肺癌细胞中survivin与P53的相关性

目的:观察survivin特异性小干扰 RNA (small interference RNA, siRNA)对P53野生型和P53 缺失型肺癌细胞株的生长抑制作用， 分析肺癌细胞中survivin 与 mP53的相关性 。 方法 ：以化学合成的survivin siRNA转染 P53野生型肺癌细胞株A549和P53缺失型肺癌细胞株H1299，用MTT 法检测转染前后肺癌细胞的增殖情况，流式细胞术分析细胞周期和凋亡的改变，半定量 RTPCR 检测转染对survivin mRNA表达的影响，Western blotting 检测survivin、 PARP、 P21、 P53等蛋白表达的变化。 结果：siRNA转染前A549 细胞中survivin表达量明显低于 H1299 细胞(P<0.05)。 Survivin siRNA 转染组两种细胞 survivin 蛋白及 RNA 表达水平均显著低于对照组和无关干扰组(P<0.01)。Survivin siRNA 对 A549 和 H1299细胞生长抑制作用均呈浓度依赖性(P<0.05)，但对H1299细胞的抑制起效晚于A549，且抑制程度低于A549细胞。转染后 A549和 H1299 细胞均有 G1 期比例增加和 S 期比例相应地减少，H1299 细胞的变化更为显著。 A549 细胞有一定比例出现凋亡，PARP 发生了裂解，P53、 P21蛋白表达增加，而H1299 细胞中上述指标的变化却不明显。 结论：P53野生型 A549细胞内源性survivin表达明显低于P53缺失型H1299细胞；抑制survivin能上调P53蛋白表达，其对A549细胞的生长、凋亡和P21等蛋白表达的影响明显强于H1299细胞；提示survivin与P53之间可能存在着相互抑制作用。     

Survivin-siRNA抑制肺癌A549细胞的增殖并增强其对顺铂的敏感性

目的：构建靶向存活素（survivin）的干扰RNA（siRNA）质粒,观察其对A549细胞增殖、凋亡以及顺铂敏感性的影响。方法：应用pSilencerU6质粒构建survivinsiRNA干扰质粒,RTPCR和Western blotting检测survivin mRNA和蛋白的表达,DAPI染色法检测细胞的凋亡,MTT法检测细胞的增殖。结果：成功构建了survivinsiRNA干扰质粒。SurvivinsiRNA质粒转染可明显下调A549细胞中survivin mRNA和蛋白的表达、抑制A549细胞的增殖、促进细胞的凋亡、增强A549细胞对顺铂的敏感性。结论：SurvivinsiRNA沉默survivin在肺癌细胞中的表达能够抑制肿瘤细胞的增殖、促进细胞凋亡,并能增强肿瘤细胞对化疗药物顺铂的敏感性,survivin 可作为肺癌治疗的潜在靶点。     

基因促进TRAIL诱导乳腺癌MCF 7细胞的凋亡

目的:研究抑制促分裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶激酶3(mitogenactivated protein/extracellular signal regulated kinasekinase 3,MEKK 3)基因表达促进TRAIL诱导乳腺癌MCF7细胞凋亡的作用，寻找乳腺癌临床治疗新策略。方法：应用MTT法检测人TRAIL对MCF7细胞生长的抑制作用。合成MEKK3siRNA，应用脂质体介导MEKK3siRNA转染入人乳腺癌细胞MCF7，以RTPCR和Western blotting法检测MCF7细胞MEKK 3 mRNA和蛋白的表达。应用MTT法和流式细胞术检测MEKK3siRNA与TRAIL联合处理后MCF7细胞的增殖和凋亡。结果：TRAIL具有抑制MCF7细胞增殖作用，但其抑制作用较弱。MEKK3siRNA转染后能有效而稳定地抑制MCF7细胞中 MEKK3 mRNA和蛋白的表达(P<0.01)。TRAIL与MEKK3siRNA联合处理MCF7细胞较TRAIL单独处理更明显地抑制细胞增殖活力(P<0.05)，更明显地增加细胞凋亡率(P<001)。结论：siRNA沉默 MEKK3基因能显著促进TRAIL对乳腺癌MCF7细胞凋亡的诱导作用，为探讨乳腺癌治疗新方案提供了实验依据。     

