液氮快速冷冻对地龙中水溶性蛋白组成和活性的影响

目的探讨低温炮制工艺对地龙水溶性蛋白质组成以及溶栓与抗肿瘤活性的影响。方法地龙的炮制采用传统与低温两种工艺,低温炮制采用液氮快速冷冻与冷冻干燥技术;采用SDS-PAGE与ImageTool软件,对两种炮制工艺的地龙蛋白质组成的差异进行定性与定量分析;应用纤维蛋白平板法与体外溶栓试验,定性与定量分析两种炮制工艺的纤溶活性的差异;应用显微观察与MTT法,对两种炮制工艺体外抑制人肝癌细胞增殖活性进行定性与定量比较分析。结果低温炮制工艺地龙的水溶性蛋白组成比传统炮制工艺丰富,SDS-PAGE的蛋白条带数与浓度明显高于传统工艺;两种炮制工艺的地龙蛋白液均具有显著的抗人肝癌细胞与纤溶活性,但低温炮制工艺的两种活性显著高于传统工艺。结论不同炮制工艺对地龙水溶性蛋白组成及其抗肿瘤与溶栓活性有显著影响;在保全地龙的蛋白质类药效成分的生物活性方面,低温炮制工艺优于传统炮制工艺。     

不同炮制工艺水蛭的水溶性蛋白组成的差异分析

目的:探讨分析不同炮制工艺水蛭的水溶性蛋白组成的差异。方法:根据水蛭不同的炮制方法,随机分为传统组和低温组,传统组采用传统炮制的方法,低温组使用低温炮制的方法,比较两组的水溶性蛋白组成的差异。结果:传统组的蛋白质最大分子量为44.7KD附近,低温组为44.7KD,两组在31KD左右蛋白质的含量分别为54.5%和88.9%,两组的蛋白浓度分别为1.85mg/g和2.46mg/g,两组具均有显著差异(P0.05)。结论:炮制工艺不同对自身的水溶性蛋白组成的差异具有较大的影响,值得深入研究和讨论。     

不同提取法炮制对水蛭体外溶栓活性的影响

目的:研究炮制对水蛭体外溶栓活性的影响。方法:采用水提取法和仿生提取法对水蛭净制品、烫制品、酒制品进行提取,选用纤维蛋白平板法和纤维蛋白原平板法,以平板上透明圈面积为指标进行纤溶活性测定;并建立体外血栓模型,通过血凝块的失重比进一步评价水蛭不同炮制品的溶栓活性。结果:水蛭在炮制前后均能在纤维蛋白平板上产生透明圈。采用水提取法时,烫制品和酒制品的溶圈面积减小,炮制后纤溶活性降低,活性顺序为:净制品酒制品烫制品。而采用仿生提取法时,显示烫制和酒制后水蛭纤溶活性升高,活性顺序为:烫制品酒制品净制品。体外血栓模型中,血凝块失重比结果与纤溶活性测定结果一致,采取水提取法时,炮制使溶栓活性降低,而采用仿生提取法时显示炮制使溶栓活性增加。结论:与水提取法比较,仿生提取法更符合水蛭经口服后在人体内的消化吸收过程,其结果更有说服力。传统炮制可增强水蛭溶栓活性。     

基于SDS-PAGE技术的不同水蛭炮制品中水溶性蛋白的差异性研究

目的考察不同水蛭炮制品中水溶性蛋白的差异性。方法制备水蛭样品;采用考马斯亮蓝法测定水溶性蛋白质含量;SDS-PAGE法比较各样品中的蛋白的种类和丰度差异性;以生物检定技术为基础,检查水蛭及其炮制品的抗凝血酶活性。结果所用水蛭及其炮制品的抗凝血酶活性有明显差异;SDS-PAGE结果表明水蛭及其炮制品的蛋白种类、含量皆有明显差异。结论不同炮制方法中,动物药水蛭水溶性蛋白的含量差异明显,传统的高温炮制方法使水蛭中蛋白质发生了降解,其高温炮制的科学内涵有待深入的研究。     

