人胚肝、肺组织中可以成功克隆hTfR基因，该基因转染HEK293细胞后可获得hTfR蛋白的高效表达。hTfR主要定位于细胞膜。     

人NR1靶片段的原核表达

目的 :克隆人N_甲基_D_门冬氨酸受体 (NMDAR ,NR)靶片段cDNA ,构建其原核表达载体并建立相应的表达体系。方法 :用常规RT_PCR法从脑肿瘤切除组织中克隆人NR1靶片段cDNA ,测序鉴定后构建其原核表达载体 ,并在大肠杆菌DH5α中升温诱导表达 ,表达产物通过SDS_PAGE分析及免疫印迹分析进行鉴定。结果 :成功克隆了人NR1靶片段 4 89bp长cDNA ,测序结果与文献报道一致 ,原核表达载体在宿主菌中诱导表达后得到了NR1蛋白靶片段的高效表达产物 ,占全菌体 15 %～ 30 %。SDS_PAGE及免疫印迹分析与预计相同。结论 :人NR1靶片段可通过改构设计在原核体系中获得高效表达     

RT-PCR法扩增人锰超氧化物歧化酶cDNA的克隆及其核苷酸序列测定

从人肝细胞提取总RNA,以此为模板进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),制备出人锰超氧化物歧化酶(hMnSOD)的cDNA片段.将此cDNA克隆入专为装载PCR产物而构建的质粒载体pGEM-T中.对重组质粒进行限制酶切分析和序列测定.结果表明,该克隆片段与国外报道的hMnSOD cDNA序列一致.表达蛋白的工作正在进行之中.     

凋亡相关斑点样蛋白ASC真核表达质粒的构建及表达

目的构建凋亡相关的斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC）真核表达质粒。方法从人胚肾细胞系HEK293T细胞的总RNA中经过逆转录和PCR获得ASC的全长cDNA双链片段,经过酶切后连接到真核表达载体pcDNA3/flag中,挑选出转化生成的阳性克隆测序,将序列正确的重组质粒命名为pcDNA3/flag-ASC。脂质体转染pcDNA3/flag-ASC质粒到HEK293T细胞中,用Western印迹检测目的蛋白的表达。同时用免疫沉淀和免疫印迹方法检测ASC蛋白与前半胱天冬酶（pro-caspase）-1的相互作用,并用ELISA方法检测ASC蛋白对IL-1β分泌的影响。结果 Western印迹实验证明pcDNA3/flag-ASC可以在HEK293T细胞中表达ASC,并且可以与pro-caspase-1结合,使IL-1β分泌明显降低。结论构建了重组质粒pcDNA3/flag-ASC,在细胞中表达ASC后具有与pro-caspase-1结合的能力,并具有降低IL-1β分泌的生物活性。     

人PD-1分子基因克隆及其在COS-7细胞中表达的研究

目的：克隆人PD—1分子的编码序列cDNA，将其重组进真核表达载体中，并表达于COS—7细胞。方法：从活化的人T细胞cDNA文库中以PCR方法克隆编码人PD—l的编码cDNA序列，将其克隆进真核表达载体pcDNA3．1( )，构建成重组表达载体。并测序证实。用脂质体法转染COS—7细胞，流式细胞仪检测PD—1分子的膜表达。结果：PCR方法扩增出—880bp左右的基因片段，插入pcDNA3．1( )载体后构建成重组表达质粒，经测序证实扩增的片段为人PD—l编码序列。将重组质粒转染COS—7细胞，流式细胞仪检测显示有21．10％的细胞表达人PD—1分子。结论：本研究为进一步研究PD—1分子在免疫耐受、自身免疫性疾病中的作用奠定了基础。     

人前列腺干细胞抗原的原核表达、纯化及鉴定

目的 构建包含人前列腺干细胞抗原(PSCA)的原核表达质粒,并进行诱导表达、蛋白纯化及鉴定.方法 通过PCR扩增人PSCA基因片段,与过渡载体pGEM-T Easy连接后进行测序鉴定,鉴定正确后,将PSCA基因片段酶切并插入含有谷胱甘肽s-转移本科GST标签的原核表达载体pET42a,得到重组质粒pET42a-PSCA.将pET42a-PSCA转化大肠埃希菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达GST-PSCA融合蛋白,用Glutathione-Sepharose 4B柱对融合蛋白进行纯化,纯化产物进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定.结果 PSCA基因的PCR产物大小与预期相符,测序结果与GenBank 中的PSCA序列一致.pET42a-PSCA原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE及Western blotting检测显示融合蛋白诱导表达成功,分子量大小约为43kD.结论 成功构建了人PSCA的原核表达质粒,能在BL21菌株中表达,且纯化后得到较高纯度的GST-PSCA融合蛋白,为后续抗前列腺癌基因疫苗研究奠定了基础.     

人黑色素浓集激素1型受体真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建人黑色素浓集激素1型受体(MCHR1)真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测MCHR1的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达了目的基因.结论 真核表达载体的构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR1功能奠定了良好的实验基础.     

