MAGE-3目的基因原核表达载体的构建和表达

目的构建原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3并检测其在大肠杆菌（E．coli）BL21中的表达，为制备以黑色素瘤抗原-3（MAGE-3）基因片段为基础的肽疫苗及特异诊断试剂提供抗原打下基础。方法通过逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法制备MAGE-3目的基因，以pGEM—T Easy为克隆载体，DGEX-4T-1为原核表达载体，将MAGE-3目的基因克隆至pGEM—TEasy载体和亚克隆至pGEX-4T-1载体上。筛选、鉴定阳性克隆并将其转化E．coli BL21．经IPTG诱导，12％SDS—PAGE电泳分离和Western Blot表达鉴定。结果正确构建了原核重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-3；在E．coli BL21中检测到含该重组表达质粒的转化菌表达出分子量35kD的融合蛋白；基因测序结果表明，阳性克隆中的MAGE-3目的基因序列与GenBank公布的已知序列完全一致。结论成功构建的原核重组表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3及其所表达的融合蛋白，为以MAGE-3目的基因为基础的肽疫苗及特异诊断试剂的研制提供抗原打下了基础；为后续实验提供了依据。     

痢疾杆菌GST-IpaH4.5载体构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建痢疾杆菌GST-IpaH4.5融合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌（E.coli）中诱导表达。方法以痢疾杆菌福氏2a 301株全基因组为模板,PCR扩增痢疾杆菌ipaH4.5基因,在ipaH4.5的上游加上BamHⅠ酶切位点,下游加上XholⅠ酶切位点,将ipaH4.5基因定向插入质粒pGEX-4T-1中,构建原核表达质粒pGEX-IpaH4.5并转化E.coliDH5α,筛选阳性重组子,限制性内切酶切鉴定和DNA序列测定,DNA序列正确后提取质粒转化E.coli BL21,筛选阳性转化子,异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达结果。结果成功构建IpaH4.5原核表达质粒pGEX-IpaH4.5并表达出大小约86 000Mr的GST-IpaH4.5融合蛋白。结论 GST-IpaH4.5融合表达载体的构建,为进一步纯化IpaH4.5蛋白和研究其在痢疾杆菌致病机制中的作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌RD1区PPE68/GST融合蛋白表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌PPE68/GST融合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌JM109中诱导表达. 方法: 利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因,并将其定向克隆pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并转化E.coli JM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.采用GST蛋白纯化试剂盒进行重组融合蛋白纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组表达产物. 结果:成功构建原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并表达出约Mr 63 000大小的PPE68/GST融合蛋白,占总菌体的40%. Western Blot检测该融合蛋白能和结核患者多价抗血清发生反应. 结论:成功地构建了原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873,并在大肠杆菌得到表达.     

PTI-1表达载体构建及在大肠杆菌中的高效表达和纯化

目的：构建表达人前列腺癌诱导基因1（PTI－1）蛋白的重组质粒，在大肠杆菌中诱导高效表达并纯化。方法：应用亚克隆PTI－1基因的pUC19/PTI-1质粒，重新构建表达载体PTI－1／pGEX4T-1，酶谱分析鉴定出正确的重组质粒，诱导表达，进行SDS－PAGE分析，应用GSH树脂纯化表达产物。结果：筛选出5个与pGEX4T-1正向重组质粒，其中一株表达一个Mr为69000的新蛋白，并以包涵体的形式存在，蛋白在宿主菌中高效表达，表达量为43．2％，纯化蛋白得到纯度为79．72％的GST／PTI－1融合表达高效表达及纯化的成功使简便获得前列腺癌诱导蛋白成为可能。     

人类8型疱疹病毒小衣壳蛋白ORF65基因的原核表达及其生物信息学分析

目的：构建人类8型疱疹病毒（HHV-8）小衣壳蛋白（ORF65）基因重组原核表达质粒并诱导表达,获得其重组融合蛋白。方法：软件设计引物,在引物两端添加特异性酶切位点,以pGEM-Teasy/ORF65为模板,PCR扩增基因序列,克隆入原核表达载体pET-41a中,构建原核表达质粒pET41a-ORF65,转化大肠杆菌（E.coli）DH5x,经酶切、测序鉴定其插入序列的正确性,转入E.coli BL21（DE3）,并诱导表达,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法以及序列分析软件DNAMAN 5.0、Vector NTI Suite 6、Primer Primier 5对表达蛋白进行生物信息学分析。结果：测序结果表明所构建pET41a-ORF65原核表达质粒连接正确,SDS-PAGE表明ORF65基因获得成功表达,生物信息学分析显示该蛋白含有1个N糖基化位点,2个蛋白激酶C磷酸化位点,4个胆碱激酶Ⅱ磷酸化位点,4个N肉豆蔻酰化位点,1个酰胺化位点。BlastP数据库的相似性检索发现有与之有较高同源性的蛋白。结论：成功表达HHV-8病毒小衣壳蛋白ORF65,该蛋白与疱疹病毒衣壳蛋白的同源性较高,是疱疹病毒衣壳蛋白家族中的一员。     

