慢病毒载体介导apelin基因转染人脐带间充质干细胞的实验研究

【摘要】目的构建带有荧光标记基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和apelin基因的重组质粒pUbi-apelinFLAG-pSV40-EGFP并进行慢病毒包装,探讨其转染人脐带间充质干细胞的最佳感染复数（MOI）值及目的基因表达情况。方法化学合成目的基因片段并扩增。采用In-Fusion技术将酶切后的目的基因片段与线性质粒载体连接,转化入感受态DH5α细胞中后筛选阳性克隆并进行测序。重组质粒慢病毒载体转染293T细胞,包装慢病毒并测定滴度。将重组质粒慢病毒按不同MOI值转染人脐带间充质干细胞,根据转染效率得到最佳MOI值,并采用Real-timePCR及Western blot方法检测目的基因表达情况。结果通过PCR扩增获得酶切位点碱基修饰后的大小约284bp的目的基因片段,与慢病毒质粒载体连接后形成pUbi-apelin-FLAG-pSV40-EGFP重组质粒,测序结果与预期完全符合,并成功包装慢病毒颗粒。最佳MOI值为20,转染效率为（90.32±3.61）%。慢病毒载体能高效转染人脐带间充质干细胞且2周内持续稳定上调目的基因mRNA及蛋白的表达。结论重组质粒慢病毒载体pUbi-apelin-FLAGpSV40-EGFP可有效转染人脐带间充质干细胞,并可持续高表达apelin基因     

ABCC2基因过表达细胞株的建立及鉴定

目的 构建携带ABCC2基因的慢病毒载体,转染HEK293细胞,筛选出稳定过表达ABCC2基因的细胞株并进行鉴定,为体外实验确定与多药耐药相关蛋白2(MRP2)外排转运相关的底物药物及其转运机制提供细胞模型。方法 根据GenBank提供的ABCC2基因cDNA序列设计引物,PCR扩增该基因并将其连接至慢病毒载体PZE-LV105,包装病毒并感染HEK293细胞。用嘌呤霉素进行筛选得到过表达ABCC2基因的稳转细胞株,通过基因测序、实时荧光定量PCR(RTQ-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)对稳转细胞进行鉴定。结果 测序结果证明重组慢病毒过表达载体所携带的ABCC2基因序列与GenBank提供的ABCC2序列一致;RTQ-PCR分析结果显示转染了ABCC2基因的HEK293细胞中MRP2 的mRNA相对表达比正常HEK293细胞和空白载体对照HEK293细胞高出约320倍;蛋白免疫印迹试验显示,转染了ABCC2基因的HEK293细胞中MRP2蛋白表达水平比正常HEK293细胞和空白载体对照HEK293细胞高出约150倍。结论 该实验成功构建了稳定过表达ABCC2基因的细胞株,该细胞株可用于初步筛选确定MRP2的特异性外排转运底物及其转运机制。     

大鼠FasL基因重组慢病毒载体介导大鼠肾细胞体外转染

目的 探讨慢病毒载体对大鼠肾细胞体外转染的可行性.方法 三质粒系统共转染包装细胞293-T,合成重组慢病毒载体,P24gag EIISA对其定量测定.流式细胞术测定SD大鼠肾细胞Fas、FasL的表达.Western blot、RT-PCR检测转染后目的 基因的表达.结果 定量测定目的 基因载体、空白载体浓度分别为11.6 ng/ml、13.8 ng/ml,Western blot、RT-PCR分别检测到目的 基因的表达.结论 慢病毒载体体外成功转染SD大鼠肾细胞,并表达目的 基因.     

