人乳头瘤病毒16型E6E7反义RNA抑制宫颈癌细胞恶性？…

目的 研究癌基因的特异性反义ＲＮＡ对癌细胞生长繁殖和恶性程度的影响。方法 用逆转录病毒载体将人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）－６Ｅ６Ｅ７反义ＲＮＡ导入ＨＰＶ－１６ＤＮＡ阳性的宫颈癌细胞株ＣａＳｋｉ中，观察该细胞在导入反义ＲＮＡ后其表型特征和在裸鼠体内致癌能力的变化。结果 ＨＰＶ－１６ Ｅ６Ｅ７反义ＲＮＡ能降低宫颈癌细胞ＣａＳｋｉ的生长速率，抑制其在软琼脂上的集落形成能力，并能明显地抑制其在裸鼠体内的致癌能力     

人乳头瘤病毒16型E6E7反义RNA抑制宫颈癌细胞恶性表型的作用

目的研究癌基因的特异性反义ＲＮＡ对癌细胞生长繁殖和恶性程度的影响。方法用逆转录病毒载体将人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）－１６Ｅ６Ｅ７反义ＲＮＡ导入ＨＰＶ－１６ＤＮＡ阳性的宫颈癌细胞株ＣａＳｋｉ中，观察该细胞在导入反义ＲＮＡ后其表型特征和在裸鼠体内致癌能力的变化。结果ＨＰＶ－１６Ｅ６Ｅ７反义ＲＮＡ能降低宫颈癌细胞ＣａＳｋｉ的生长速率，抑制其在软琼脂上的集落形成能力，并能明显地抑制其在裸鼠体内的致癌能力。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析发现ＨＰＶ－１６Ｅ６Ｅ７反义ＲＮＡ能使宫颈癌细胞中病毒ＨＰＶ－１６Ｅ６基因的表达水平降低。结论ＨＰＶ－１６Ｅ６Ｅ７反义ＲＮＡ能使宫颈癌细胞ＣａＳｋｉ恶性表型逆转；由其引起的癌细胞中ＨＰＶ－１６癌基因表达水平的降低可能是癌细胞表型逆转的原因之所在；ＨＰＶ－１６癌基因的表达水平对维持癌细胞的恶性表型起着重要作用。     

98例宫颈癌人乳头状瘤病毒16型E6基因突变及多态性分析

目的 研究湖北地区宫颈癌患者人乳头状瘤病毒16型(HPV16)E6基因点突变分布及频率,与国内外其他研究人员发现的E6突变进行对比,分析E6突变在宫颈癌发生中的意义.方法 从宫颈癌患者手术切除标本中提取组织DNA,用HPV16 E6特异性引物进行PCR扩增,对扩增的E6基因片段进行测序分析.结果 在35例宫颈癌组织DNA中有18例发生E6基因178位核苷酸的突变,变突频率为51.43%,相应核苷酸改变为Asp→Glu,442位核苷酸有4例发生核苷酸序列的改变,突变频率为11.43%,另有10例发生1～2个核苷酸序列的改变.结论 湖北地区98例宫颈癌患者人乳头状瘤病毒E6基因存在高频率的178和442位核苷酸突变,一些为新发现的核苷酸序列的突变,这些突变在宫颈癌发生中的作用有待于进一步研究.     

人乳头瘤病毒16型E6E7基因反义质粒对人宫颈癌细胞恶性的逆转…

构建可为地塞米松诱导表达的人乳头瘤病毒１６型Ｅ６Ｅ７，基因反义质粒，利用磷酸钙沉淀法将其分别转染到ＨＰＶ－１６阳性的人宫颈癌株Ｃａｓｋｉ和ＨＰＶ阴性的人宫颈癌细胞株Ｃ－３３Ａ中。地塞米松诱导反义质粒表达后，ＣａｓＫｉ细胞失去其恶性表型，而Ｃ－３３１细胞的生长特性及恶性行为未发生变化。     