奥曲肽对紫杉醇抑制非小细胞肺癌细胞的增效作用

目的: 探讨生长抑素类似物奥曲肽（octreotide）对紫杉醇抑制非小细胞肺癌细胞的增效作用及其可能的机制。方法: RTPCR检测非小细胞肺癌细胞株A549和H157 生长抑素受体（somatostatin receptor, SSTR）1～5 mRNA的表达；检测不同时间和浓度梯度的奥曲肽对两株细胞的抑制率，光镜下观测奥曲肽作用后细胞形态学的变化；MTT法检测奥曲肽与紫杉醇对两细胞株增殖的抑制是否具有协同作用；采用流式细胞仪检测奥曲肽、紫杉醇以及两者联合作用时A549细胞的凋亡率;荧光实时定量PCR检测奥曲肽作用后细胞多药耐药相关基因的改变。结果: A549细胞检测到SSTR1～SSTR5 mRNA的表达，而H157细胞只有SSTR1和SSTR4 mRNA的表达。奥曲肽对A549细胞增殖具有抑制作用并具有时间（24、48、72 h）和浓度(1～1 000 nmol/L)依赖性，在光镜下可观测到细胞细胞受损伤的形态学改变；而对H157细胞无抑制作用。对于A549细胞，125、250、500 nmol/L奥曲肽作用48 h可明显增加其对紫杉醇化疗的敏感性（P<0.01）,并能诱导细胞凋亡，但未增加与紫杉醇联合作用后细胞的凋亡率；而对H157细胞，奥曲肽未发现化疗增敏作用。奥曲肽可下调A549细胞多药耐药相关基因MDR1、MRP1的表达(P<0.05, P<0.01)，而对H157细胞多药耐药相关基因的表达无影响。结论: 奥曲肽可提高SSTR受体阳性的非小细胞肺癌细胞对紫杉醇的敏感性，下调多药耐药相关基因的表达是其可能的机制之一。     

延龄草总皂苷调控hsa_circ_0025033/miR-149对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响

目的:研究延龄草总皂苷对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞A549增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。方法:将不同浓度的延龄草总皂苷作用于A549细胞,应用实时定量PCR检测hsa_circ_0025033和miR-149的表达,应用双荧光素酶基因系统验证hsa_circ_0025033与miR-149的靶向关系。分析干扰hsa_circ_0025033表达对A549细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。结果:延龄草总皂苷可抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡,下调hsa_circ_0025033表达,上调miR-149表达(P＜0.05)。干扰hsa_circ_0025033可抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡(P＜0.05)。hsa_circ_0025033可靶向结合miR-149,干扰hsa_circ_0025033表达可上调miR-149表达(P＜0.05)。过表达hsa_circ_0025033逆转延龄草总皂苷对A549细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响(P＜0.05)。结论:延龄草总皂苷能够抑制NSCLC细胞A549增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡,可能与调节hsa_circ_0025033/miR-149通路有关。     

