反义PKCξ对角质形成细胞增殖的调节

目的：探讨角质形成细胞中，反义蛋白激酶Cξ与磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）和细胞外信号调节激酶ERK1／2信号转导网络以及与核因子NF-kB的相互作用关系。方法：通过细胞原位杂交、间接免疫荧光和激酶活性测定方法，研究反义PKCξ抑制角质形成细胞增殖的信号转导机制。结果：表达反义PKCξ的角质形成细胞中，PI3K的基因表达显著下调，ERK1／2和NF-kB的核内表达水平以及ERK1／2的激酶活性明显降低。结论：表达反义PKCξ可通过下调PI3K和ERK1／2信号通路抑制角质形成细胞的增殖。     

反义蛋白激酶Cζ对角质形成细胞增殖的影响

目的 研究蛋白激酶C(PKC)ζ亚类在角质形成细胞增殖中的作用.方法 采用基因转染的方法将PKCζ基因导入角质形成细胞株Colo16中,初步研究了表达反义PKCζ对Colo16角质形成细胞增殖的影响.结果 表达反义PKCζ的角质形成细胞形态发生改变,生长速率明显减慢,被阻抑在G1期.结论 反义PKCζ抑制Colo16角质形成细胞的增殖.     

NFKBIZ基因表达在银屑病发病中的作用机制分析

目的 旨在分析B细胞K轻肽基因增强子核因子抑制因子（NFKBIZ）基因表达在银屑病发病中的作用机制。方法 采用白细胞介素-17A/F(IL-17A/F)异源二聚体或肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激培养的人角质细胞进行实验,并转染含有睫状肌核转录因子κB抑制物ζ基因表达的小干扰RNA(IκBζsiRNA)的细胞沉默IκBζ。收集细胞或上清液,进行定量聚合酶链反应（qPCR）、酶联免疫吸附测定（ELISA）以及蛋白质印迹（WB）检测特定的银屑病相关基因和蛋白质（NFKBIZ/IκBζ,CCL20,DEFB4/hBD2,S100A7,IL-8和CHI3L1）,并通过将人角质细胞与p38有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）抑制剂（SB202190）,ERK1/2抑制剂（PD98059）,JNK1/2抑制剂（SP600125）或核转录因子-κB(NF-κB)抑制剂（SC-514）预孵育,以此评估所涉及的信号通路。结果 单独的IL-17A/F或联合TNF-α都能显著诱导刺激1.5 h、3 h、6 h和24 h的人角质细胞NFKBIZ mRNA表达,当IL-17A/F异源二聚体的浓度分别为10、10...     

A375细胞外信号调节激酶通路与核因子κB通路的交互作用初探

【摘要】 目的 探讨黑素瘤细胞A375细胞外信号调节激酶（ERK）通路与核因子κB（NF-κB）信号转导通路的交互作用。 方法 将培养的A375细胞分为对照组、选择性ERK信号通路抑制剂U0126（10 μmol/L、5 μmol/L）处理组和选择性NF-κB通路抑制剂BMS-345541（10 μmol/L、5 μmol/L）处理组,分别提取蛋白质和mRNA,用Western 印迹、RT-PCR观察U0126抑制ERK通路后,NF-κB P65、p-IκBα蛋白及NF-κB P65 mRNA的表达,观察BMS-345541抑制NF-κB通路后ERK1/2 、p-ERK1/2蛋白及ERK1 mRNA的表达。 结果 应用10 μmol/L、5 μmol/L U0126抑制ERK通路后,胞核NF-κB P65蛋白表达（分别为0.60 ± 0.04、0.56 ± 0.06）均较对照组（1.54 ± 0.15）减少（P < 0.01）,其表达量与药物浓度无显著相关性（P > 0.01）;p-IκBα蛋白的表达（0.90 ± 0.05、0.70 ± 0.02）均较对照组（0.61 ± 0.03）增加（P < 0.01）,两药物浓度组之间的表达量差异有统计学意义（P < 0.01）;NF-κB P65 mRNA的表达（0.79 ± 0.05,0.75 ± 0.04）均较对照组（0.86 ± 0.05）减少（P < 0.01）。应用10 μmol/L BMS-345541抑制NF-κB通路后,ERK1/2、p-ERK1/2蛋白及ERK1 mRNA的表达（0.73 ± 0.07、0.75 ± 0.09、1.51 ± 0.02）较对照组减少（P < 0.01）,BMS-345541浓度为5 μmol/L时,ERK1/2、p-ERK1/2蛋白和ERK1 mRNA的表达（0.94 ± 0.11、0.99 ± 0.04、1.62 ± 0.03）较对照组的差异无统计学意义（均P > 0.05）。 结论 NF-κB通路和ERK通路在黑素瘤A375细胞中存在交互作用。     

