反义人端粒酶RNA组分基因对胃癌细胞端粒酶活性的影响

目的 克隆人胃癌细胞端粒酶RNA组分（hTR）基因片段并构建其正交和反义真核表达载体，研究反义端粒酶RNA对人胃癌细胞株MKN－45端粒酶活性的影响。方法 采用RT－PCR方法从人胃癌细胞株MKN－45中扩增出人hTR部分cDNA序列，将该片段分别正向的反向插入PEF6V5－His-TOPO载体后构建人端粒酶RNA组分（hTR）基因正，反义真核表达载体，随后采用脂质体转染法将该正，反义载体转染入人胃癌细胞株MKN－45，用TRAP法观察后端粒酶活性的改变。结果 所克隆的基因片段其碱基序列与献报导完全一致，且插入载体的方向完全正确。与正常对照，转染正义载体，空载体比较，转染反义载体端粒酶活性显下降。结论 本实验已成功克隆和人端粒酶RNA组分（hTR）基因的部分序列并成功构建hTR正反义真核表达载体，而且反义端粒酶RNA能有效降低人胃癌细胞株MKN－45端粒酶活性。     

反义人端粒酶RNA组分基因对胃癌细胞端粒酶活性的影响

目的 克隆人胃癌细胞端粒酶RNA组分（hTR）基因片段并构建其正义和反义真核表达载体,研究反义端粒酶RNA对人胃癌细胞株MKN-45端粒酶活性的影响。方法 采用RT-PCH方法从人胃癌细胞株MKN-45中扩增出人hTR部分cDNA序列,将该片段分别正向和反向插入PEF6/V5-His-TOPO载体后构建人端粒酶RNA组分（hTR）基因正、反义真核表达载体,随后采用脂质体转染法将该正、反义载体转染入人胃癌细胞株MKN-45,用TRAP法观察后者端粒酶活性的改变。结果 所克隆的基因片段其碱基序列与文献报导完全一致,且插入载体的方向完全正确。与正常对照、转染正义载体、空载体者比较,转染反义载体者端粒酶活性显著下降。结论 本实验已成功克隆了人端粒酶RNA组分（hTR）基因的部分序列并成功构建hTR正反义真核表达载体,而且反义端粒酶RNA能有效降低人胃癌细胞株MKN-45端粒酶活性。     

靶向CXCR1基因的shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建靶向化学趋化因子受体1（CXCR1）的短发夹小干扰RNA（shRNA）质粒表达载体。方法：针对人CXCR1基因的mRNA序列,按RNA干扰靶位点的设计原则,设计并构建靶向CXCR1基因的3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经酶切和测序确认构建成功后,转染胃癌细胞MKN45,RT-PCR和Western blot检测CXCR1 mRNA和蛋白的表达。结果：经酶切和测序证实,3个靶向CXCR1基因的shRNA真核表达质粒均构建成功;与未转染和转染阴性对照质粒的MKN45细胞比较,转染3种shRNA质粒的MKN45细胞,CXCR1 mRNA和蛋白水平均明显下调（均P<0.05）。结论：靶向CXCR1基因的shRNA真核表达质粒的成功构建,为进一步研究CXCR1在胃癌中的功能和实验性靶向治疗提供了初步的基础。

     

吲哚胺2,3双加氧酶表达对人胃癌细胞免疫逃逸的影响

目的 探讨转染人吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)基因的胃癌细胞系的IDO表达与免疫逃逸的关系.方法 根据IDO基因编码序列,构建真核表达载体pIRES_2-EGFP-IDO,电转染胃癌BGC-823细胞,用G418筛选稳定表达IDO细胞株.用RT-PCR和Western blot检测其IDO mRNA和IDO蛋白表达,测定培养上清中色氨酸和犬尿氨酸的水平.分离胃癌患者外周血T细胞,与转染细胞及加入1甲基色氨酸(1-MT)的细胞共孵育,检测对细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和T细胞增殖的影响.结果 pIRES_2-EGFP-IDO真核载体经酶切验证并测序后证实连接成功.稳定表达IDO的BGC-823细胞IDO mRNA明显高于未转染组和对照组,并有IDO蛋白表达.转染组和未转染组色氨酸水平分别为(3.23±0.53)mg/L、(6.03±0.51)mg/L(t=13.32,P=0.000),犬尿氨酸浓度分别为(4.84±0.11)mg/L、(1.83±0.10)mg/L(t=42.916,P=0.000).转染IDO组、1-MT逆转组、转染空质粒组、BGC-823组之间对T淋巴细胞增殖抑制相比差异均有统计学意义(F=114.817,P=0.000),转染IDO组和1-MT逆转组抑制率明显高于转染空质粒组及BGC-823组,同时逆转组抑制率低于转染IDO组(P<0.05).4组CTL杀伤活性之间相比差异均有统计学意义(F=397.449,P=0.000).转染IDO组和1-MT逆转组杀伤活性明显低于转染空质粒组及BGC-823组,同时逆转组CTL杀伤活性也明显高于转染IDO组(P<0.05).结论 IDO转染胃癌细胞后显示IDO抑制了T细胞的增殖和CTL活性,参与胃癌的免疫逃逸作用.     