肺癌细胞中survivin与P53的相关性

目的：观察survivin特异性小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）对P53野生型和乃3缺失型肺癌细胞株的生长抑制作用，分析肺癌细胞中survivin与乃3的相关性。方法：以化学合成的survivinsiRNA转染丹3野生型肺癌细胞株A549和P53缺失型肺癌细胞株H1299，用MTF法检测转染前后肺癌细胞的增殖情况，流式细胞术分析细胞周期和凋亡的改变，半定量RT—PCR检测转染对survivinmRNA表达的影响，Westernblotting检测survivin、PARP、P21、P53等蛋白表达的变化。结果：siRNA转染前A549细胞中survivin表达量明显低于H1299细胞（P〈0．05）。SurvivinsiRNA转染组两种细胞survivin蛋白及RNA表达水平均显著低于对照组和无关干扰组（P〈0．01）。SurvivinsiRNA对A549和H1299细胞生长抑制作用均呈浓度依赖性（P〈0．05），但对H1299细胞的抑制起效晚于A549，且抑制程度低于A549细胞。转染后A549和H1299细胞均有G1期比例增加和S期比例相应地减少，H1299细胞的变化更为显著。A549细胞有一定比例出现凋亡，PARP发生了裂解，P53、P21蛋白表达增加，而H1299细胞中上述指标的变化却不明显。结论：P53野生型A549细胞内源性survivin表达明显低于P53缺失型H1299细胞；抑制survivin能上调P53蛋白表达，其对A549细胞的生长、凋亡和P21等蛋白表达的影响明显强于H1299细胞；提示survivin与P53之间可能存在着相互抑制作用。     

基因在肺腺癌A549细胞中的表达及其对细胞生长的抑制

目的: 研究外源性分化抑制因子3（Inhibitor of differentiation 3,Id3）基因表达对人肺腺癌细胞系A549细胞生长的抑制作用。方法：构建Id3和EGFP的融合基因表达载体pEGFP/Id3,采用脂质体转染技术将pEGFP/ Id3导入A549细胞。FCM分析转染细胞EGFP表达效率，荧光显微镜观察EGFP表达情况；半定量RTPCR、免疫细胞化学分析转染后A549细胞 Id3 mRNA和蛋白的表达。MTT法检测转染后A549细胞生长抑制情况，FCM分析A549细胞周期进程，Annexin V/7AAD和Hoechst33258染色检测转染后细胞的凋亡情况。结果:成功构建人Id3与EGFP融合基因表达载体pEGFP/Id3；荧光显微镜和FCM观察到EGFP的有效表达，转染48~72 h时EGFP表达率最高；Id3 mRNA及蛋白在转染后的A549细胞中能有效表达。转染后48 h和72 h，pEGFP/Id3转染组A549细胞生长受到明显抑制（P<0.01）；细胞周期分析表明，pEGFP/Id3转染组G0/G1期细胞显著高于对照组（P<0.05）; Annexin V/7AAD双染结果显示，pEGFP/Id3转染组细胞的早期凋亡率\[（10.67±2.60）%\]显著高于pEGFP组\[（3.39± 2.21）%\]和未转染组\[（2.35 ± 0.95）%\]（P<0.05）；Hoechst33258染色结果也证实pEGFP/Id3组A549细胞出现明显凋亡形态特征。结论:外源性Id3基因在肺腺癌A549细胞中的表达能抑制细胞增殖,并诱导细胞凋亡。     

Survivin HLA-A2+高亲和性CTL表位的预测及鉴定

目的: 比较bcl2、白介素6（interleukin6,IL6）、白介素6受体(interleukin6 receptor,IL6R)反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸（antisense phosphorothiate oligodeoxynucleotide, ASPSODN)对小细胞肺癌细胞株NCIH446细胞增殖及诱导凋亡的作用,初步探讨反义核苷酸技术治疗中靶基因的选择策略。方法：合成反义寡脱氧核苷酸bcl2 ASPSODN、IL6 ASPSODN、IL6R ASPSODN,分别作用于NCIH446细胞株,通过细胞克隆形成实验检测细胞增殖活性的变化,细胞凋亡线粒体流式检测及DNA倍体分析检测细胞凋亡,半定量RTPCR检测相关基因表达水平的变化。结果：（1）bcl2 ASPSODN、IL6 ASPSODN、IL6R ASPSODN均能够抑制肺癌细胞增殖活性和诱导细胞凋亡,其中以IL6 ASPSODN抑制作用最强, bcl2 ASPSODN次之, IL6R ASPSODN作用最弱。（2）3种反义寡脱氧核苷酸均能下调肺癌细胞相应基因的表达水平,其中以IL6下调幅度最大,达(84.1±5.01）%; bcl2和IL6R基因下调幅度相近,分别为(62.6±3.42）%和(60.3±4.45）%。（3）反义核苷酸作用后除了引起自身基因表达下调外,还伴对其他基因表达的调节作用,如IL6 ASPSODN作用使bcl2基因表达下调(32.2±020）%;而bcl2 ASPSODN作用使IL6基因表达上调(74.3±413）%。 结论：IL6 ASPSODN较bcl2 ASPSODN和IL6R ASPSODN能更有效地诱导小细胞肺癌细胞凋亡,IL6是NCIH446小细胞肺癌反义核苷酸治疗较为合适的靶基因。     