地塞米松对HaCaT细胞核因子-κB/IκB表达的影响

目的:探讨地塞米松对角质形成细胞核因子(NF)-κB活性及其抑制蛋白(IKB)α表达的调节作用.方法:采用反转录-荧光实时定量PCR和蛋白印迹试验.观察经不同浓度及不同时间的地塞米松作用下.培养的人角质形成细胞HaCaT细胞的IκBα mRNA和蛋白质的表达;用蛋白印迹试验检测NF-κB核蛋白的表达情况.结果:地塞米松可诱导HaCaT细胞IKBα的表达而抑制NF-κB核转位,此作用呈浓度依赖性效应,在36 h时作用最明显.结论:糖皮质激素通过调控人角质形成细胞NF-κB/IκB信号通路.可抑制皮损局部的炎症反应.     

中波紫外线对角质形成细胞NF-κB p65及其抑制因子IκBα表达的影响北大核心CSCD

目的 探讨不同剂量中波紫外线（UVB）照射对体外培养的人皮肤角质形成细胞NF-κB p65及其抑制因子IκBα表达的调控效应.方法 4.5、10及50 mJ/cm2UVB照射人角质形成细胞系及人原代角质形成细胞,设置未经照射的对照组,在照射后4h使用Western印迹法测定细胞总蛋白中IκBα及NF-κB p65的表达水平.并对人原代角质形成细胞进行50 mJ/cm2UVB照射,照射后继续培养2、4、8、12h,分别测定4个时间点IκBα及NF-κB p65的表达水平.蛋白条带密度分析使用Quantity One（R）4.6.8软件,分别计算IKKβ、IκBα、NF-κB p65以及磷酸化IKKα/β、IκBα、NF-κB p65和β肌动蛋白条带吸光度和面积的乘积,再分别计算IKKβ、IκBα和NF-κB p65与β肌动蛋白的比值,取3次实验结果.结果 4.5和10 mJ/cm2 UVB照射后4h,相对于对照组细胞,人角质形成细胞系及人原代角质形成细胞总蛋白中IKKβ、IκBα、NF-κB p65表达水平均无明显变化（P＞ 0.05）;50 mJ/cm2 UVB照射后4h,细胞系及原代角质形成细胞中IKKβ表达水平均无明显变化（P＞0.05）;原代角质形成细胞IκBα表达水平（0.173±0.055）较对照组细胞（0.462±0.142）显著降低（t=5.64,P＜ 0.05）,NF-κB p65表达水平（0.076±0.030）也较对照组细胞（0.120±0.034）降低（t=5.40,P＜0.05）;角质形成细胞IκBα表达水平（0.160±0.046）较对照组细胞（0.398±0.136）轻度下调（t=4.37,P＜0.05）,NF-κB p65的表达水平无明显变化（P＞0.05）.50 mJ/cm2 UVB照射原代角质形成细胞后2h,IκBα表达水平（0.140±0.034）相对于对照组细胞（0.208±0.031）开始下调（t=17.55,P＜ 0.05）,并随照射后时间延长下调效应更为显著;NF-κB p65的表达水平在2h和4h时较对照细胞无明显变化（P＞0.05）,8h时（1.162±0.345）较对照细胞（1.235±0.349）表达水平下调（t=36.67,P＜0.05）,12 h时（1.061±0.246）较对照细胞（1.390±0.226）仍下调（t=8.71,P＜0.05）,随着时间的推进下调效应无明显改变;磷酸化IKKα/β（ser176/180）、IKKβ、磷酸化IκBα（ser32）、磷酸化NF-κB p65（ser536）表达量均无明显改变（P＞0.05）.结论 高剂量（50 mJ/cm2）UVB照射可显著抑制人原代角质形成细胞IκBα表达,同时轻度抑制NF-κB p65蛋白的表达,提示可能存在UVB照射人原代角质形成细胞引起NF-κB p65活化的另一种通路.     