人源抗-HAV全分子抗体在CHO细胞中的表达

目的 :构建人源抗_HAV全分子抗体的CHO细胞表达体系。方法 :将抗_HAV抗体轻链全分子 (信号肽与VL_CL)基因克隆至表达载体pCI_neo中 ;将重链信号肽、重链 (γ)VH_CH1 和Fc基因进行重组形成重链全分子基因 ,再将其克隆到真核表达载体pCdhfr1中。将轻、重链全分子表达载体共转染CHO dhfr_细胞 ,用G_4 18和甲氨蝶呤(MTX)筛选细胞克隆 ,ELISA法检测细胞培养上清中的抗_HAV活性 ,增加MTX浓度进行加压筛选。用蛋白L亲和层析柱从培养上清中纯化重组抗体。结果 :构建的真核表达载体可实现抗_HAV全分子抗体在CHO细胞中的分泌表达 ,纯化的重组抗体在还原SDS_PAGE中表现为相对分子质量约 2 5 0 0 0、5 0 0 0 0两条带 ;Western印迹表明 ,重组抗体全分子和重链分子均可和羊抗人Fc抗体发生特异性免疫反应。结论 :抗_HAV全分子抗体在CHO细胞中表达 ,为基因工程生产具有完整功能的全分子抗体奠定了基础     

融合His标签的HCV包膜糖蛋白E2的真核表达及意义

目的 构建HCV包膜糖蛋白E2与His标签融合的真核表达载体并在CHO细胞中表达,为研究HCV包膜糖蛋白的功能奠定基础。方法 利用PCR技术从HCV基因组序列中扩增出编码HCV包膜糖蛋白E2的基因,将其插入原核表达载体pET28(a)载体中,构建pET28(a)-HCVE2,从pET28(a)-HCVE2上获得His-HCVE2融合基因,插入pcDNA3．1,构建表达HCV包膜糖蛋白E2与His标签融合蛋白的真核表达载体pcDNA3．1-His-E2。用脂质体介导法将pcDNA3．1-His-E2转染CHO细胞,通过间接免疫荧光、Western blot检测融合蛋白在CHO细胞内的表达。结果 转染HCVE2与His融合基因的真核表达载体的CHO细胞内声融合蛋白的表达。结论 与His标签融合的HCV包膜糖蛋白E2能够在CHO细胞内表达。     

具有多种剪接形式的RNA结合蛋白基因的克隆、表达及其细胞内定位

目的：构建具有多种剪接形式的RNA结合蛋白（RBPMS）基因的真核表达载体,并在真核细胞中进行表达,确定RBPMS在细胞中的定位.方法：采用PCR技术,从人卵巢文库中扩增RBPMS基因的完整编码序列,将所扩增基因克隆到带FLAG标签的真核表达载体上,转染人胚肾细胞293T,Western印迹鉴定RBPMS的表达.然后将所扩增基因克隆到带绿色荧光标签的pEGFP-C1表达载体上,转染乳癌细胞ZR75-1,观察RBPMS在细胞中的定位情况.结果：经限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定构建的重组表达载体正确,Western印迹实验证明RBPMS表达成功,通过激光共聚焦显微镜观察,RBPMS分布在胞质中,在40%～50%细胞中RBPMS呈聚集状分布.结论：成功构建了RBPMS基因的真核表达载体,该基因产物分布在胞质中,在40%～50%细胞中RBPMS呈聚集状分布.     

纤连蛋白的分段表达及与乙肝表面抗原相互作用研究

目的:克隆纤连蛋白(fibronectin)各功能区域基因,在大肠杆菌中表达以筛选与HBsAg相互作用的区域.方法:将纤连蛋白分成7个片段,设计引物,利用RT-PCR从HepG2.2.15中扩增出相应的PCR产物,连接到表达载体pGEX4T-1中,用IPTG诱导目的蛋白在E.coli中表达,通过Western印迹分析对表达产物进行鉴定.融合蛋白纯化后制备蛋白芯片,与HBsAg杂交,筛选纤连蛋白中与HBsAg相互作用的区域.结果:经RT-PCR从HepG2.2.15中扩增到各结构域片段的cDNA,序列分析均正确;SDS-PAGE分析表明,各结构域片段的可溶性表达产物均占细菌可溶性蛋白的10%以上;Western印迹分析提示,诱导表达产物可与GST单抗发生特异性反应.经制备蛋白芯片并杂交,发现片段FN1、FN2信号最强.结论:成功地表达了纤连蛋白各片段,蛋白芯片杂交结果显示纤连蛋白可能是通过Ⅱ型肝素结合区及其羰基端(c端)与HBsAg相互作用.     

