PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分支杆菌rpoB,katG,ahpC基因突变的研究

目的：应用PCR－SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分支杆菌rpoB,katG及ahpC基因突变,评价此方法用于结核分杆菌利福平（RFP）及异烟肼（INH）耐药性试验的意义。方法：以结核分支杆菌H37Rv为对照,30例耐RFP（单耐或多耐）、21例耐INH（单耐和多耐）的结核分枝杆菌临床分离株及10例敏感菌株;39例菌阳肺结核患者及30例非结核 性肺部疾病患者痰标本,采用PCR－SS－CP技术检测痰标本和菌株中的结核杆菌rpoB,katG,ahpC基因突变,并与药敏试验对照。结果：PCR－SSCP检测痰标本中结核分支杆菌rpoB,katG及ahpC基因突变的阳性率分别为79％（31／39）、46％（18／39）及5％（2／39）.结论：PCR－SSCP可望成为直接检测临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平及耐异烟肼的快速方法。     

单管半套式PCR-SSCP用于结核分支杆菌rpoB基因突变的研究

目的 ①证明单管半套式聚合酶链反应(PCR)是检测结核分支杆菌的特异性方法;②研究结核分支杆菌rpoB基因突变与利福平耐药性的关系。方法 设计三条针对结核分支杆菌的特异性引物,采用单管半套式PCR-单链构象多态性(SSCP)方法对结核分支杆菌、其它分支杆菌和富含GC碱基的细菌进行分析。结果 ①结核分支杆菌标准菌株H_(37)Rv和55株临床分离株均扩增出一条193bp片段,其特异性为100％,敏感性约为10pgDNA;15株非结核分支杆菌和8株富含GC的细菌均未得到扩增;②55株结核分支杆菌临床分离株193bp扩增片段SSCP图谱特点:以H_(37)Rv为对照,15株利福平敏感株均无区别;40株耐药株除6株外其余34株SSCP图谱有明显区别,检测阳性率为85％。结论 单管半套式PCR检测结核分支杆菌简便、敏感、特异,结合SSCP可检出耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变,此突变与利福平耐药关系密切。     

结核分支杆菌耐喹诺酮分子机制的研究

目的了解结核分支杆菌耐喹诺酮药物的分子机制，建立快速的药敏的方法。方法通过16S rRNA聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR—SSCP)技术分析77株分支杆菌临床分离株；通过PCR—SSCP和直接测序技术(PCR—DS)分析结核分支杆菌的gyrA基因突变的情况。结果75株为结核分支杆菌复合群。以结核分支杆菌标准菌株H37Rv和卡介苗为对照．30株喹诺酮敏感株的gyrA基因的SSCP图谱均泳动正常，测序分析与对照株相同。45株耐喹诺酮的菌株中，34株(75．6％)gyrA基因SSCP图谱泳动异常；测序证实10株为90位密码子的突变，24株为94位密码子突变，所有gyrA突变株的氧氟沙星4μg／ml≤MICs≤32vg／ml，左氧氟沙星2μg／ml≤MICs≤16vg／ml。结论gyrA基因突变，尤其90位和94位密码子突变是结核分支杆菌耐喹诺酮的主要分子机制，PCR—SSCP可能成为测定部分结核分支杆菌喹诺酮耐药基因型的简便、快速的方法，并有望直接用于临床标本喹诺酮敏感性试验。     

结核分支杆菌链霉素耐药基因的杂交检测

目的探讨结核分支杆菌对链霉素（Sm）的耐药分子机制,评估应用PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术检测rpsL、rrs基因突变在结核分支杆菌对链霉素耐药性测定中的应用价值。方法采用PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术对55株结核分支杆菌临床分离株（其中药物敏感株23株,耐INH或含耐,INH耐多药株32株）和25例耐SM肺结核患者痰标本的rpsL、rrs基因突变进行检测。结果以结核分支杆菌H37RV为对照,23株药物敏感株的rpsL、rrs基因突变率分别为4.3%、0。32株耐链霉素分离株中,21株rpsL基因发生突变,突变率为65.6%;4株rrs基因发生突变,突变率为12.5%。25例耐链霉素肺结核患者痰标本中,rpsL基因18例扩增阳性、rrs基因14例扩增阳性,其基因突变检测率分别为50.0%、7.2%。结论rpsL、rrs基因突变是INH耐药性的重要分子机制。PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术可以快速、准确地检测结核分支杆菌rpsL、rrs基因突变,该技术有望直接用于临床标本耐药性检测。     