慢病毒介导HO-1基因转染猪骨髓间充质干细胞的表达

目的探讨重组血红素氧合酶1(HO-1)基因体外转染猪骨髓间充质干细胞(MSCs)应用于基因治疗的可行性。方法体外分离、培养并鉴定MSCs。采用具有高效转染非分裂期细胞的慢病毒载体系统将HO-1基因导入MSCs中;采用RT-PCR和绿色荧光蛋白(GFP)荧光技术检测目的基因的表达,台盼蓝染色及MTT法检测转染后细胞的增殖能力。结果慢病毒感染MSCs的感染复数为20,最佳感染率可达80%;MSCs表面高表达CD44和CD105;GFP荧光表达自96h开始逐渐增强;转染细胞中显示目的基因mRNA的表达;转染对MSCs存活及增殖几乎无影响。结论慢病毒载体可成功转染猪MSCs,并使其HO-1表达增高,转染对MSCs存活及增殖基本无影响。     

慢病毒介导抗菌肽PR-39基因在兔骨髓间充质干细胞中的表达及抗菌活性检测

目的 构建脯氨酸精氨酸抗菌肽(proline-arginine rich 39-amino acid peptide, PR-39)慢病毒载体,并转染兔骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSC),检测其在BMSC中的表达及抗菌活性。方法 PCR扩增目的克隆,并连接入慢病毒载体质粒pGC-FU中,与包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0在脂质体2000介导下共转染293T细胞生产慢病毒颗粒,Real-Time PCR法检测其滴度;分离培养BMSC,BMSC转染PR-39慢病毒,荧光显微镜观察及流式细胞仪检测其转染效率,RT-PCR检测PR-39基因表达,并检测PR-39抗菌活性。结果 成功包装出滴度为2×109 TU/mL的PR-39慢病毒载体,并转染BMSC,转染72 h后可观察到细胞呈现绿色荧光,转染效率为74.09%,同时RT-PCR检测BMSC表达PR-39基因,其上清液对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用,抑菌率为98.43% (P<0.05)。结论     

大鼠星状细胞激活相关蛋白基因的克隆及其重组腺相关病毒载体的构建

克隆大鼠星状细胞激活相关蛋白(Stellate Cell Activation-associated Protein,STAP)基因,构建其重组腺相关病毒载体(rAAV-STAP),为进一步研究STAP基因功能提供有效工具。用RT-PCR法从大鼠肝组织中扩增出大鼠STAP基因,将STAP cDNA插入腺相关病毒(AAV)表达质粒pAM/CAG中,构建重组质粒pAM/CAG-STAP。以磷酸钙共转染法将pAM/CAG-STAP及辅助质粒pAd/H22转染293细胞,经293细胞包装后得到复制缺陷型重组腺相关病毒rAAV-STAP。ELISA法测定病毒滴度,Western blot法检测重组病毒感染293细胞后STAP的表达情况。实验结果表明,RT-PCR法从大鼠肝组织中扩增出573bp cDNA,测序证实为大鼠STAP基因。Western blot法证实rAAV-STAP感染293细胞后可在细胞内表达STAP。     

巨细胞病毒IE2的红色靶基因与绿色荧光-慢病毒系统的建立及其对人神经干细胞的感染

目的 RNA干扰技术沉默连接红色荧光蛋白mCherry与靶基因巨细胞病毒IE2的表达,并初步研究慢病毒感染神经干细胞的可能性。方法以人巨细胞病毒IE2 mRNA编码序列作为干扰靶点,以慢病毒质粒UTG作为载体,构建靶向巨细胞病毒IE2的shRNA表达质粒,构建携带IE2的mCherry红色荧光蛋白的质粒作为验证shRNA有效性的靶点,并转染293FT细胞。通过红色荧光的表达及RT-PCR和Western Blot确定最佳沉默IE2序列后,将有效的UTG-IE2质粒与辅助质粒共转染293FT细胞,获取高滴度慢病毒。应用慢病毒感染人神经干细胞,观察神经干细胞被慢病毒感染的情况并检测神经干细胞的绿色荧光表达情况。结果成功构建IE2-shRNA慢病毒载体UTG-shRNA-IE2,RT-PCR及Western Blot结果显示慢病毒感染的293FT细胞IE2 mRNA及蛋白表达相对于对照组显著降低。构建的慢病毒可以成功感染神经干细胞。结论红色靶基因-绿色慢病毒系统具有简便的筛选性能;UTG慢病毒对神经干细胞具有较高感染效率,可实现慢病毒介导的RNA干扰在神经干细胞内的有效表达,并为相关研究提供技术支持。     