东部马脑炎病毒E2基因的克隆与表达

目的 :克隆表达东部马脑炎病毒 (easternequineencephalomyelitisvirus ,EEEV)E2基因 ,研究重组蛋白的抗原性 ,为研制东部马脑炎病毒基因工程诊断试剂奠定基础。方法 :由病毒感染的鼠脑制备总RNA ,利用RT_PCR技术扩增EEEVE2基因全长序列 ,并将其克隆至pGEM_Teasy载体测序 ,再将E2基因克隆至谷胱甘肽转移酶 (GST)融合表达载体pGEX_5x_2中表达。采用免疫印迹试验 (Westernblotting)和ELISA法分析表达的重组蛋白的抗原性。结果 :经过RT_PCR扩增和测序 ,证明得到的E2基因片段的序列是正确的 ,并且在原核载体中得到表达 ,目的蛋白占总菌体蛋白的 2 4 .5 % ,主要以包涵体形式存在。Western印迹分析表明GST_E2蛋白有良好的抗原性 ;包涵体经Tri tonX_10 0 ,1mol L和 2mol L尿素洗涤 ,初步纯化后 ,用表达的E2融合蛋白作为包被抗原初步建立了间接ELISA法 ,结果表明与兔抗EEEV血清起特异反应 ,但与兔抗WEEV血清无交叉反应。结论 :东方马脑炎病毒的E2基因在大肠杆菌中得到稳定表达 ,表达的GST_E2蛋白具有良好的抗原性和特异性 ,为从分子水平上对EEEVE2蛋白的功能性研究和发展EEEV基因工程诊断试剂奠定了基础     

人DOC-2氨基端PID结构域酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活鉴定

目的：获得人DOC-2氨基端磷酸酪氨酸作用结构域（PID）cDNA基因，构建酵母双杂交诱饵载体，并检测对报告基因的激活作用。方法：PCR扩增含人DOC-2编码区的全长cDNA片段，克隆入诱饵载体pGBKT7，再亚克隆得到含PID结构域的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-nDOC2。将重组质粒导入酵母菌AHl09，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用。结果：成功构建人DOC-2氨基端磷酸酪氨酸作用结构域（PID）酵母双杂交诱饵载体，该段基因表达的蛋白对酵母菌AH109既无毒性，对报告基因也没有激活作用。结论：我们可利用构建的酵母双杂交诱饵载体来钓取人DOC-2氨基端PID结构域的相互作用蛋白，以利于对DOC-2基因功能进行研究。     

人前列腺癌相关基因pc—1表达产物在细胞内的定位研究

目的：研究pc-l基因表达产物在细胞内的定位。方法：采用巢式PCR技术,从原始克隆质粒中扩增出可编码蛋白分子的pc-l cDNA片段,分别将其克隆入含EGFP和MYC标签的真核表达载体中;用脂质体介导法将其转染入人前列腺癌细胞C4－2中;通过免疫细胞化学方法和激光共聚焦显微镜技术检测pc-l表达产物在细胞内的定位。结果与结论：pc-l表达产物定位于细胞质中,为进一步研究其生理、生化功能奠定了基础。     

人类维甲酸受体α的克隆表达

目的：构建人类维甲酸受体α基因的高效表达系统。方法：提取人肝组织总RNA，RT-PCR扩增Retinoid X receptor α（RXRα）的cDNA。将其克隆入原核表达载体pETDuet-1，构建重组表达载体pETDuet-1／RXRα。将已构建好的表达载体pETDuet-1／RXRα重组质粒转化大肠杆菌BL21，异丙基硫代-8-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达，Western Blot鉴定表达产物。结果：重组载体pETDuet-1／RXRα经限制性核酸内切酶BglⅡ和AatⅡ双酶切鉴定，得到符合预期大小的核酸片段。SDS-PAGE可见与预期大小相符的蛋白条带，Western Blot证实该条带即为RXRα。并对重组质粒pETDuet-1／RXRα在BL21菌株的表达效率进行评价，目的蛋白占菌体总蛋白的百分比为65．8％。结论：成功建立了pETDuet-1／RXRα的高效表达系统。     

高迁移率族蛋白B1cDNA的克隆与表达

目的克隆人高迁移率族蛋白B1（HMGB1）cDNA,构建重组原核表达载体,对其诱导表达并鉴定,为设计HMGB1 cDNA突变体及诱导表达可竞争性抑制HMGB1炎症效应的突变体蛋白奠定基础。方法提取人新鲜扁桃体组织总RNA,经RT-PCR扩增出人HMGB1 cDNA序列,并克隆至载体pUC18进行序列测定,随后构建于原核表达载体pQE-80L中,经IPTG诱导4小时后,可表达Mr约30 000的蛋白。Western Blotting鉴定所表达的目的蛋白。结果经RT—PCR扩增得到了648bp的cDNA,经序列分析与GenBank中报道的已知序列完全一致,构建了HMGB1蛋白的重组表达质粒,诱导表达了目的蛋白,经Western Blotting证实,在Mr约为30000处有一条清楚的蛋白带。结论获得了HMGB1 cDNA的克隆与原核表达载体。