犬博卡病毒结构基因VP2多片段原核表达载体的构建及表达条件的优化

目的 构建重组pGEX-4T-3-VP2-A、pGEX-4T-3-VP2-B、pGEX-4T-3-VP2-C、pGEX-4T-3-VP2-D原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达,对诱导表达条件进行优化,为下一步获得大量纯化的融合蛋白奠定基础.方法 应用蛋白二级结构软件,设计合成MVC-VP2基因片段引物.用PCR法扩增不同长度的cDNA片段,通过EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点分别将四个不同的片段插入到pGEX-4T-3中,构建四种原核表达重组质粒,并转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷（IPTG）诱导表达,对表达条件（诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度）进行优化,并通过SDS-PAGE鉴定.结果 酶切及测序结果证明,成功构建了四种原核表达重组体质粒pGEX-4T-3-VP2-A、pGEX-4T-3-VP2-B、pGEX-4T-3-VP2-C、pGEX-4T-3-VP2-D,成功表达四种融合蛋白,优选出IPTG诱导终浓度为0.5 mmol＆#183;L-1,诱导时间为12h,诱导温度为18℃.结论 成功构建了原核表达重组体质粒pGEX-4T-3-VP2-A、pGEX-4T-3-VP2-B、pGEX-4T-3-VP2-C、pGEX-4T-3-VP2-D,优化出最佳诱导条件,为下一步获得大量纯化的目的蛋白、制备VP2多克隆抗体奠定基础.     

GST/HIF-1α(融合蛋白表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

目的 构建GST/HIF-1α融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达.方法 以质粒pcDNA3.1-HIF-1α为模板,用PCR法扩增HIF-1α全长及各个截短片段,通过BamHI和Not I酶切位点将HIF-1α全长及各个截短突变体定向插入pGEx-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-HIF-1α及其截短突变体,并转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 酶切及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-4T-2-HIF-1α及其截短突变体,并用Western blot方法证实了GST/HIF-1α全长及各个截短突变体融合蛋白的表达.结论 成功构建了HIF-1α原核表达载体及其截短突变体,并证实了融合蛋白的表达,为进一步纯化HIF-1α蛋白和研究HIF-1α的生物学功能奠定了基础.     

人CIDE-3基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的：构建人CIDE-3基因的原核表达载体，并在E．coli BL21（DE3）中表达．方法：提取人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞的总RNA，经RT—PCR扩增人CIDE-3基因片段，并将其克隆入原核表达载体pET28a（＋）中，构建重组质粒pET28a（＋）-CIDE-3.经限制性内切酶Bam H I、Xho I双酶切鉴定及序列测定后，转化E．coli BL21（DE3），经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白．     

布鲁氏菌猪种标准株外膜蛋白OMP25的原核表达

目的克隆布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因并构建基因的原核表达系统。方法用聚合酶链反应技术扩增得到布鲁氏菌基因组，得Omp25基因片段，T—A克隆后测定核苷酸序列，将目的基因定向插入原核表达载体pGEX-4T-1，经双酶切和DNA测序测定，将构建的重组质粒转化大肠杆菌（E．coli HB101，TOP10），经IPTG诱导后，用SDS—PAGE检测重组蛋白rOrap25表达情况。结果经DNA测序显示Omp25DNA序列和插入位点正确，成功构建了重组质粒DGEX-4T-1-Omp25，经IPTG诱导，特异性表达出以包涵体形式存在48kDa的Omp25融合蛋白。结论制备、克隆了布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因片段，并在大肠杆菌中表达出Omp25融合蛋白。     