P物质通过激活NF-κB诱导人角质形成细胞产生抗菌肽

目的:明确P物质和FK-506对人角质形成细胞产生抗菌肽(CAMP)和NF-κB信号活化的影响。方法:P物质单独或联合FK-506处理培养HaCaT细胞24h,用实时荧光定量PCR检测CAMP mRNA表达，免疫蛋白印迹法检测CAMP蛋白表达，免疫荧光染色观察CAMP蛋白原位表达及NF-κB/p65核转位。结果:P物质刺激HaCaT细胞CAMP mRNA及蛋白表达增加，其中1μM处理24 h效果最明显，与空白对照组比差异有统计学意义(P<0.05);此外，P物质处理30 min可诱导HaCaT细胞NF-κB/p65发生核转位，此后随处理时间延长核转位减弱，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。FK-506抑制P物质诱导HaCaT细胞NF-κB/p65核转位并减低了P物质刺激的CAMP表达，P物质与FK-506联合处理组与P物质组比较，两组间差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:P物质通过激活NF-κB信号诱导角质形成细胞产生抗菌肽。针对抑制“P物质-NF-κB信号活化-抗菌肽”机制可能是治疗玫瑰痤疮的潜在新靶点。     

角质形成细胞的体外培养及NF-κB的表达

目的:检测体外培养角质形成细胞的核因子(NF-κB)的表达,以探讨NF-κB在银屑病炎症反应中的作用.方法:采用无血清培养法获得角质形成细胞,与银屑病患者外周血单一核细胞(PBMC)混合培养,利用流式细胞仪检测NF-κB表达.结果:角质形成细胞在5天可见明显的集落,10天左右可长满单层.与正常对照组相比,银屑病患者混合培养细胞较对照角质形成细胞NF-κB表达显著增高.结论:NF-κB活性增强是银屑病炎症反应的重要因素之一.     

中波紫外线辐射对人表皮角质形成细胞核因子κB转录活性的影响

目的 探讨中波紫外线(UVB)辐射对表皮角质形成细胞核因子κB(NF-κB)转录活性的影响。方法 正常人表皮角质形成细胞取自健康儿童包皮,并培养于37℃、5%CO₂的培养箱中;以20、60和120 mJ/cm² UVB辐射培养细胞;分别提取UVB辐射0、2、24和48 h后角质形成细胞的全细胞蛋白、核蛋白和胞浆蛋白;免疫印迹方法检测分析全细胞蛋白和核蛋白的NF-κB/p65以及胞浆蛋白NF-κB抑制物(IκB-a)的动态变化;电泳迁移率变更分析(EMSA)方法检测分析NF-κB的转录活性。结果 UVB辐射可显著促进角质形成细胞总蛋白和核蛋白中NF-κB的蛋白表达(P<0.05),且表达量与辐射剂量成正比,UVB辐射后2 h即可有NF-κB的蛋白表达水平的升高。24 h后达高峰并持续高水平表达至48 h:不同剂量UVB辐射角质形成细胞后的不同时间,均可促进NF-κB转录活性:UVB辐射可显著抑制角质形成细胞胞浆IκB-a蛋白的表达(P<0.05)。结论 UVB辐射可显著促进角质形成细胞NF-κB的转录活性。     