抗HPV16E6核酶对宫颈癌细胞免疫学特性影响的研究

目的 研究特异性抗体HPV16E6核酶的转染对宫颈癌细胞免疫学特性的影响。方法 以脂质体法将抗HPV16E6-ribozyme、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,命名为CaSKi、CaSKi-P细胞。流式细胞仪分别检测3种细胞HLA－1、HL2－2、B7－1和B7－2基因的表达,分析CaSKi细胞转染酶后免疫学特性的变化。诱导制备NK、LAK、CD3AK和肿瘤细胞共激活杀伤细胞,检测各种免疫细胞对CaSKi-R、CaSKi-P、CaSKi细胞的杀伤效应。结果 CaSKi和CaSKi-p细胞中HLA－2、B7－1、B7－2表达都很低,两者差异无显著性。CaSKi-R中HLA－2、B7－1、B7－2表达率均明显升高。3种细胞中HLA－1表达率都很高。NK、LAK、CD3AK细胞对CaSKi-R细胞伤率显著高于CaSKi细胞,CaSKi、CaSKi-R分别与rIL－2共激活杀伤细胞（称CASKI和CASKI－R）的样伤活性无明显差别,对CaSKi-R的杀伤活性高于CaSKi细胞。而各种免疫细胞对CaSKi-P细胞的杀伤率与CaSKi细胞差异无显著性。结论 抗HPV16E6－nrbozyme的导入能使宫颈癌CaSKi细胞易于被机体免疫系统识别杀伤,难于免疫逃避,但不能增强其免疫原性。     

人乳头状瘤病毒16、18型变异及相关肿瘤

肿瘤的形成可由多种病毒引起[1],其一就是人类乳头状瘤病毒(Human papillomavirus,HPV).HPV是1949年从普通疣体浸出液中首次被观察到,1995年有研究证实HPV感染为宫颈癌的致病病原体.研究显示:HPV16、18能促使人类鳞状上皮的增生.目前HPV16、18变异体的致瘤性受到各国学者的广泛关注.     

人乳头瘤病毒16型E6和E7基因特征分析

目的 对北京15例宫颈癌病变组织中的人乳头瘤病毒(HPV)16型E6和E7基因进行扩增及序列测定,分析E6和E7基因突变特征,并探讨宫颈癌病变中HPV16的感染情况.方法 自行设计HPVl6型E6和E7基因扩增引物,采用PCR法扩增15例宫颈癌组织中HPV16 E6和E7片段,将PCR产物克隆到TA载体,进行序列测定.通过Sequencer、Bioedit、Mega等生物学软件对E6和E7基因进行核苷酸和氨基酸序列分析.结果 15例宫颈癌中8例鳞癌检出E6和E7基因,检出率为8/15.2例腺癌、1例腺鳞癌和其他4例鳞癌中均未检出HPV16 E6E7 DNA.8例鳞癌中的4例检出的HPVl6为亚洲类似株,在E6基因178位(T→G,D25E)和E7基因647位(A→G,N29S)发生突变;另外4例为欧洲类似株,其中1例(BJ16)的HPV16在E6基因335位点发生突变(C→T,H78Y).结论 HPV16是致宫颈癌的重要因素;宫颈鳞状细胞癌HPV16感染的发生频率较腺癌和腺鳞癌高;E6基因178位点可能是区分亚洲株和欧洲株的重要位点;E6基因178位点和E7基因647位点是突变频率较高的位点,可能导致HPV16致癌能力发生改变.     