慢病毒介导bcr/abl基因RNAi对白血病K562细胞生物学特性的影响

目的: 研究慢病毒介导RNAi致bcr/abl基因长期沉默对K562白血病细胞各种生物学特性的影响。方法：构建含bcr/abl RNAi序列的pNLB/AEGFP慢病毒重组质粒载体并包装病毒,感染K562细胞,挑取稳定转化的克隆（B/AK562）。Realtime PCR及Western blotting验证干扰效应;锥虫蓝染色、集落形成实验检测细胞增殖能力变化;联苯胺染色观察细胞分化;ELISA法检测酪氨酸激酶活性;AOEB染色观察细胞凋亡;比色法检测Caspase3、Caspase9活性;以上检测均以K562细胞和转染空质粒EGFPK562作对照。结果：成功构建bcr/abl基因RNAi稳定转染的B/AK562细胞, Realtime PCR及Western blotting证实B/AK562细胞中bcr/abl mRNA及P210bcr/abl蛋白含量明显下调。bcr/abl基因稳定下调后,K562细胞倍增时间明显延长（37.1 vs 20.4、23.3 h）、集落形成能力减弱（P<0.01）,K562细胞向红系分化,酪氨酸激酶活性下降（P<0.01）,自发凋亡率显著提高（P<0.01）,细胞中Caspase3（P<0.05）及Caspase9（P<0.01）活性明显提高。结论：慢病毒介导的RNAi能实现bcr/abl基因长期沉默,从而抑制K562细胞恶性增殖,诱导其分化及凋亡。     

p53通过促进miR-145的表达抑制肺腺癌A549细胞的干细胞特性

目的： 探讨P53 抑制肺腺癌A549细胞干细胞特性及其机制。方法： 收集2014年3月至2015年12月解放军第85医院胸外科手术切除的30例非小细胞肺癌（non-small cell lung carcinoma, NSCLC）患者癌组织及癌旁组织,采用Real-time PCR检测NSCLC组织和癌旁组织中miR-145的表达。构建人P53 基因的真核表达载体（pcDNA3.1-P53）和突变载体\[pcDNA3.1-P53 R273H(CGT-CAT)\],设计靶向P53基因的siRNA,分别转染A549细胞;细胞分为对照转染组（Vector或NC-siRNA）和实验组（Flag-P53或P53-siRNA）;Western blotting检测P53蛋白过表达和干扰效率,Real-time PCR检测OCT4和miR-145的表达,荧光双报告基因和Western blotting技术检测证实A549细胞中干细胞多能性调节基因（OCT4）为miR-145的靶标分子。结果： NSCLC组织中miR-145的表达水平明显低于癌旁组织\[(2.31±0.13) vs (3.51±0.27),P<0.01\];P53明显促进A549细胞中miR-145的表达\[(1.84±0.14) vs (1.00±0.00),P<0.01\];miR-145 mimics显著抑制A549细胞中pGL3-OCT4-3′-UTR活性(P<001)和OCT4蛋白表达水平(P<0.05),而转染miR-145抑制剂可进一步增加OCT4表达水平,且逆转P53对A549细胞的干细胞特性的抑制作用。结论：P53通过促进miR-145表达下调OCT4表达,进而明显抑制A549细胞的干细胞特性,该结果为肺腺癌的临床诊断和治疗提供了新途径。     

