精子发生相关新基因KLHL-10在无精子症及少弱精子症患者中突变筛查分析

目的:探讨精子发生相关新基因KLHL-10突变与无精子症及少、弱精子症之间的关系。方法:收集临床上不明原因的、非阻塞性无精子症及少、弱精子症患者(分别为11例、196例和118例)共325份外周血标本以及100份正常生育男性的外周血标本,抽提其DNA,采用PCR技术、变性高效液相色谱技术以及测序等手段对全部DNA样本进行KLHL-10基因的突变筛查。结果:在少精子症患者组及正常生育男性组中各发现1例及3例在1号外显子有C88→A的新的杂合突变,系同义突变;在少精子症患者组、弱精子症患者组及正常生育男性组中各检出3例、1例及4例在2号外显子有C424→A的新的杂合突变,也系同义突变;尚未发现有该基因的错义突变或微缺失。结论:KLHL-10基因错义突变或微缺失不是引起本组无精子症及少、弱精子症患者的主要致病原因,该基因在男性不育症的诊断价值有待进一步确定。     

维吾尔族和汉族弱精子症病人精子mtDNA4977bp缺失相关性研究

目的探讨维吾尔族和汉族弱精子症病人精子mtDNA~(4977bp)缺失的相关性。方法本文采用聚合酶链反应(PCR)技术对60例标本分两组,维、汉各30例,其中精子活力正常标本(对照组)和弱精子症患者(观察组)各15例进行了精子线粒体DNA(mtDNA)缺失的研究。结果发现15例做内对照的维族精子活力正常人中仅有3例(20%)有mtDNA~(4977bp)缺失；而15例维吾尔族弱精子症患者中有10例(67%) mtDNA~(4977bp)缺失；两组4977bp缺失频率比较有显著性差异(P＜0．05)。15例做内对照的汉族精子活力正常标本中无mtDNA~(4977bp)缺失；15例汉族弱精子症患者中有12例(80%)mtDNA~(4977bp)缺失。两组4977bp缺失频率比较差异有显著性(P＜0．05)。同时发现维吾尔族男性不育症与汉族男性不育症mtDNA~(4977bp)缺失频率无显著性差异。结论维吾尔族和汉族mtDNA~(4977bp)缺失在弱精子症的发病中可能起重要作用。     

陕西地区不明原因无精子症和少精子症患者Y染色体长臂微缺失分析

目的: 评估陕西地区不明原因无精子症和少精子症不育男性患者Y染色体长臂微缺失的频率,探讨精子密度与Y染色体微缺失发生率的相关性。　方法: 以Y染色体特异性无精子症因子区STS AZFa、AZFb、AZFc和SRY4个基因 5个片段设计引物,采用PCR方法对 64例无精子症和少精子症患者以及 20例正常生育男性进行微缺失检测,并比较不同精子密度患者Y染色体微缺失的发生率。　结果: 20例精子密度正常的生育男性未检出Y染色体微缺失,而 64例特发性无精子症 /少精子症患者AZFc区的缺失率为17. 2% (11 /64),AZFc和AZFb联合缺失 1例,未发现AZFa区缺失,SRY基因均为阳性。其中无精子症组缺失率为21. 43% ( 3 /14 );精子密度 <1×106 /ml组,缺失率为 20. 0% (2 /10);精子密度 (1 ~5)×106 /ml组缺失率为17. 9% (5 /28);精子密度 (5 ~10 )×106 /ml组缺失率为8. 3% (1 /12)。各组缺失率经卡方检验差异有显著性 (χ2 =70. 144,P<0. 005 )。　结论: 无精子症和少精子症不育患者Y染色体AZFc缺失率明显较高,PCR扩增AZF基因是诊断Y染色体微缺失的简单方法。     