小鼠可溶性PD-1的克隆、原核表达及活性分析

目的：小鼠可溶性PD-1（sPD-1）原核表达载体的构建、表达、纯化及其生物学效应初步研究。方法：应用小鼠脾细胞总RNA,采用RT-PCR克隆sPD-1基因,将其重组到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达载体pGEX-4T-1-sPD-1,转化至E.coliDH5α,筛选阳性菌落,进行酶切及测序鉴定。将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-sPD-1转化至E.coliBL21（DE3）中,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测,同时通过蛋白质纯化仪纯化GST-sPD-1融合蛋白。利用流式细胞术和Alamar Blue法,检测纯化的sPD-1融合蛋白对淋巴细胞增殖的影响,评价其生物学活性。结果：成功构建重组质粒pGEX-4T-1-sPD-1,并在E.coli BL21（DE3）中获得了成功表达,利用蛋白质纯化仪得到纯化的GST-sPD-1融合蛋白。流式细胞术和Alamar Blue法结果均显示,不同浓度的融合蛋白作用于混合淋巴细胞,与阴性对照相比,可明显促进淋巴细胞的增殖。结论：成功地克隆、表达和纯化了小鼠sPD-1蛋白,纯化的重组蛋白可有效促进淋巴细胞增殖,为进一步研究其功能和临床应用提供了条件。     

沙眼衣原体ompA基因克隆及其在真核细胞中的表达

目的克隆D型沙眼衣原体(Ct)ompA基因,构建真核表达重组质粒,转染真核细胞,为核酸疫苗的研制作准备.方法用PCR技术从D型Ct基因组DNA中扩增ompA基因片段,重组入pUCm-T克隆载体.将pUCm-T/ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,进行序列分析和酶切鉴定后,运用脂质体将重组体pcDNA3.1/ompA转染HeLa细胞,免疫组化法观察目的的基因的表达.结果从D型Ct基因组DNA中扩增出特异的ompA基因片段;序列测定证实与GenBank登陆的D型Ct一致;重组质粒pcDNA3.1/ompA在HeLa中获得表达.结论Ct ompA基因能够在体外真核细胞表达,为进一步研究Ct致病机制及DNA疫苗的研究提供理论依据.     

Ｌｉｍｓ Ｅ：一个新的ＬＩＭ同源域基因的克隆和初步分析

目的:克隆与分析小鼠不同剪切的Lims基因.方法:应用巢式RT-PCR,以小鼠cDNA为模板,扩增Lims基因不同剪切子,构入PinPointTM Xa-1T质粒,测序鉴定.结果:测序表明克隆了新的Lims基因变异剪切体Lims E,该变异剪切体编码区为1 164 bp.编码387个氨基酸.结论:比较基因组学分析显示,成功地克隆了一新的小鼠Liras基因剪切子Lims E,为进一步研究Lims基因在细胞发育中的功能打下了基础.     

哺乳动物性别决定基因的研究进展

目的了解哺乳动物性别决定基因的作用与功能。方法查阅本领域国内外文献并进行综述。结果SRY、SOX9、WT1、SF1、AMH及DAX1等基因都参与哺乳动物性别决定。结论性别决定基因的研究对性分化与发育异常等临床疾病的诊断和治疗具有十分重要的意义。     

人B7-1/Sart3融合基因的克隆和表达

目的：构建人共刺激分子CD80(B7-1)、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(Sart3)融合基因真核表达载体，并分别在原核和人成纤维细胞中表达。方法：采用RT-PCR技术，从人胎盘组织抽提的总RNA中克隆Sart3基因的部分cDNA序列(第1～1281bp)．此段序列包括已报道的能诱导HLA限制性细胞毒性T淋巴细胞的抗原表位。然后将不含终止密码子的B7-1 cDNA和Sart3 cDNA共克隆入真核表达载体pEGFP-N1，测定核苷酸序列确定重组成功后，分别转染大肠杆菌和人成纤维细胞，利用流式细胞仪和Western blot检测B7和Sart3的表达。结果：构建人B7、Sart3融合基因真核表达载体B7sart3／pEGFPN。测序结果与GenBank的B7、Sart3相应序列(NM_005191、NM_014706)一致．阅读框无改变。流式细胞仪测定发现在转染的人成纤维细胞表面有明显的荧光增强．免疫印迹发现融合蛋白可以与抗B7抗体反应，融合蛋白分子量与B7-Sart3-EGFP的预测分子量相当。结论：成功构建真核表达载体B7Sart3／pEGFPN，并在人成纤维细胞中表达。为下一步研究将SART3蛋白作为肿瘤疫苗应用于骨肉瘤的生物治疗打下基础。     