Inhibition of activated K-ras gene by sirna expression cassettes in human pancreatic carcinoma cell line MIAPaCa-2

Objective: To construct the small interfering RNA(siRNA) expression cassettes (SECs) targeting activated K-ras gene sequence and investigate the effects of SECs on K-ras gene in human pancreatic cancer cell line MIAPaCa-2. Methods: Three different sites of SECs were constructed by PCR. The K1/siRNA, K2/siRNA and K3/siRNA were located at the site 194, 491 and 327, respectively. They were transfected into MiaPaCa-2 cells by liposome to inhibit the expression of activated K-ras. In the interfering groups of site 194, 491, we observed the cytopathic effect of confluent MiaPaCa-2 cells after they were incubated for 48 hours, and detected the apoptosis in cells by FACS, then we tested the alternation of K-ras gene in confluent MiaPaCa-2 cells by RT-PCR, immunofluorescence and western blot, respectively. Results: Introductions of the K1/siRNA and K2/siRNA against K-ras into MiaPaCa-2 cells led to cytopathic effect, slower proliferation and increased apoptosis, while the appearances of control MiaPaCa-2 cells remained well. The number of apoptotic cells increased compared with control cells. RT-PCR, immunofluorescence and western blot showed the effects of inhibited expression of activated K-ras gene by RNA interference in the K1/siRNA and K2/siRNA groups. We also found that the introduction of K3/siRNA had no effect on MiaPaCa-2 cells. Conclusion: K1/siRNA and K2/siRNA can inhibit the expression of activated K-ras and decrease the growth of MiaPaCa-2 cells, while K3/siRNA has no such effect, demonstrating that the suppression of tumor growth by siRNA is sequence-specific. We conclude that K-ras is involved in maintenance of tumor growth of human pancreatic cancer, and SECs against K-ras expression may be a powerful tool to be used therapeutically against human pancreatic cancer.     

靶向同源盒A10特异性干扰性小RNA序列的筛选及功能鉴定

 【摘要】　目的　筛选有效干扰同源盒（HOX）A10基因表达的特异性干扰性小RNA（siRNA）序列并鉴定其功能,为利用RNA干扰技术靶向HOXA10防治肿瘤提供实验依据。方法　设计合成3对针对HOXA10基因不同位点的siRNA序列,应用阳离子脂质体介导转染人肺腺癌A549细胞,采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测HOXA10 mRNA表达,以HOXA10与β-actin灰度比值（ODR）表示相对表达水平。筛选出抑制HOXA10效果最佳的siRNA序列,应用四甲基偶氮唑盐（MTT）和流式细胞术分别检测该siRNA干扰HOXA10后对A549细胞增殖和凋亡的影响。结果　3对siRNA均能抑制HOXA10的表达,其中siRNA1抑制HOXA10 mRNA的表达最为明显,ODR为（20.190±1.698）%;siRNA1对A549细胞的增殖抑制率可达（69.793±2.092）%;siRNA转染后细胞凋亡率显著提高,siRNA1诱导A549凋亡作用最为明显,凋亡率为（29.593±2.670）%。结论　筛选出的siRNA1序列可有效沉默HOXA10基因的表达,并能有效抑制A549细胞增殖、促进其凋亡。     