多重连接探针在无精子症和严重少精子症患者AZF微缺失检测中的应用

目的:探讨多重连接探针扩增技术(MLPA)在无精子症及严重少精子症不育男性无精子因子(AZF)微缺失筛查中的应用可能。方法:提取147例无精子症或严重少精子症患者及154例正常对照男性外周血DNA,经95℃变性后与设计合成的AZF区域探针特异杂交,杂交产物经连接酶连接后用带有FAM荧光标记的通用引物扩增,毛细管电泳将产物分离生成MLPA图谱。所有样本同时行AZF序列标签位点(STS)的多重PCR分析。结果:病例组STS缺失检出率为15.0%(22/147),对照组中未检出STS缺失者;MLPA法于病例组中检出40例AZF区探针缺失患者,检出率为27.2%,其中包括22例STS缺失型患者。对照组中亦有20例AZF探针缺失者。结论:相比较传统的多重PCR,MLPA技术在AZF微缺失筛查中具有更佳的检测灵敏度,同时MLPA图谱所展现的高分辨的AZF区遗传学信息将有助于男性生精障碍病因学机制的深入探索。     

弱精子症患者精子中CRISP2基因及蛋白的初步研究

目的:探讨弱精子症患者精子中富含半胱氨酸的分泌蛋白2(CRISP2)mRNA及蛋白的表达水平,探讨其与精子活力的关系及相关的分子机制。方法:收集成年男性弱精子症患者精液78例,活力正常精液70例作为对照组,50% Percoll离心分离纯化后,提取精子总RNA及总蛋白,采用RT-PCR,SYBR Green实时定量PCR和Western印迹技术检测CRISP2 mRNA及蛋白相对表达量。结果:CRISP2基因在弱精子症患者精子中的表达量明显低于其在正常对照组精子中的表达量,下降达4.3倍;Western印迹发现CRISP2蛋白在弱精子症组较正常对照组下降达1.71倍,两组之间的表达量有明显的统计学差异(P<0.05)。结论:CRISP2基因及蛋白在弱精子症患者精子中的表达下调可能与精子活力下降有密切联系,提示CRISP2基因及蛋白可能成为弱精子症发病机制研究的一个分子靶标。     

弱精子症病人精子线粒体DNA4977bp缺失研究

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测线粒体ＤＮＡ４９７７ｂｐ缺失在弱精子症病人和精子活力正常人中的发生情况,以探讨其与精子活力的关系。材料与方法４１例病人来自本院男性门诊,年龄２２～４５岁。按ＷＨＯ推荐的实验方法及标准将４１例病人分为两组：弱精子症组２...     

父源印记基因H19印记控制区域DNA甲基化与少、弱精子症相关性分析

目的:研究印记基因H19印记控制区域的DNA甲基化程度与男性少、弱精子症的相关性。方法:通过染色体核型分析和Y染色体微缺失检测排除染色体因素干扰,进一步借助精液常规参数、伊红染色以及精子形态等指标,筛选出18例单一因素少精子症患者(浓度<15×106/ml,其余指标均正常)和20例单一因素弱精子症患者(前向运动精子百分率<32%,其余指标均正常)用于DNA甲基化检测;提取精子样本全基因组DNA,进行亚硫酸氢盐处理、PCR扩增目的基因片段并测序;通过BIQ Analyzer软件对测序结果进行质控和DNA甲基化程度分析。20例正常生育男性精液标本作为对照组。结果:与对照组甲基化丢失率[(0.30±0.06)%]相比,少精子症患者的H19印记控制区域的DNA甲基化丢失程度显著增高[(9.19±2.45)%],尤其当精子浓度<3×106/ml时,差异达到极显著水平(P<0.01)。在弱精子症患者中H19印记控制区域的DNA甲基化丢失程度[(0.30±0.07)%]和模式均与对照组无显著差异(P=0.62)。进一步重点分析了CTCF6位点的DNA甲基化状态,少精子症患者的DNA甲基化丢失程度[(2.67±0.75)%]显著高于对照组[(0.05±0.03)%]和弱精子症组[(0.03±0.02)%],而后两者之间无显著差异(P=0.35)。结论:H19印记控制区域的DNA甲基化程度的降低与少精子症密切相关,且降低程度与精子浓度呈显著负相关,而与精子活力无关。     