人类乳头状瘤病毒与尖锐湿疣和宫颈癌的关系

挖空细胞是ＣＡ的主要组织学特征和诊断依据之一。极少数宫颈ＣＡ病变经历一个长潜伏期后可恶变为宫颈癌，部分宫颈癌活检标本鉴定显示出ＨＰＶ１６、１８型阳性，提示ＨＰＶ可能与宜颈癌的发生关系密切。     

宫颈癌与人乳头状瘤病毒16/18型的关系探讨

目的　应用荧光定量聚合酶链反应 (FQ -PCR)检测宫颈癌患者人乳头状瘤病毒 (HPV) 16 / 18型感染率 ,探讨HPV 16 / 18型与宫颈癌的关系。方法　应用荧光探针标记引物的荧光定量聚合酶链反应对 88例宫颈癌患者的宫颈分泌物进行了HPV 16 / 18型检测。结果　 88例宫颈癌患者宫颈分泌物FQ -PCR阳性率为 78% ,阳性样品定量对数平均值 (ml-1)为 5 .33× 10 6,定量测值范围 (ml-1)为 1.2 0× 10 3 ～ 2 .4 1× 10 7。对照组 85例全部阴性。结论人乳头状瘤病毒 (HPV) 16 / 18型感染与宫颈癌的发生发展关系密切。     

人乳头状瘤病毒16 E7 DNA在结直肠腺癌组织中的表达

结直肠癌与人类乳头状瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)感染有一定的关系,但由于检测方法、标本选择及样本数量不同,各研究结果之间差异很大。为进一步明确结直肠癌变与HPV16感染的关系,采用多聚酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)对82例原发性结直肠腺癌患者手术切除的新鲜癌及癌旁正常粘膜组织进行了前瞻性对照研究,检测了组织中HPV16E7DNA的表达并进行测序鉴定。结果显示,结直肠腺癌组织HPV16E7的表达阳性率(42/82)明显高于癌旁正常粘膜组织(4/82);直肠癌组织中HPV16E7的表达(64.10%)明显高于升结肠癌(18.18%),即癌灶部位距肛门越近,感染率越高;HPV16阳性率与Dukes分期相关,Dukes分期越晚感染率越高;与癌组织分化程度无相关性。结果提示结直肠癌的发生、发展可能与HPV16感染有关。     

稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)58型E6E7融合基因的B16细胞系的建立

目的:构建pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,建立稳定表达HPV58E6E7基因的B16细胞系。方法:采用PCR方法扩增出HPV58E6E7融合基因的全长序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo中,并加入酶切位点和6×his标签,构建重组真核表达质粒pIRES-neo-HPV58E6E7。利用阳离子脂质体介导法将其转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418加压筛选出稳定转染的阳性克隆。利用Western blot、流式细胞术、免疫荧光等检测方法验证HPV58E6E7融合基因在稳定转染的B16细胞株中的表达。结果:经PCR、限制性内切酶鉴定及测序分析,pIRES-neo-HPV58E6E7重组质粒构建正确,转染B16细胞株后,经过Western blot、流式细胞术和免疫荧光等检测显示B16细胞株能够稳定、高效表达HPV58E6E7融合基因,表明B16-HPV58E6E7稳定转染细胞系构建成功。结论:成功构建了pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,建立了可以高效、稳定表达HPV58E6E7融合基因的B16细胞系。该稳定转染细胞系的建立为进一步研究HPV58治疗性基因疫苗的功能提供了良好的靶细胞,为其在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。     

宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型E7蛋白致癌机理初探

目的 研究宫颈癌组织中人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）１６－Ｅ７蛋白对视网膜母细胞瘤基因（Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）Ｒｂ蛋白及Ｅ２Ｆ－１的作用的机制,探讨ＨＰＶ１６－Ｅ７蛋白与宫颈癌发生的关系。方法 采用聚合酶链反应检测宫颈癌及正常宫颈组织中ＨＰＶ１６感染等,用蛋白印迹技术对ＨＰＶ１６ ＤＮＡ阳性的宫颈癌组织中是否存在ＨＰＶ１６－Ｅ７蛋白和Ｒ６蛋白－Ｅ２Ｆ－１形成的复合物进行检测。正常宫颈组织作为对照,     