抗MDM2小干扰RNA对辐射诱导A549肺癌细胞死亡的影响

背景与目的 在辐射反应不同的肺癌细胞A549和NCI—H446中，照射后MDM2的表达模式是明显不同的，这可能与细胞的辐射抗性有关。本研究的目的是利用靶向MDM2的小干扰RNA（smallinter—feringRNA，siRNA）验证MDM2对A549细胞辐射反应的影响。方法 利用pPUR／U6载体构建针对MDM2的质粒，采用Lipofectamine^TM 2000脂质体转染A549细胞，通过RT—PCR和Westernblot检测转染细胞MDM2表达情况，通过流式细胞仪观察转染细胞受5Gy照射后的细胞死亡情况。结果成功构建了两个抗MDM2的质粒。细胞转染72h后MDM2在A549细胞中的表达明显降低。转染siRNA后，辐射诱导的A549细胞死亡明显增加。结论MDM2可能参与了A549细胞辐射抗性的形成，靶向MDM2的siRNA可以增加辐射诱导的A549细胞死亡。     

siRNA沉默 TLR4 表达对人肺腺癌A549细胞增殖和侵袭的影响

【摘要】目的:探讨靶向TLR4基因的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)对人肺腺癌细胞A549增殖和侵袭的影响。方法：设计并合成针对TLR4基因的3条siRNA(siRNA₇₂₂、siRNA₁₆₇₃和siRNA₂₅₆₀)及1条与TLR4基因无同源性的阴性对照siRNA,用Real-time PCR方法测定干扰后A549细胞上TLR4 mRNA的表达水平,筛选出有效抑制靶基因表达的siRNA并确定最佳转染时间;采用TLR4特异性siRNA(TLR4-siRNA)转染A549细胞,CCK-8法和Transwell小室法分别检测A549细胞的增殖和侵袭能力。结果：与阴性对照相比siRNA₁₆₇₃在转染48h后对TLR4基因的抑制最为明显,TLR4-siRNA转染后A549细胞增殖活性明显下降,TLR4-siRNA组A549细胞的侵袭细胞数明显少于阴性对照组【(23.60 ± 2.88)个vs(59.80 ± 5.54)个(P<0.01)】。结论：TLR4-siRNA能沉默A549细胞中TLR4基因的表达,抑制A549细胞的增殖和侵袭,TLR4可能成为肺癌基因治疗的候选靶点。     

洋地黄毒苷对肺癌NCI-H446与A549细胞增殖和周期的影响

目的： 探讨洋地黄毒苷对肺癌NCI-H446与A549细胞增殖和细胞周期的影响,并初步探讨其可能的作用机制。方法：体外培养的NCI-H446与A549细胞分别经不同浓度(10、20、40、80、160 nmol/L)的洋地黄毒苷处理24、48和72 h后,采用MTT法检测细胞增殖情况,应用流式细胞术检测洋地黄毒苷处理细胞48 h后各组细胞周期分布,Western blot检测细胞中Cyclin A和P21蛋白表达水平。结果：与未经洋地黄毒苷处理的对照组相比,不同浓度(10、20、40、80和160 nmol/L)的洋地黄毒苷均可抑制 NCI-H446与A549细胞的增殖, 均呈剂量和时间依赖性(P<0.05),作用48 h后,洋地黄毒苷对NCI-H446与A549细胞的IC50值分别为61.26 nmol/L和110.73 nmol/L。流式细胞仪分析结果显示,随药物作用浓度增加,G0/G1细胞比例降低,S期细胞比例显著增加,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot分析结果显示,洋地黄毒苷能剂量依赖性的下调Cyclin A1蛋白表达和上调P21 蛋白的表达(P<0.05)。结论：洋地黄毒苷可抑制体外培养的肺癌NCI-H446与A549细胞增殖,诱导细胞发生S期阻滞,其机制可能与细胞周期相关调控蛋白的表达有关。     