DAZL基因单核苷酸多态性与弱畸精子症的相关性研究

目的:探讨DAZL基因(deleted in azoospermia like)单核苷酸多态性(SNP)与弱精子症伴畸形精子症男性不育的关系。方法:收集弱畸精子症不育患者(病例组,n=173)和精液正常男性(对照组,n=175)精液样本,进行精液常规及精子形态学分析并提取精子基因组DNA,应用Sequenom MassARRAY SNP分型技术对DAZL基因A260G和A386G多态性位点进行基因分型,比较病例组与对照组基因型的分布差异。结果:在病例组与对照组中,DAZL基因A260G、A386G这两个位点均表现为野生基因型,无突变基因型。结论:DAZL基因A260G和A386G两个多态性位点与汉族男性精子活力低下及精子形态异常所致不育可能不存在相关,不足以视为男性不育的易感基因。     

两例圆头精子症患者DPY19L2基因突变检测研究

目的:DPY19L2基因纯合突变是导致圆头精子症的主要致病原因,本研究对2例圆头精子症患者的DPY19L2基因突变情况进行探讨。方法:收集2例圆头精子症患者临床资料及外周血,通过PCR扩增和DNA测序技术对其进行DPY19L2基因突变筛查。结果:2例圆头精子症患者光镜下精子形态为圆形,无顶体,精子头核深色。电镜下精子圆头较大,无顶体结构,核由单层膜包被,胞质弥散;PCR扩增发现2例患者DPY19L2基因都发生Exon 5、Exon6和Exon15纯合缺失。结论:DPY19L2的纯合突变会导致圆头精子症,这对圆头精子症的分子机制研究以及基因诊断研究具有重要补充意义,对临床医生提供遗传咨询与治疗方法同样具有重要提示意义。     

龟龄集胶囊对弱精子症精子线粒体功能的作用机制研究

目的观察龟龄集胶囊对特发性弱精子症精子线粒体的作用,探讨龟龄集胶囊治疗特发性弱精子症的机制。方法根据特发性弱精子症诊断标准,筛选特发性弱精子症且中医辨证属肾阳虚的患者253例为治疗组,根据前向运动(A级+B级)精子的百分率分成3组:35%≤A组500/0、20%≤B组35%、C组20%;选取61名正常生育男性为空白对照组。A、B、c组均用龟龄集胶囊治疗,每次0.6 g,每日2次,4个月为一个疗程。对各组精子治疗前后均作精子线粒体功能检测和精液分析,并观察各组精子密度、精子活力、精子线粒体琥珀酸脱氢酶(SDt{)、线粒体膜电位(MMP)治疗前后的变化。结果 (1)各组治疗后线粒体功能SDH、MMP玫善,差异均有统计学意义(P0.01)。(2)各组前向运动精子活力均有明显提高(P0.01)。结论龟龄集胶囊能有效改善特发性弱精子症精子活力,其机制是改善精子线粒体琥珀酸脱氢酶和线粒体膜电位,从而提高了线粒体的功能。     

精子获能前后运动轨迹变化与MTATP_8、MTCYB基因缺失

目的：为探讨精子ＭＴＡＴＰ８ 、ＴＭＣＹＢ基因缺失与精子获能障碍导致男性不育的关系。　方法：６０ 例男性不育者（其中３０ 例精子活动力正常，３０ 例精子活动力异常）和３０ 例生育男性精子获能前后运动轨迹变化，以及用ＰＣＲ技术检测其线粒体脱氧核糖核酸（ｍ ｔＤＮＡ）基因缺失情况。　结果：男性不育组获能后轨迹没有变化的共检出１６ 例，其中活动力异常组检出１０例，活动力正常组检出６ 例；生育组获能前后运动轨迹均有变化。不育组活动力异常的３０ 例标本中检出ＭＴＡＴＰ８ 基因缺失２ 例，检出ＭＴＣＹＢ基因缺失４ 例；不育组活动力正常的３０ 例标本中检出ＭＴＡＴＰ８ 基因缺失２ 例，检出ＭＴＣＹＢ基因缺失３ 例，经统计两组差异不显著（Ｐ＞ ０．０５）。生育组３０ 例标本未检出ＭＴＡＴＰ８、ＭＴＣＹＢ基因缺失，与男性不育组差异显著（Ｐ＜ ０．０５）。不育组ＭＴＡＴＰ８ 基因、ＭＴＣＹＢ基因缺失率分别为７％ 、１２％ 。　结论：ＭＴＡＴＰ８ 、ＭＴＣＹＢ基因缺失影响精子获能，可能导致男性不育。     