不同炮制方法对全蝎有效成分和活性的影响

目的研究不同炮制方法对全蝎有效成分和活性的影响。方法冻干全蝎采用冰箱预冷、冷冻干燥机干燥的方法加工,传统炮制参照《中国药典》2005年版方法;不同炮制工艺全蝎参照《中国药典》2010年版测定醇浸出物得率,水溶性蛋白的测定采用考马斯亮蓝法,抗肿瘤活性比较采用小鼠荷瘤试验。结果冻杀干燥法加工的全蝎醇浸出物得率显著高于传统清水煮制全蝎,但低于盐水煮制全蝎;水溶性蛋白的量也显著高于传统炮制品;抗肿瘤活性也显著强于传统炮制品。结论冻杀干燥法加工全蝎可以有效地防止其活性蛋白质因加热而变性失活和被水溶解而造成的损失,显著地提高其蛋白含量和抗肿瘤活性。     

水蛭炮制前后质量比较

目的:讨论炮制方法对水蛭的影响。方法:以热浸法测定水溶性浸出物与醇溶性浸出物的含量;以凝血酶法测定水蛭素的含量;以HPLC测定次黄嘌呤的含量。结果:生水蛭的含水量,水溶性浸出物含量,醇溶性浸出物含量,水蛭素含量,均高于制水蛭的含量,而制水蛭的次黄嘌呤含量则高于生水蛭的次黄嘌呤含量。结论:滑石粉炒水蛭使水蛭药性峻烈的活性成分含量降低,从而降低毒性,缓和其破血通经之性。     

水蛭不同炮制品抗凝血活性的比较

目的:应用抗凝血活性指标筛选水蛭炮制工艺。方法:按生物检定法测定各种炮制品水提取物的抗凝血时间,比较不同炮制方法对水蛭抗凝血活性的影响。结果:净制法和低温冷冻粉碎炮制法均能较好地保持水蛭抗凝血活性,而其它炮制方法炮制的水蛭抗凝血活性不强。结论:净制法炮制水蛭,能较好地保持抗凝血活性,且制作简便,是一种较好的炮制方法。     

水蛭不同工艺提取物抗凝与纤溶活性比较及酶解物组成分析

目的:比较水蛭不同提取工艺的抗凝溶栓作用;初步确定水蛭酶解产物的化学成分组成。方法:通过活化部分凝血活酶时间(APTT)试验及纤维蛋白平板试验,比较水蛭胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解、仿生酶解、醇提、水煎提取物的体外抗凝与纤溶活性差异。采用Sephadex G-100凝胶柱色谱法对优选提取物进行进一步分离纯化,并采用MALDI-TOF-质谱法对其组成进行分析。结果:与生理盐水组比较,在相同的剂量下,水蛭胃蛋白酶酶解物可明显延长大鼠APTT,并具有较强的纤溶作用,其余几种提取物的作用不明显。胃蛋白酶酶解物经Sephadex G-100凝胶柱色谱分离纯化的活性部位经MALDI-TOF-质谱法检测为分子量在700～3 200之间的一组寡肽。结论:胃蛋白酶酶解是水蛭较为理想的提取方法,其有效部位的组成为寡肽。     

黄黑小斑蝥纤溶活性蛋白分离纯化及性质研究

目的以药用斑蝥(Mylabris)为原料,从其中分离纯化得到一种具有纤溶性的蛋白MFP(Fibrinolyric Protein of Myla-bris)。方法采用硫酸铵分段盐分、透析和DEAE-32纤维素离子交换层析等纯化方法进行分离纯化,SDS-PAGE电泳测定其分子量,纤维蛋白平板法测定其纤溶活性。结果该目的蛋白相对分子质量约为95.5 kD,其水解纤维蛋白的相对比活力为14.7 u/mg;该成分在35℃下最稳定,65℃及以上活性丧失,金属离子K+,Na+对其活力无影响,Mn2+,Ca2+对其有明显抑制作用,最适pH为6.0。结论研究分离出的斑蝥活性蛋白确为一种具有纤溶性的蛋白组分,并证明其纤溶作用机理为纤溶酶原激活;体外溶栓实验表明,其对血栓的溶解具有一定作用;溶血实验结果表明,该纤溶活性蛋白溶液无溶血反应。     