Slp2反义真核表达载体的构建及功能研究

背景与目的 肺癌相关基因的研究一直是研究的热门课题，S1p2基因是通过cDNA微阵列技术筛选出的肺癌差异表达基因之一，本研究旨在对S1p2基因在肺癌细胞系中的表达及其功能进行初步研究。方法 提取肺癌细胞系A549、GLC-82、NCI-H446、NCI-H460的细胞总RNA，用RT-PCR方法检测肺癌细胞系中S1p2基因mRNA水平的表达；构建S1p2反义基因，通过离子脂质体将克隆的S1p2反义基因导入肺癌细胞系GLC-82、NCI-H446、NCI-H460，用半定量RT-PCR检测转染目的基因对肺癌细胞系S1p2表达的影响；通过四唑盐比色法绘制细胞生长曲线以及流式细胞分析、软琼脂细胞克隆形成试验，观测转染S1p2反义基因对肺癌细胞系GLC-82、NCI-H446、NCI-H460生长速度、细胞周期以及细胞增殖能力的影响。结果 在4个肺癌细胞系中，S1p2基因均为阳性表达；转染S1p2反义基因后的肺癌细胞系GLC-82、NCI-H446、NCI-H460的细胞生长速度明显减慢；在流式细胞分析直方图上表现为G2期的细胞增多，并曾在转染目的基因的NCI-H446细胞流式直方图中观察到了位于G0／G1期左侧的“亚Gt峰”的出现；转染S1p2反义基因后肺癌细胞系的软琼脂培养细胞克隆形成率明显低于未转染细胞。结论 S1p2基因与肺癌细胞的生长、增殖力密切相关，有必要进行深入研究和探讨。     

Small interfering RNAs targeting mutant K-ras inhibit human pancreatic carcinoma cells growth in vitro and in vivo

AIM: To investigate the effect of small interfering RNAs targeting mutant K-ras on the growth of pancreatic carcinoma cell lines in vitro and in vivo. MATERIALS AND METHODS: We cloned targeting sequence spanning codon 12 of mutant K-ras into the pSilencer-hygro plasmid, yielding two recombinant vectors with one base different. Both human pancreatic carcinoma cell lines were transfected by these two recombinant vectors. The transfected PC-7 cells were injected subcutaneously into nude mice to observe its tumorigenicity. RT-PCR and Western blot analysis were carried out to test the expression of K-ras in all of the transfected cell lines. Growth curves assay were performed to test the abilities of cells proliferation. Anti-K-ras therapy of PC-7 and Panc-1 in subcutaneous mice models were performed by intratumor injection of polyethylenimine/siRNAs complex. RESULTS: The expressions of K-ras in PC-7 cells and Panc-1 cells were significantly inhibited by corresponding small interfering RNAs. The expression of K-ras was particularly inactivated by siRNA without any base mismatch to its homologous mRNA, while this oncogene with central base mismatch could not be inhibited as effectively as that of the former. The growth of PC-7 cells and Panc-1 cells transfected by corresponding mutant K-ras targeted siRNAs were significantly suppressed when compared with controls (p<0.05). The transfected PC-7 cells lost tumorigenic ability. Four weeks treatment of Xenograft of pancreatic carcinoma (PC-7 and Panc-1) in nude mice with Polyethylenimine-encapsulated mutant K-ras targeted siRNAs (20 microg/mouse twice weekly) were effective in reducing tumor growth, when compared with controls (p<0.05). CONCLUSION: The central base may play a key role in the process of RNA interference. The mutant point and its vicinity of 19 nucleotides in K-ras may be the effective targeting sequence for RNA interference. Targeting mutant-k-ras therapy of pancreatic carcinoma may be a clinically applicable therapeutic modality.     

小分子干扰RNA特异性抑制人胰腺癌细胞株PANC-1突变型K-ras基因表达的探讨

目的:研究小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对人胰腺癌细胞株PANC-1中突变型K-ras基因表达的抑制作用.方法:构建真核表达载体pSilencer3.1-K-rasv12,转染PANC-1细胞后应用RT-PCR及Western blot检测突变型K-ras基因mRNA及蛋白质表达变化;噻唑蓝(MTT)测定细胞生长曲线;流式细胞仪测定细胞凋亡率.结果:测序证实siRNA真核表达载体构建成功.RT-PCR光密度比值结果空载体组、阴性对照组、实验组分别为:95.3%±2.5%、97.6%±2.8%、40.1%±3.1%,差异有统计学意义(P＜0.05);Western blot灰度比值结果空载体组、阴性对照组、实验组分别为:96.1%±2.2%、98.5%±2.0%、36.5%±3.2%,差异有统计学意义(P＜0.05);实验组细胞生长受到明显抑制,凋亡率较对照组明显升高(P＜0.05).结论:pSilencer3.1-K-rasv12能有效抑制突变型K-ras基因在人胰腺癌细胞株PANC-1中的表达,抑制细胞生长,诱导细胞凋亡,为肿瘤的生物学治疗提供了新的方法.     