反义寡核苷酸阻遏角蛋白14的表达

目的 研究脂质体介导角蛋白K14反义寡核苷酸(ASODN)阻遏人角质形成细胞K14基因和蛋白的表达及抑制体外增殖活性的效果.方法 人表皮角质形成细胞原代培养,3~10代用于实验,利用脂质体将人工合成的正义、反义及错配K14寡核苷酸基因片段导入角质形成细胞,应用流式细胞仪、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组化(SABC)方法检测反义寡核苷酸对角质形成细胞的细胞周期、K14基因和蛋白表达的影响.结果 脂质体介导的K14反义寡核苷酸转染角质形成细胞后,能有效地抑制角质形成细胞中K14基因的表达;48h后可阻遏K14蛋白表达;流式细胞仪检测见反义寡核苷酸处理组细胞周期发生明显改变,G₁期细胞百分率上升,S期细胞百分率下降.而正义寡核苷酸1组、错义寡核苷酸组及空白对照组均无此变化.结论 应用反义技术封闭K14基因,可以阻遏角蛋白K14基因和蛋白的表达,并可以抑制体外培养的角质形成细胞的增殖.     

反义蛋白激酶Cξ下调角质形成细胞中增殖相关基因的表达

自从1997年发现蛋白激酶C（PKC）以来，研究证明PKC信号转导通路在细胞生长、分化等功能的调节中起关键的作用，我们以往的研究已证明细胞的增殖与增殖相关基因的表达密切相关。我们在以前研究的基础上，从细胞增殖相关基因的角度，进一步探讨了反义PKCξ抑制Colo16角质形成细胞增殖的机制，为弄清PKCξ在角质形成细胞增殖调控中的作用提供实验依据。     

VEGF-VEGFR2信号通路在银屑病中作用的研究进展

 VEGF-VEGFR2信号通路在银屑病病程中发挥重要作用。血管内皮因子(VEGF)与VEGFR2结合可以在多个酪氨酸位点诱导受体二聚化和自身磷酸化，同时促进下游信号ERK1/2通路的激活。磷酸化的ERK1/2在银屑病皮损处角质形成细胞中高表达，而VEGFR2被VEGF激活后又可诱导ERK1/2磷酸化，促进角蛋白K6、K16和K17的表达，同时激活的ERK1/2又将促进炎症反应的发生以及血管增生。因此通过阻断VEGF介导的VEGF-VEGFR2信号转导通路，可影响VEGF-VEGFR2信号转导通路下游基因的表达。VEGF-VEGFR2信号通路上的关键分子VEGF和VEGFR2可以作为银屑病治疗的潜在靶点。VEGF抑制剂可以通过抑制VEGF或VEGFR2来阻断VEGF-VEGFR2信号通路，从而发挥对银屑病的治疗作用。本文对近年来VEGF-VEGFR2通路参与银屑病机制的研究进行综述。     

来氟米特对地蒽酚诱导炎症因子表达的调控

目的 探讨利用角质形成细胞核因子(NF)-κB抑制药物来氟米特对地蒽酚诱导角质形成细胞所表达的炎症因子进行调控的可能性.方法 采用蛋白印迹法检测NF-κB抑制蛋白α(IκBα)表达的变化,以此反映药物对细胞NF-κB活性的影响.使用MTT法检测药物处理后细胞增殖活力的改变,RT-PCR检测药物对炎症因子mRNA表达的影响.结果 来氟米特可显著抑制地蒽酚对角质形成细胞HaCaT株IκBα蛋白的降解作用,也即抑制地蒽酚对NF-κB信号途径的活化.实验表明,NF-κB活化与地蒽酚抑制增殖的作用无关.实验显示,在相应的剂量范围内,来氟米特可以显著抑制地蒽酚所诱导的炎症因子细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA的表达,并呈剂量依赖性.结论 NF-κB活化并未参与抗银屑病外用药物地蒽酚对增殖的抑制作用.     