黄瓜籽蛋白纤溶活性及抗凝溶栓作用研究

目的探讨黄瓜籽蛋白的纤溶酶活性、抗凝血和溶栓作用。方法纤溶酶活性测定采用纤维蛋白平板法;采用目内眦取血法和断尾法考察黄瓜籽蛋白对小鼠凝血和出血时间的影响;通过建立大鼠颈总动脉血栓模型,考察黄瓜籽蛋白的溶栓作用。结果黄瓜籽蛋白纤溶酶活性为:(1 632.26±117.33)IU/g;抗凝血实验对照组、黄瓜籽蛋白中、高剂量组小鼠出血时间和凝血时间均显著延长(p<0.01),表明黄瓜籽蛋白具有良好的抗凝血作用;溶栓实验结果表明,对照组、黄瓜籽蛋白低、中、高剂量组大鼠血栓湿重均显著减轻(P<0.01),对大鼠颈总动脉血栓形成具有明显的抑制作用。结论黄瓜籽蛋白具有较为显著的纤溶、抗凝血和溶解血栓的活性。     

动物药水蛭高温炮制的科学合理性

动物药主要含蛋白质,蛋白质是具有四级结构的有机大分子,具有热变性的属性,在高温条件下持续作用时,蛋白易变性而致其生物活性丧失、某些理化性质和生物化学性质改变。水蛭是经典的破血逐瘀类动物药。炮制入药历史悠久,其传统的炮制方法,无论是《中国药典》收载的滑石粉烫炒法还是北京地区的特色炮制工艺酒炙法,基本都需要高温处理,其炮制目的多局限于当时技术条件。该文从水蛭现有炮制工艺及其特点出发,对高温炮制前后水蛭的主要活性成分与药理活性的变化进行总结,分析结果表明高温炮制会使水蛭中的蛋白质变性;活性多肽水蛭素会被部分或完全破坏;炮制过程会使水蛭中铅(Pb)、汞(Hg)、镉(Cd)等有毒无机元素含量下降;加热也会促使水蛭中某些物质转化为具有降压、平喘、镇痛作用的次黄嘌呤,进而实现减毒和缓和药性的目的。高温对水蛭药理活性的影响主要表现在抗凝活性、抗血栓活性等方面。该文在了解动物药水蛭炮制研究现状的同时,对水蛭高温炮制科学合理性未来的研究手段和研究方向提出思考。     

水蛭免加热提取物抗凝血作用及其机制研究

目的 :观察水蛭免加热提取物对动物凝血系统、凝血因子活性及纤溶系统的影响 ,并与水蛭煎煮浓缩物进行比较。方法 :动物灌胃给药 ,凝固法测大鼠 PT、APTT,PT法测血浆凝血因子 、 、 、 的活性 ,APTT法测因子 的活性 ,测 EL T观察药物对家兔纤溶活性的影响。结果 :水蛭免加热提取物能延长大鼠 PT、APTT,抑制凝血因子 、 、 的活性 ,对凝血因子 和 活性无明显影响 ;对兔血 EL T无明显影响 ,在延长大鼠 PT、降低大鼠凝血因子 、 活性等方面优于传统的煎煮提取物。结论 :水蛭免加热提取物通过抑制凝血因子 、 、 活性而抑制内、外源性凝血途径 ,对大鼠 PT、凝血因子 、 活性的影响优于传统的煎煮提取物     

地龙的鲜品和干品可溶性蛋白及纤溶酶活性的对比研究

目的:对比研究地龙的鲜品和干品的可溶性蛋白及纤溶酶活性.方法:采用Bradfold方法测定蛋白含量,SDS-PAGE进行蛋白谱带的分析,并采用琼脂糖-纤维蛋白平板法进行纤溶酶活性的测定.结果:以干燥品计,鲜品的蛋白提取率为( 13.89±0.86)％,蛋白含量为(63.14±0.38)％,体外纤溶酶活性为(8 743 ±17) IU·g-1;干品蛋白提取率为(9.82±0.75)％,蛋白含量为(45.16 ±0.12)％,体外纤溶酶活性为(206±14) IU·g-1;SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,鲜品共显示12条蛋白谱带,干品的谱带较少,且不清晰.结论:鲜地龙的可溶性蛋白提取率、含量及体外纤溶酶活性均明显高于干品,且蛋白组分有较大的差异.     