精子MTCYB基因缺失与男性不育的关系

目的 探讨精子ＭＴＣＹＢ基因缺失与男性不育的关系。方法 应用ＰＣＲ技术对１００例不育男性（精子活动力差５０例,精子活动力正常５０例）,和３０例已育男性的精子ＭＴＣＹＢ基因进行检测。结果 男性不育组精子ＭＴＣＹＢ基因缺失率为１６％,其中精子活力差的５０例标本检出９例,精子活动力正常的５０例标本中检出７例,经统计学检验二组差异无显著性。     

mtND4基因突变与弱精子症精子的相关分析

目的 分析弱精子症精子mtND4基因突变与弱精子症的相关性,探索弱精子症的分子病因.方法 按WHO标准收集56例弱精子症精液标本和44例精子活力正常精液标本,用3对引物PCR扩增mtND4基因,纯化测序,分析mtND4基因突变,比较2组标本mtND4基因突变及多重单核苷酸多态性(SNP)的差异. 结果发现31个同义突变位点和12个错义突变位点,其中6个核苷酸变异位点未报道过,分别为A11026G、C11215T、A11488G、C11713T、C12908T、T10908C.对照组mtND4基因T10873C和T11944C变异率分别为61.4%(27/44)和11.4%(5/44),显著高于弱精子症组的39.3%(22/56)和0%(P＜0.05);除T10873C和T11944C变异外,错义突变分析发现,对照组10例中与T10873C或T11944C组成多重SNP 8例,而弱精子症组10例标本中仅2例,2组间比较差异有统计学意义(P＜0.05);上述20例错义突变标本分成多重SNP组(与T10873C或T11944C)和非多重SNP组,多重SNP组a级精子百分率和a+b级精子百分率均显著高于非多重SNP组(P＜0.05). 结论 mtND4基因错义突变可能影响精子活动力,T10873C和T11944C多态性变异对精子活动力可能是一个有益因子,两者同时存在组成多重SNP时,两者的作用可能具有相互抵消的效应.

Abstract：

Objective To investigate the relationship between mtND4 point mutation in sperms and asthenospermia. Methods Fifty-six asthenospermia cases and 44 control cases were collected using the WHO criterion for defining asthenospermia, the regions of mtND4 gene were amplified by using PCR of 3 pairs primers. Consequently, the point mutation, missense mutation and multiple single nucleotide polymorphisms (SNP) were analyzed by employing sequencing technology and bioinformatics tools. Results Six mutations never before identified were found. The frequency of single point mutation T10873C and T11944C in the control group were significantly higher than those in the asthenospermia group (P＜0.05). Eight cases involved T10873C or T11944C among the 10 cases in control groups with missense mutations were found. But, there were only 2 cases with such mutation in the 10 asthenospermia cases with missense mutations (P＜0.05). The previous 20 cases of missense mutations can be described as either multiple SNP group (with T10873C or T11944C) or nonmultiple SNP group. The percentage of a range and a plus b range of multiple SNP group of sperm was significantly higher than the non-multiple SNP group(P＜0.05). Conclusions mtND4 gene mutation, especially the missense mutation may induce loss of sperm motility. The mutations of T10873C and T11944C may be useful for sperm motility or counteract the influence for the sperm motility caused by these harmful mutations.     

Correlation between defective motility (asthenospermia) and ATP reactivation of demembranated human spermatozoa

Human spermatozoa treated with 0.05% Triton X-100 to remove the cell membranes became immotile but flagellar movement was reinitiated by addition of 0.06 to 1 mM adenosine triphosphate (ATP). The percentage of spermatozoa showing flagellar movement 2 minutes after addition of 1 mM ATP from men with idiopathic asthenospermia (mean +/- SD, 34 +/- 15%), oligozoospermia (17 +/- 21%), sperm autoimmunity (17 +/- 12%), vasoepididymostomy (20 +/- 22%), or idiopathic zero motility (0%) was significantly lower than with spermatozoa from normal men (54 +/- 12%). The percentage of reactivated spermatozoa was correlated with the proportion of live cells (Eosin Y stain, r = 0.602, P less than 0.001), percentage of motile cells (r = 0.761, P less than 0.001), and motility index (r = 0.759, P less than 0.001) in the same semen samples. When expressed relative to initial sperm motility, the proportion reactivated was similar for idiopathic asthenospermia (85%) and normospermia (82%). Thus, failure to produce ATP does not appear to be a frequent cause of low sperm motility in man.     