维A酸对角质形成细胞NF-κB及细胞因子的影响

目的探讨维A酸药物对角质形成细胞的影响及核因子调控机制,为药物治疗银屑病提供理论依据.方法从银屑病患者外周血分离单一核细胞(PBMCs),与角质形成细胞系HaCat混合培养,用维A酸预处理HaCat细胞,以雷公藤为对照,利用流式细胞仪分析培养体系及HaCat各自的NF-κB表达,ELISA测上清液中IL-8、ICAM-1含量.结果 银屑病患者培养体系及HaCat中NF-κB和细胞因子的水平均高于健康对照组(P＜0.01),经维A酸预处理HaCat后,可抑制核因子的表达,与雷公藤比较差异无显著性.结论维A酸可能通过下调NF-κB的活化而改善银屑病的症状,同时提示抑制NF-κB活性的药物可能有助于银屑病的治疗.     

核因子-κB反义寡核苷酸抑制紫外线诱导的HaCaT细胞反义分泌白介素6

目的 探讨核因子-κB(NF-κB)反义寡核苷酸转染体外培养的HaCaT细胞反义株HaCaT后,对紫外线(UV)诱导的HaCaT细胞反义分泌炎症因子白介素6(IL-6)的抑制作用。方法 蛋白质印迹方法测定不同剂量中波紫外线(UVB)辐射HaCaT细胞反义后NF-κBp65的变化;逆转录-聚合酶链反应测定NF-κBp65反义寡核苷酸转染后p65m RNA表达的变化;酶联免疫吸附测定法测定NF-κBp65反义寡核苷酸转染后紫外线辐射的HaCaT细胞反义分泌IL-6水平。结果 10、20、30mJ/cm² UVB辐照HaCaT细胞反义后均可显著促进NF-κBp65表达(P<0.05),不同浓度的NF-κBp65反义寡核苷酸转染后对30mJ/cm² UVB诱导的p65mRNA表达和IL-6分泌均有显著抑制作用(P<0.05)。结论 脂质体介导的NF-κBp65反义寡核苷酸转染HaCaT细胞反义,可以抑制UV辐射诱导的HaCaT细胞反义产生IL-6,表明UV诱导HaCaT细胞反义产生IL-6可能是通过UV激活NF-κBp65的表达产生的。     

NB-UVB对HaCaT细胞CCL22表达的影响

目的：明确NB-UVB对HaCaT细胞CCL22的影响。方法：常规培养后的HaCaT细胞分为两组,一组给予不同剂量NB-UVB (0、100、200、400 mJ/cm2)照射;一组给予NF-κB抑制剂PDTC（1、12.5、25 μmol/L）预处理后再进行NB-UVB照射,采用Real-time PCR及ELISA检测CCL22表达;采用Western blot方法检测NF-κB p65磷酸化水平。结果：CCL22表达和NF-κB p65磷酸化的水平随着NB-UVB照射剂量增强而上调;PDTC处理后,NB-UVB诱导的角质形成细胞CCL22表达及和NF-κB p65磷酸化水平较直接给予NB-UVB明显下调,且PDTC浓度越高越明显。 结论：NB-UVB照射可能通过激活NF-κB信号通路促进角质形成细胞CCL22表达及分泌。     

核因子κB和c-myc在尖锐湿疣皮损角质形成细胞中的表达

目的 探讨核因子-κB(NF-κB)和c-myc在尖锐湿疣皮损角质形成细胞中的表达。方法 采用原位杂交方法检测尖锐湿疣50例,确定为HPV6/11阳性;采用免疫组化En Vision二步法检测50例尖锐湿疣患者皮损和25例正常人皮肤(包皮)中NF-κB和c-myc的表达及分布。结果 ①与正常人皮肤对照组相比,尖锐湿疣皮损角质形成细胞中NF-κB和c-myc的表达均有不同程度增强(前者U=6.286,P<0.01;后者U=4.356,P<0.01)。NF-κB表达主要分布于棘细胞层,阳性信号定位于胞浆。c-myc表达主要分布于表皮全层或棘细胞层和基底层,阳性信号定位于胞核。②尖锐湿疣皮损中,NF-κB与c-myc的表达呈正相关(r=0.89,P<0.01)。结论 在HPV6/11感染时,角质形成细胞中转录因子NF-κB和c-myc的表达增高,可能均参与HPV感染细胞增殖的调控。     