染色体外游离态的子宫颈癌HPV16分离株E1／E2区的基因 …

目的 观察子宫颈癌组织中呈染色体外质粒状态的ＨＰＶ１６分离株Ｅ１／Ｅ２基因序列。方法 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转印杂交检测癌组织中ＨＰＶ１６基因组的物理状态。对８例游离状态的ＨＰＶ１６分离株Ｅ１／Ｅ２区进行ＰＣＲ扩增,克隆后酶切分析和ＤＮＡ序列分析。结果 对２８例ＨＰＶ１６阳性子宫颈癌中病毒ＤＮＡ杂效结果显示８例呈染色体外质粒方式存在。ＰＣＲ克隆鉴定发现８例分离株都具有完整的Ｅ１／Ｅ２区域。此外４例分离株     

人乳头瘤病毒16型中国株L1基因的体外真核表达

目的 构建人类乳头瘤病毒16型(HPV16)中国株晚期基因L1的真核表达系统.方法 将HPV16中国株L1基因从pCR2.1/HPV16L1定向亚克隆至pTacer-CMV载体,构建重组质粒pTaeer-CMV/HPV16L1,将重组质粒用脂质体转染N1H3T3、HeLa细胞,用透射电镜、SDS-PAGE、蛋白印迹等方法观察HPV16 L1蛋白的表达.结果 NIH3T3、HeLa细胞经pTacer-CMV/HPV16L1转染后,SDS-PAGE、蛋白印迹等实验显示可表达HPV16 L1蛋白,电镜下可见病毒样颗粒(VLP).结论 pTacer-CMV/HPV16L1构建成功,可在体外表达HPV16中国株L1蛋白.     

人乳头瘤病毒16型修饰后E6E7基因免疫原性增强

利用突变修饰后消除转化活性并保留抗原性的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus type 16,HPVl6)E6E7融合基因(fmE6E7)，研制治疗HPVl6相关疾病的DNA疫苗。用PCR扩增fmE6E7基因后，插人真核表达质粒获得pVRl012-fmE6E7，瞬时转染Cos-7细胞，免疫荧光法检测证实其表达后，在C57BL／6小鼠后腿肌肉进行裸DNA免疫，5lCr释放法体外分析免疫鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性Cytotoxic T lymphocyte，CTL)，间接ELISA法检测免疫鼠血清中E7特异性抗体。研究表明修饰后的中国地方株E6E7融合基因可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应，与单独野生型E7基因免疫相比，E6E7融和基因可更好的活化CTT反应。表明修饰后消除转化活性的中国地方株E6E7融合基因可作为HPVl6治疗性DNA疫苗的靶基因。     

北京地区人乳头瘤病毒16型感染及其E6/E7基因变异与宫颈病变的相关性研究

目的探讨HPV16感染及其E6/E7基因变异与宫颈病变的相关性。方法采用导流杂交技术进行HPV感染分型检测,PCR扩增出80份HPV16阳性宫颈病变的E6/E7基因、克隆入pMD18-T载体,双向测序分析基因变异与宫颈病变相关性。结果HPV16在宫颈病变患者中的检出率最高为33.3%(154/463),与病变程度相关(P<0.05)。E6/E7基因72份测序成功,DNA序列变异发生率为88.9%(64/72)。氨基酸序列E6-D32E(T96G)和E7-N29S(A86G)位点突变同时伴随存在,D32E/N29S的检出率为38.9%(28/72),与宫颈病变程度相关(P<0.05)。结论HPV16是北京地区来源的宫颈病变中最常见的致病型,其D32E/N29S变异与病变程度相关。     

人乳头瘤病毒58型E6蛋白对p53的作用研究

目的 研究HPV58 E6蛋白与p53蛋白的作用关系，以初步探讨其致癌机理。方法 先通过GST沉降试验和体外降解试验，体外研究HPV58 E6结合降解p53蛋白的作用，进而将表达质粒导人SAOS-2细胞，在细胞内研究HPV58 E6对p53诱导细胞凋亡活性的影响。结果 HPV58 E6能够有效结合p53蛋白并进一步诱导其降解，而且在细胞内，HPV58 E6具有抑制p53蛋白的诱导凋亡的功能。结论 p53蛋白的降解影响其细胞周期调控和诱导凋亡的功能，导致细胞发生恶性转化引发子宫颈癌等肿瘤。