结核分支杆菌耐乙胺丁醇分离株embB基因测序

目的 探讨结核分支杆菌对乙胺丁醇(EMB)产生耐药性的分子机制，建立直接快速检测结核分支杆菌EMB药物敏感性的实验方法。方法 采用PCR扩增技术对5株耐乙胺丁醇结核分支杆菌进行PCR扩增，扩增产物经纯化后，直接在ABI 377型全自动测序仪上进行DNA测序分析。结果 5株EMB耐药株的embB基因测序有4株发现点突变，其中Met(ATG)→Lle(ATA)1例，Met(ATG)→Lle(ATC)1例，Met(ATC)→Lle(ATT)1例，Met(ATG)→Val(GTG)1例，另外1株EMB耐药株的embB基因测序未发现突变位点。结论 embB 306位氨基酸Met被置换是结核分支杆菌对乙胺丁醇产生耐药性的重要机制，测序分析可确认耐药基因的突变位点，是快速检测耐乙胺丁醇结核菌的有效方法。     

结核分支杆菌耐药结果分析

结核病是国家重点控制的传染病之一,尤其是耐多药结核病的出现已成为结核病疫情上升和难以控制的一个重要原因。随着结核病的蔓延,人们越来越重视其治疗,了解和掌握结核分支杆菌的耐药性是保证治愈结核病的一个关键问题,而实验室的药物敏感性试验数据给临床提供了有力的证据,对治疗结核病，治愈结核患者起着重要的作用。     

临床肺结核患者非结核分支杆菌分离及其分析

目的 探讨河南省临床肺结核患者非结核分支杆菌（NTM）分布、耐药情况及临床特点。方法 对2001年7月～2002年6月河南省结核病耐药监测中痰分支杆菌培养阳性的1581株菌株用TCH和PNB进行菌型初步鉴定;采用比例法对四种抗结核药物：INH,RFP,EMB和SM进行药敏试验,并对分离出NTM的21例患者临床资料进行分析。结果 临床肺结核患者痰NTM分离率为1．33％;耐药率为90．5％;耐多药率为76．2％;主要症状依次为咳嗽、咳痰,发热,咯血等;病灶多累及2个及以上肺野。结论 河南省NTM处于较低流行水平;由于特殊人群中HIV／AIDS的流行,对NTM感染和NTM病应予高度重视。     

江门市1994年～1999年结核分支杆菌初始耐药性观察

目的了解江门市l 994年～1 999年结核分支杆菌初始耐药性.方法采用绝对浓度法进行4种抗结核药物的耐药性测定.结果耐SM、INH、EMB和RFP率由1 994年的1 9.4%、15.3%、1 3.3%和6.1%下降至1999年的10.9%、8.6%、7.0%和4.7%;总耐药率由25.5%下降至14.1%;耐1种药、2种药、3种药和4种药的耐药率分别由9.2%、7.1%、6.1%和3.1%降至4.7%、3.9%、3.1%和2.3%;同时耐INH和RFP率,1 994年为4.1%,1 999年为3.1%.结论江门市结核分支杆菌初始耐药性6年来呈下降趋势,但耐多药菌株仍占一定比例.     

江门市1994年—1999年结核分支杆菌初始耐药性观察

目的 了解江门市1994年－1999年结核分支杆菌初始耐药性。方法 采用绝对浓度法进行4种抗结核药物的耐药性测定。结果 耐SM、INH、EMB和RFP率由1994年的19．4％、15．3％、15．3％、13．3％和6．1％下降至1999年的10．9％、8．6％、7．0％和4．7％;总耐药率由25．5％下降至14．1％;耐1种药、2种药、3种药和4种药的耐药率分别由9．2％、7．1％、6．1％和3．1％降至4．7％、3．9％、3．1％和2．3％;同时耐INH和RFP率,1994年为4．1％,1999年为3．1％。结论 江门市结核分支杆菌初始耐药性6年来呈下降趋势,但耐多菌株仍占一定比例。     

结核分支杆菌耐药基因的杂交检测

目的采用PCR-反向斑点杂交检测结核分支杆菌中rpoB基因、KatG基因和rpsL基因突变。评价该方法检测结核分支杆菌利福平（RFP）、异烟肼（INH）和链霉素耐药性,探讨直接检测结核患者痰标本的可行性。方法用PCR-反向斑点杂交技术分析对75株临床分离株和45例肺结核患者涂阳痰标本进行rpoB、rpsL和KatG基因突变的检测。结果临床耐药株分离株进行rpoB、rpsL和KatG基因突变的检测,其突变率分别为83.9%、62.5%、57.1%。肺结核患者涂阳痰标本中耐药株突变率分别为81.0%、60.0%、52.9%。结论rpoB基因、KatG基因和rpsL基因突变与结核分支杆菌耐利福平、异烟肼和链霉素密切相关,应用PCR-反向斑点杂交技术可快速检测结核分支杆菌对异烟肼、链霉素和利福平耐药性。PCR-反向斑点杂交技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的重要方法之一。     