穿梭质粒pZH32的构建

以pS189、pSV_2gpt、pMCi5为材料,构建了以EB病毒为基础,以酪氨酸tRNA琥珀突变校正基因SupF为靶基因,以黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因Eco gpt为选择标记基因的穿梭质粒pZH32。pZH32长9.4kb,克服了以SV40为基础的穿梭质粒自发突变率高以及宿主范围局限的缺点。SupF基因遗传背景清楚,长度126bp,便于进行序列分析。gpt基因使转化克隆的筛选更加方便。有利于建立一种化学诱变剂的分子检测系统,研究基因突变的类型和突变机制。     

GFP-pl6融合基因表达载体的构建

本文报道了以ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）基因为报告基因，ｐｌ６基因为目的基因，将ｐｌ６基因分别插入ＧＦＰ基因的上游和下游，构建成ＧＦＰ－ｐｌ６融合基因表达载体ｐＣｐｌ６Ｇ和ｐＣＧｐ１６，并通过酶切、电泳技术对重组体进行了鉴定。该表达载体的构建成功为开展ｐｌ６转基因动物模型的建立及其特性研究奠定了基础     

Rh(-)献血者128例基因分型

目的：探讨Rh(-)献血者RhD基因分型的临床意义。方法：采用PCR－－SSP技术检测郑州市128例Rh（－）献血者的RhD基因结构，用氯仿／三氯甲烷法放散检测D^u检测，结果：RhD基因多态性存在3种基本形式，其中外显子完整存在32例（25．00％），全部为D^u型，完全缺失85例（66．41％），部分缺失11例（8．59％），其中2例为D^u型。结论：RhD基因的丰富多态性对于确保输血安全具有指导意义。     

肿瘤特异性报告基因载体的构建

目的：将构建一种能在肿瘤组织中进行肿瘤行异性表达的逆转录病毒载体，增强肿瘤基因治疗的靶向性。方法：PCR法获得HER2基因的启动子片段并将其克隆至逆转录病毒载体P^LXSN中，再将突变型绿色荧光蛋白（mtGFP)基因克隆至该启动子下游。结果：质粒P^LHSN经EcoR I和BamH I酶切后可切出510bp和5.8kb两条片段；质粒P^LHGSN经BamH I酶切可切出520bp和6.7kb两条片段。结论：成功构建了携带HER2基因启动子和mtGFP报告基因的逆转录病毒载体。     

慢性胃炎胃粘膜上皮细胞中bax、fas、p16基因的表达

目的:探讨bax、fas和p16在胃粘膜病变发生发展过程中的作用及意义.方法:应用免疫组织化学方法,检测慢性浅表性胃炎(CSG)和轻、中、重度慢性萎缩性胃炎(CAG)患者胃粘膜上皮细胞中bax、fas(促凋亡基因)和p16(增殖负调控基因)基因蛋白的表达情况.结果:CSG和轻、中、重度CAG胃粘膜中bax的表达率分别为41.75%、72.41%和78.26%,fas的表达率分别为39.81%、65.52%和78.26%,p16的表达率分别为9.71%、24.14%和30.43%.轻、中、重度CAG与CSG比较,bax、fas、p16的表达差异有显著性意义P<0.05～0.01.轻、中、重度CAG间比较,差异无显著性意义.结论:bax、fas和p16的高表达,使得细胞增殖/凋亡的比例失衡,在胃粘膜病变的发生发展中可能有重要意义.     

应用RNA干扰抑制目的基因在小鼠体内表达

目的研究RNA干扰(RNAi)对体外和体内基因表达的沉默作用。方法以PCR方法从基因组DNA中克隆出依赖于RNA聚合酶Ⅲ的H1启动子,并用于驱动RNAi片段的合成;构建特异性针对目的基因(绿色荧光蛋白,GFP)的RNAi载体(Pi)。将RNAi干扰载体和GFP载体转染NIH3T3细胞,应用荧光显微镜观察、RT-PCR、流式细胞技术(FACS)分析上述细胞中RNAi对目的基因GFP表达的抑制效果,进一步在个体水平将RNAi载体注入小鼠体内,研究RNAi对GFP表达的抑制情况。结果RNAi能有效地使NIH3T3细胞中GFP表达量降低约60%以上,并能有效地抑制GFP在转基因小鼠体内的表达。结论RNAi技术能抑制目的基因在体内外的表达,是一种有效的基因治疗工具。