正常男子和弱精子症者精子中3β-羟基甾体脱氢酶的研究

目的：测定精子中3β-羟基甾体脱氢酶（HSD）。方法：采用酶组织化学方法对27例精子活率正常和20例精子活率低下的男子精子进行了研究。结果：3β-HSD主要分布在精子颈部，其着色面积不等，精子活率正常组3β-HSD着色面积为616．48±108．48μm2／100个精子，精子活率低下组为354．37±50．58μm2／100个精子，两组差异极显著（P＜0．001）。结论：3β-HSD可能通过某种途径间接参与精子的运动。     

尿激酶对弱精症患者精子活力影响的研究

对２８例弱精症男子精液中加入不同浓度的尿激酶后，分别在３０、６０、９０和１２０分钟观察精子的活率和前向运动能力。并对１４例患者体内给予尿激酶１０天后，比较用药前后精子活率和有前向运动力精子数目的变化。结果：２８例精液标本体外加入尿激酶后，３０、６０、９０和１２０分钟时精子的活率均有提高；前向运动精子的数目亦有增加。体内给药前，１４例精子平均活率为４４．６４±１１．７９，用药１０天后，精子平均活率为６４．７１±１３．０１，二者比较有极显著差异（Ｐ＜０．０１）。尿激酶的这一作用可能与它降低精液的粘稠度有关。     

精子线粒体功能障碍在弱精子症中的研究进展

世界范围内大约有15%的夫妇受不育症困扰,其中男性不育者的精液异常多表现为精子活力低下。研究表明,精子中线粒体膜电位、活性氧、线粒体内Ca2+含量、线粒体酶以及蛋白组活性、线粒体超微结构、mtDNA等的异常可引起精子活力下降。本文通过回顾线粒体与弱精子症的相关文献,阐述精子线粒体功能障碍在弱精子症中可能的作用,为弱精子症发生发展机制的研究提供新的思路。     

细胞外信号调节激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶的表达水平对人精子活动力的影响

目的:比较细胞外信号调节激酶(ERK)、P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)的磷酸化和蛋白表达水平在正常精子和弱精子症患者精子中的差异,旨在探讨ERK和P38MAPK表达水平与精子活动力的相关性。方法:收集正常精液(精子浓度≥20×106/ml,a级精子≥25%或a+b级精子≥50%)和弱精子症患者精液(精子浓度≥20×106/ml,a级精子<25%或a+b级精子≤40%)各20份,洗涤后提取精子总蛋白,采用Western印迹方法分别检测ERK、P38MAPK的磷酸化和蛋白表达水平。结果:ERK和P38MAPK在正常精子和弱精子症患者精子中均有表达,ERK、P38MAPK蛋白表达水平和P38MAPK磷酸化水平在弱精子症患者组显著升高(P<0.05),而两组间ERK磷酸化水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:人精子ERK、P38MAPK蛋白表达水平和P38MAPK磷酸化水平升高可能是精子活动力低下的原因之一。     

左旋肉碱和乙酰左旋肉碱复合制剂对特发性弱精子症精子质量的影响

目的:观察左旋肉碱和乙酰左旋肉碱复合制剂对特发性弱精子症精子质量的影响。方法:采用自身对照实验设计。按WHO的标准诊断为特发性弱精子症的30例患者,经过中西医结合治疗无效后,服用左旋肉碱和乙酰左旋肉碱复合制剂,每次1袋,2次/d,疗程为3个月。应用本复合制剂前后按WHO标准进行精液分析各2次。结果:最终25例完成本观察。和治疗前比较,治疗后的精子存活率从(24.89±12.28)%提高为(49.45±17.40)%,精子活动力(a+b)级从(16.04±8.33)%提高为(24.64±7.09)%,一次射精的精子总数从(76.79±43.14)×106提高为(131.01±94.53)×106,有统计学显著差异(P<0.05)。结论:左旋肉碱和乙酰左旋肉碱对特发性弱精子症有辅助治疗效果,能提高患者的精液质量。