3种耐药结核分枝杆菌检测及临床应用

目的探讨耐链霉素(SM)、利福平(RFP)、异烟肼(INH)结核分枝杆菌rpsL、rpoB、KatG3种基因突变情况及在耐药检测中临床应用的可行性。方法采用聚合酶链反应单链构象多态性(PCR-SSCP)技术对221株临床分离株,100例涂片阳性肺结核病痰标本进行rpsL、rpoB、KatG3种基因突变分析。221株临床分离株中敏感株34株,单耐SM、RFP、INH分别为32株、37株、28株,耐SH、SR、HR、SHR分别为14株、30株、8株、52株,100例痰标本耐SM、RFP、INH分别为51例、54例、40例。结果以结核分枝杆菌H37RV为对照,34株敏感株rpsL、rpoB基因SSCP图谱正常,特异性为100%,KatG基因2株SSCP图谱异常,特异性为94.1%。单耐SM、RFP、INH结核分枝杆菌rpsL、rpoB、KatG基因突变率分别为78.1%(25/32)、86.5%(32/37)、53.6%(15/28),耐多药(SM、RFP、INH)结核分枝杆菌rpsL、rpoB、KatG基因突变率分别为78.1%(75/96)、88.9%(80/90)、55.4%(41/74)。100例涂片阳性肺结核患者痰标本经PCR扩增67例阳性,直接检测耐SM、RFP、INH结核分枝杆菌rpsL、rpoB、KatG基因突变率分别为74.1%(25/35)、89.1%(33/37)、48.0%(12/25),阳性检出率分别为49.0%、61.1%、30.0%。结论耐单药和耐多药(SM、RFP、INH)结核分枝杆菌rpsL、rpoB、KatG基因突变率分别经χ2分析差别无统计学意义(P>0.05),也就是耐单药和耐多药结核分枝杆菌rpsL、rpoB、KatG基因突变率相同,耐多药结核分枝杆菌rpsL、rpoB、KatG3种基因突变相互之间无影响。PCR-SSC技术有望直接用于检测涂片阳性肺结核患者痰标本中rpsL、rpoB、KatG基因突变判定耐药,但还需在方法学上进一步改进以达到技术容易掌握、操作简便、影响因素少,结果检出率高等。     

结核分支杆菌耐药基因检测结果分析

目的 分析肺结核患者结核分支杆菌获得性耐药情况,比较两种耐药性检测方法的检测效果.方法 用药敏试验(绝对浓度法)检测结核分支杆菌株对利福平(RFP)、异烟肼(INH)、链霉素(SM)、吡嗪酰胺(PZA)和乙胺丁醇(EMB)的耐药情况,采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)检测结核分支杆菌耐药rpoB、katG、rpsL、pncA和embB基因突变.结果:400例肺结核耐药患者常规药敏试验耐药316例(79.8%);耐药基因检测耐药株288株,突变率72.0%.RFP耐药例数和耐药率明显高于SM、PZA和EMB(耐药例数:F=2.45,2.56,2.69,P＜0.05;耐药率:F=2.55,2.66,2.79,P＜0.05),rpoB突变株和突变率明显高于katG、rpsL、pncA和embB(突变株:F=2.28,2.46,3.19,3.33,P＜0.05～0.01;突变率:F=2.36,2.61,3.25,3.45,P＜0.05～0.01),高浓度药物耐药菌株的突变株和突变率显著高于低浓度药物耐药菌株,随着不规律用药时间的延长,耐药率和突变率均逐渐上升(耐药率:F=2.77,2.88,P＜0.05;突变率:F=2.72,2.85,P＜0.05).结论 PCR-SSCP是一种快速检测结核杆菌rpoB、katG、rpsL、pncA和embB基因突变敏感、特异的方法.     