含IL-24基因重组慢病毒表达载体的构建及其对肝癌细胞生长的抑制作用

目的 探讨白细胞介素(IL)24基因表达目的蛋白IL-24的方法,检测IL-24对肝癌细胞生长的影响.方法 自经5μg/ml植物血凝素(PHA)刺激的正常人单个核细胞(PBMCs)中提取总RNA,RT-PCR扩增出IL-24 cDNA,插入到pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen中构建成慢病毒转移载体pHAGE-IL-24,转染HEK 293T细胞.荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达;梯度稀释法测定病毒滴度,感染HEK 293T细胞48 h后进行RT-PCR和Western blot检测IL-24的基因和蛋白表达;MTT法检测细胞的增殖.结果 限制性内切酶检测和基因测序证实成功构建了携带IL-24基因的慢病毒表达载体,滴度为5×106TU/ml.以MOI为5.0的重组慢病毒感染靶细胞HepG2 48 h后,能够检测到外源基因IL-24的蛋白表达.IL-24能够抑制肝癌细胞的生长.结论 成功构建了含IL-24基因的慢病毒表达载体,获得的病毒能够有效感染HepG2细胞,并在其中大量表达目的蛋白;IL-24能够抑制肝癌细胞的生长.     

副黏病毒Tianjin株NP蛋白的稳定表达及其检测

目的:构建副黏病毒Tianjin株NP基因的真核表达载体,转染HEK293细胞,经G418筛选出稳定表达NP蛋白的细胞.方法:应用RT-PCR技术克隆副黏病毒Tianjin株NP基因,插入真核表达载体pcDNA3.1(+).经PCR、酶切和测序鉴定后,将构建的pcDNA3.1(+)-NP用LipofectaminenTM2000转染试剂转染HEK293细胞.应用免疫荧光法及Western Blot检测NP蛋白的瞬时和稳定表达.结果:RT-PCR扩增得到NP基因,重组质粒pcDNA3.1(+)-NP转染HEK293细胞后,经免疫荧光法检测到目的蛋白的瞬时和稳定表达.Western Blot法可见NP蛋白瞬时和稳定表达的条带.结论:副黏病毒Tianjin株NP基因在HEK293细胞可以瞬时和稳定表达,为研究副黏病毒Tianjin株NP蛋白功能与病毒致病性、宿主亲嗜性奠定了基础.     

ST8Sia1基因过表达载体构建与鉴定及对人黑色素瘤细胞增殖的影响

目的构建ST8Sia1基因过表达载体,建立稳定过表达ST8Sia1的细胞株,检测ST8Sia1的表达及对细胞增殖的影响。方法通过PCR反应扩增ST8Sia1基因片段,双酶切目的基因片段和pEGFP-C1载体以及pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-ZsGreen-T2A-Puro载体,分别将目的基因片段和不同载体连接,得到ST8Sia1-pEGFP-C1重组载体和重组慢病毒载体。采用PCR方法和DNA序列进行鉴定。分别用不同载体转染黑色素瘤细胞WM451,筛选建立稳定过表达ST8Sia1的细胞株,Real-time PCR检测稳转细胞ST8Sia1 mRNA水平;Western blot法检测稳转细胞中ST8Sia1蛋白表达水平;CCK-8法检测稳转细胞的生长增殖活性;软琼脂克隆形成实验分析稳转细胞的克隆形成能力。结果成功构建ST8Sia1-pEGFP-C1重组质粒及ST8Sia1过表达慢病毒载体。发现ST8Sia1过表达慢病毒载体转染效率较高,建立稳定过表达ST8Sia1的WM451细胞株,发现ST8Sia1过表达促进肿瘤细胞增殖和克隆形成。结论成功构建了ST8Sia1过表达载体,并发现ST8Sia1过表达能够促进黑色素瘤细胞WM451的增殖、克隆形成能力。