反义蛋白激酶Cζ下调角质形成细胞中增殖相关基因的表达

自从1977年发现蛋白激酶C(PKC)以来,研究证明PKC信号转导通路在细胞生长、分化等功能的调节中起关键的作用[1],我们以往的研究已证明细胞的增殖与增殖相关基因的表达密切相关[2,3]。我们在以前研究的基础上,从细胞增殖相关基因的角度,进一步探讨了反义PK C灼抑制Colo16角质形成细胞增殖的机制,为弄清PK C灼在角质形成细胞增殖调控中的作用提供实验依据。一、材料和方法(一)材料:PTB654-PKC灼、PcD NA3、Colo16角质形成细胞株分别由日本神户大学Ono教授、北京大学医学部生化系侯维敏教授及日本北里大学H ikaru教授惠赠。Dulbecco…     

SAA通过TLR-2/TLR-4/NF-κB通路诱导角质形成细胞IL-1β的表达

目的探讨血清淀粉样蛋白A(SAA)在体外角质形成细胞白细胞介素(IL)-1β分泌中可能的作用。方法分离培养包皮的表皮角质形成细胞,分为空白对照组和SAA不同浓度刺激组(1μg/m L、10μg/m L、100μg/m L)。分别用Real-time PCR和ELISA检测细胞中IL-1β前体mRNA和成熟IL-1β的表达。角质形成细胞在SAA(10μg/m L)存在下与同种型对照免疫球蛋白Ig G1、TLR-2抗体(10μg/m L)、TLR-4抗体(20μg/m L)或TLR-2抗体+TLR-4抗体孵育24h。RT-PCR检测IL-1βmRNA的表达。将角质形成细胞暴露SAA 15min后,通过流式细胞术测定NF-κB p65磷酸化。在存在NF-κB抑制剂Bay11-7082的情况下,以10μg/m L SAA处理正常原代角质形成细胞。24h后,RT-PCR法检测细胞IL-1βmRNA水平。结果 SAA刺激角质形成细胞中IL-1β的表达。随SAA浓度的升高IL-1β的表达也逐渐增加。角质形成细胞在SAA(10μg/m L)存在下与同种型对照免疫球蛋白Ig G1、TLR-2抗体(10μg/m L),TLR-4抗体(20μg/m L)或TLR-2抗体+TLR-4抗体孵育24h,IL-1βmRNA表达被不同程度抑制。将正常原代角质形成细胞暴露于SAA后,NF-κB p65磷酸化表达增加。在存在NF-κB抑制剂Bay11-7082的情况下,SAA诱导IL-1βmRNA的表达明显被抑制。结论 SAA在体外角质形成细胞中通过TLR-2/TLR-4/NF-κB通路诱导IL-1β表达。     

皮肤科学基础

20 0 4 196 7　反义寡核苷酸阻遏角蛋白 14的表达 /陈玉欣 (四军大西京医院皮肤科 )… / /中华皮肤科学杂志 .-2 0 0 4 ,37( 4) .- 2 2 4～ 2 2 6人表皮角质形成细胞原代培养 ,利用脂质体将人工合成的正义、反义及错配 K14寡核苷酸基因片段导入角质形成细胞 ,应用流式细胞仪、逆转录聚合酶链反应 ( RT- PCR)和免疫组化 ( SABC)法检测反义寡核苷酸对角质形成细胞的细胞周期、K14基因和蛋白表达的影响。结果显示 ,应用反义技术封闭K14基因 ,可以阻遏角蛋白K14基因和蛋白的表达 ,并可以抑制体外培养的角质形成细胞的增殖。提示以 K14为靶…