血管内皮生长因子C过表达或抑制表达对人小细胞肺癌NCI-H446细胞生物学行为的影响

目的:探讨血管内皮生长因子C (vascular endothelial growth factor C,VEGF-C)对人小细胞肺癌细胞株NCI-H446生长、体外侵袭和细胞凋亡的影响.方法:构建VEGF-C过表达慢病毒质粒pHRi-VEGF-C和小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)慢病毒表达质粒pHRi-siVEGF-C,经慢病毒包装后分别感染NCI-H446细胞.蛋白质印迹法检测VEGF-C的表达水平,MTT方法检测细胞增殖活性,Transwell实验检测细胞体外侵袭能力,FCM检测细胞凋亡比例.结果:与空载体对照组相比,pHRi-VEGF-C质粒感染入NCI-H446细胞后VEGF-C基因表达水平显著升高,而pHRi-siVEGF-C质粒感染后VEGF-C基因表达水平显著降低.pHRi-VEGF-C质粒感染第5天后,NCI-H446细胞增殖(D值=1.481±0.056)明显高于pHRi-siVEGF-C组(D值=0.838±0.035)和空载体对照组(D值=1.146±0.07),差异有统计学意义(P＜0.05); pHRi-siVEGF-C组中每个视野侵袭的细胞平均数为39.78±0.77,显著低于pHRi-VEGF-C组的84.87±1.27和空载体对照组的60.82±1.05,差异有统计学意义(P＜0.01).感染了pHRi-VEGF-C质粒后的NCI-H446细胞凋亡数较空载体对照组减少约90％,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:VEGF-C过表达可以显著促进NCI-H446细胞增殖,增强其侵袭能力,抑制细胞凋亡;而VEGF-C表达经RNA干扰后可以显著减缓细胞的增殖趋势,降低NCI-H446细胞的侵袭能力.推测VEGF-C可能成为临床治疗小细胞肺癌的基因治疗靶点之一.     

靶向VEGF的不对称siRNA抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖

目的:探讨靶向血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因的siRNA对乳腺癌MCF-7细胞的抑制效果。方法:设计靶向VEGF的4种小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),包括对称siRNA(siRNA21/21,siRNA23/23)与不对称siRNA(asymmetric siRNA,aiRNA;aiRNA21/23,aiRNA19/21)。siRNA转染入MCF-7细胞后,MTT及流式细胞术检测MCF-7细胞增殖及凋亡情况,RT-PCR、ELISA法检测MCF-7细胞中VEGF基因和蛋白的表达。结果:与对照组相比,aiRNA21/23、siRNA23/23、aiRNA19/21、siRNA21/21这4种siRNA都能有效抑制VEGF mRNA的表达[(71.4±5.01)%、(40.0±3.11)%、(37.2±2.79)%、(11.1±0.99)%vs(2.4±0.11)%,P<0.01],且抑制MCF-7细胞的增殖[(44.7±5.38)%、(38.5±5.67)%、(33.6±2.18)%、(33.1±3.18)%vs(2.2±0.28)%,P<0.01],其中以不对称aiRNA21/23的抑制效果最明显。与对照组比较,aiRNA21/23显著促进MCF-7细胞的凋亡[(49.9±4.02)%vs(4.7±0.91)%,P<0.01]。结论:靶向VEGF基因的siRNA可抑制MCF-7细胞的增殖、促进细胞凋亡,尤以不对称siRNA的效果最明显。