基因突变与结核分支杆菌耐药性的研究进展

综述结核分支杆茵耐药分离株基因突变的规律，探讨耐药的分子机理。并通过对6例肺结核病人切除肺的组织学、免疫组织学、宿主细胞免疫反应的研究以及通过对所显示的细茵种群的描述，加深对该感染过程动态的了解。     

rpoB基因检测在结核分支杆菌感染及利福平耐药分析中的应用

目的 探讨rpoB基因检测在结核分支杆菌(Mtb)感染及利福平(RFP)耐药分析中的应用。方法 以人型复合分支杆菌特异的rpoB基因为靶基因的套式PCR(nested PCR,nPCR)扩增痰、胸水、外周血标本中的Mtb rpoB;并对7株RFP耐药的rpoB nPCR产物进行了直接DNA序列测定。结果 (1)14例痰标本9例阳性(64.3％)、4例胸水标本3例阳性(不计百分率)、176例外周血标本22例阳性(12.5％);(2)7株RFP耐药菌均存在有义突变。其中密码子516位由GAC→GTC、GAC→TAC各1例;526位由CAC→CGC2例、CAC→TAC1例;531位由TCG→TTG2例。结论 对患者临床标本进行rpoB nPCR扩增有望辅助诊断结核病,对rpoB nPCR产物直接DNA测序有望判别耐RFP与否。这将大大缩短结核病诊断和药敏试验所需时间。     

结核分支杆菌毒力相关基因mig的克隆研究

在结棱病的发生过程中，毒力其着重要的作用，因为只有毒力菌株才可致病。结棱茵的毒力可以理解为其引起结棱病的能力。而致病性与毒力因子总是联系在一起的。结棱茵是典型的胞内寄生茵，但只有有毒株才能在细胞内存活和繁殖。可以推测毒力因子在毒力株的巨噬细胞复制中起关键作用，而目前对毒力因子的分子机制一毒力相关基因知之甚少。为了在分子水平了解毒力因子的作用机制，我们克隆了与结棱分支杆菌在巨噬细胞内复制有关的基因mig(macrophage induced gene)，以期在分子水平研究结棱分支杆茸的致病机理。     

40例非结核分支杆菌肺病的临床分析

目的了解非结核分支杆菌(NTM)肺病对一线抗痨药物的耐药情况,探讨NTM肺病反复发作的原因。方法在本研究所2003-2008年间876例分支杆菌培养阳性的病例中,经鉴定确诊为NTM肺病的资料完整的40例病例进行回顾性分析。结果40例患者中多数对一线抗痨药物(异胭肼,利福平,链霉素)耐药,而对乙胺丁醇的敏感性较好:40例患者中既往"肺结核"病史较长,平均6年,最长达15年:平均治疗次数1.86次,最长达6次。结论对于分支杆菌培养阳性的患者应及早做菌种鉴定,一经确诊应做多种药物的敏感试验,选择最佳联合治疗方案,并坚持全程化疗。     

快速检测结核分支杆菌对利福平的耐药性

目的：建立快速检测结核分支杆菌耐药基因型的分子药敏试验方法。方法：用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析结核分支杆菌rpoB基因突变并与药敏试验对照。结果：116株结核分支杆菌的PCR-SSCP图谱与H37Rv为对照，81株耐药菌73株有明显区别，而35株敏感，仅1株位置有区别；检测阳性率90．1％；特异性97．1％。结论：rpoB基因突变是结核分支杆菌耐利福平的主要机理，PCR-SSCP可简便快速地检出rpoB基因的突变，有助于结核分支杆菌耐药性的快速检测和研究。     

检测结核分支杆菌方法的探讨

目前实验室常用检测结核分支杆菌的方法有三种 ,即直接涂片进行抗酸染色 ;细菌培养法和ＰＣＲ法。为探讨三种方法的灵敏度与实用性 ,同时用三种方法检测了１３０例临床怀疑为结核病患者的各种标本 ,现报道如下。１资料和方法１ １标本来源 :来自本院住院及门诊患者 ,其中痰６０份 ,胸水３０份 ,腹水２０份 ,脑脊液２０份。１ ２抗酸染色与结核培养同文献［１］。１ ３ＰＣＲ试剂盒购自华美生物工程公司 ,操作见说明书。１ ４ＰＣＲ扩增以购自上海复旦生物技术研究所型号为ＦＲ９００。２结果抗酸涂片染色法阳性率较低 ,与培养法相比 (Ｐ＜０…     

快速检测结核分支杆菌方法的比较与评价

基因直接扩增试验(DATs)以其快速、敏感性高及可靠的特异性与传统的抗酸杆菌涂片法(AFB)一样可成为“结核病”的快速诊断方法。我们选择了DATs的三种方法,包括普通聚合酶链反应(GPCR),巢式聚合酶链反应(N-PCR)和多重聚合酶链反应(M-PCR),直接扩增临床标本中结核分支杆菌的特异性基因片段与AFB法比较。