基于CRITIC法计算权重系数的Box-Behnken响应面法优化栀子炭微波炮制工艺研究

目的优化栀子炭微波炮制工艺。方法以HPLC法测定传统炒制方法炮制的栀子炭中京尼平苷及鞣质的量作为评价指标,采用CRITIC法计算权重系数,结合Box-Behnken响应面法,优化栀子炭微波炮制工艺,并对栀子炭微波炮制品的药效进行验证。结果 CRITIC法得出炒制栀子炭京尼平苷、鞣质的权重系数分别为0.27、0.73,微波炮制栀子炭的Box-Behnken响应面法得出最佳工艺为微波功率600 W,微波时间6 min,样品质量120 g,京尼平苷、鞣质量分别为35.19、4.76 mg/g。通过药效验证表明微波炮制栀子炭与传统炒制栀子炭均能够缩短小鼠的出血时间和凝血时间,两者药效无明显区别。结论微波炮制工艺节能高效、可操作性强,该方法可以作为丰富传统炮制工艺的一种手段和方法。     

不同加工工艺鹿茸的蛋白成分和活性比较

比较冻干、冷冻和传统热加工工艺制备的鹿茸药材的蛋白成分和活性差异,并探讨加工工艺对鹿茸药效的影响.用Folin-酚法测定冻干鹿茸水溶性蛋白含量最高(126.54 mg/g),为热炸茸的13.1倍;蛋白在SDS-PAGE电泳上分布广,以分子量60.0 kDa～50.0 kDa的蛋白浓度最高.冻干鹿茸水提物促大鼠成骨样细胞增殖活性(MTT法)高达245.25%,是传统热炸鹿茸的2.2倍;IGF-I分泌量也高达66.3 ng/ml,是热炸茸的1.2倍;抑制肝癌细胞活性为47.64%,是热炸茸的1.4倍.冷冻鲜茸的活性虽低于冻干茸,但也远高于热炸茸.结果说明冻干有可能最大限度地保存鹿茸的活性蛋白,有利于提高鹿茸的药效.     

中药水蛭经炮制后的成分变化研究

目的：探讨水蛭经炮制后的化学成分变化情况,为水蛭的炮制方法提供一定的化学依据。方法：采用HPLC－柱后衍生化法测定了氨基酸组成的变化,用GC－MS法测定了甾体类化合物组成的变化。结果：水蛭经炮制后各种氨基酸的量有所降低,甾体类化合物组成发生了变化。结论：结果显示现行的水蛭炮制方法对其成分有较大的影响。     

抗凝血酶活性物质的提取工艺研究

目的:优化中药水蛭中抗凝血酶活性物质的提取工艺,为中药水蛭中抗凝血酶物质的提取提供科学依据。方法:以测得的水蛭素含量和蛋白质含量计算出水蛭素的比活力作为评价指标,采用正交实验设计法确定最佳的提取工艺。结果:实验确定的最佳提取工艺为:在温度为70℃下提取3次,每次30m in。结论:实验优化了中药水蛭中抗凝血酶物质的提取工艺,为传统中药水蛭中抗凝血酶活性物质的提取提供了依据。     

水蛭饮片规格质量的调查及实验研究

调查及实验证明,水蛭以蚂蟥为主流药用品种。切丝入药溶出效果最优。对水蛭3种炮制品的质量从浸出物限量、薄层层析、蛋白电泳、体外抗凝效价方面进行了定量、定性研究。