分化和DNA结合抑制因子1基因对乳腺癌细胞株MCF-7增殖活性及分泌血管内皮生长因子的影响

目的 观察分化和DNA结合抑制因子1(Id1)基因对人乳腺癌细胞增殖活性以及分泌血管内皮生长因子(VEGF)能力的影响.方法 将正义、反义Id1基因真核表达载体以及空载体分别转染乳腺癌MCF-7细胞株,经潮霉素筛选获得稳定细胞株;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学染色检测Id1 mRNA及Id1蛋白、VEGF蛋白表达;细胞计数、噻唑蓝(MTT)比色法及流式细胞仪检测细胞增殖活性及细胞周期;酶联免疫吸附试验( ELISA)检测细胞上清液中VEGF浓度.结果 与空载体转染细胞比较,转染正义Id1载体的MCF-7细胞中Id1 mRNA和Id1蛋白、VEGF蛋白表达水平上调,细胞生长加速(P＜0.05);而反义Id1载体转染组细胞Id1、VEGF表达下降,细胞增殖速度降低(P＜0.05).流式细胞检测结果显示,正义Id1转染组增殖期细胞(S+G2+M)比例为(48.45 ±2.97)％,空载体组为(32.40±0.49)％,反义Id1组为(23.08±1.56)％,各组间差异有统计学意义(P＜0.01);3组细胞凋亡指数分别为(3.26±1.28)％、(7.42±1.04)％和(11.83 ±1.59)％,组间差异有统计学意义(P＜0.01);正义Id1转染组细胞上清液中VEGF浓度较空载体组显著增高(P＜0.01),反义Id1组VEGF分泌量则较空载体组显著降低(P＜0.05).结论 Id1基因与乳腺癌MCF-7细胞增殖活性、细胞周期调控及VEGF分泌能力相关.     

T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1反义寡核苷酸转染对胃癌细胞形态及侵袭移行能力的影响

目的观察T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1（Tiam 1）反义寡核苷酸（ASODN）转染对胃癌细胞形态及体外侵袭、移行能力的影响。方法采用层黏连蛋白黏附法，由胃癌MKN-45细胞株（M0）中筛选获得高侵袭转移亚株（MH）。以脂质体介导将Tiam 1 ASODN转染至MH细胞中，并应用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）及流式细胞技术分别检测Tiam 1 mRNA和蛋白的表达。采用苏木精-伊红染色、细胞骨架蛋白染色、扫描电镜技术及Boyden小室法分别观察转染与未转染MH细胞在形态学及体外侵袭、移行能力方面的变化。结果与对照组相比，应用0．43μmol／L Tiam 1 ASODN转染可特异性抑制胃癌MH细胞中Tiam 1 mRNA和蛋白的表达（P〈0．01）。Tiam 1 ASODN转染MH细胞较未转染MH细胞的体外侵袭、移行能力显著下降（P〈0．05或P〈0．01），同时转染MH细胞较未转染MH细胞膜表面突起及伪足变稀疏或缩短、细胞骨架结构紊乱程度降低、斑点状肌动蛋白小体减少。结论特异性ASODN转染可有效抑制Tiam 1在胃癌细胞中的表达并削弱其体外侵袭、移行能力，这可能是通过调整胃癌细胞骨架结构重组、降低其变形、游走能力而实现的。     

Hedgehog信号通路在胃癌细胞中活化并通过GLI1促进MKN28细胞增殖

目的研究Hedgehog：（HH）信号通路在胃癌细胞中的活化形式及其转录因子GLI1对胃癌细胞增殖和体外成瘤能力的影响。方法通过反转录PCR分析HH通路相关组成分子在7株细胞系中的表达情况．化学合成针对HH信号通路转录因子GLI1的siRNA并转染胃癌MKN28细胞。通过CCK8法和体外克隆形成实验．观察GLII siRNA转染胃癌MKN28细胞后的细胞增殖能力和克隆形成能力的变化。结果在不同胃癌细胞株中．HH信号通路各相关基因的表达情况存在差异,SHH在6株胃癌细胞系中均表达上调．PTCH在KATOⅢ细胞系、SUFU在MKN28和KATOⅢ表达下调。转染GLI1 siRNA后,MKN28细胞中GLI1 mRNA表达受到明显抑制;经GLI1 siRNA作用的MKN28细胞生长明显缓于阴性对照和未处理组（P=0．014）,克隆形成数目及体外克隆形成能力降低（P〈0．001）。结论HH信号通路在胃癌细胞系中被普遍激活,HH信号通路活化后可通过转录因子GLI1促进MKN28细胞增殖．     

反义抑制Tiam 1对胃癌细胞形体重塑影响的实验研究

目的观察T淋巴细胞瘤侵袭转移诱导因子1（Tiam1）反义寡核苷酸（ASODN）转染对胃癌细胞形体重塑的影响。方法采用层粘连蛋白黏附法，由胃癌MKN-45细胞株（MH）中筛选获得高侵袭转移亚株（MH）。以脂质体介导将Tiam1ASODN转染至Mn细胞中，并应用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）及流式细胞技术分别检测Tiam1mRNA和蛋白的表达。采用HE染色、细胞骨架蛋白染色及扫描电镜技术观察转染与未转染M。细胞在形态学方面的不同。结果与未转染组相比，应用0．43μmol／LTiam1ASODN转染可特异性抑制胃癌M。细胞中Tiam1 mRNA和蛋白的表达（P〈0．01）；转染Mn细胞的膜表面突起及伪足变稀疏或缩短，细胞骨架结构紊乱程度降低，斑点状肌动蛋白小体减少。结论特异性ASODN转染可有效抑制Tiam1在胃癌细胞中的表达及胃癌细胞形体重塑，这可能对胃癌细胞的侵袭转移产生影响。     

微小RNA-148a对胃癌细胞MKN45增殖能力的影响及机制研究

目的：探讨微小RNA（miR）-148a对人胃癌细胞增殖的影响及可能机制。方法采用实时定量PCR技术检测60例胃癌组织及癌旁组织中miR-148a的表达水平。利用慢病毒包装建立稳定表达miR-148a的MKN45细胞系为转染组,未转染的MKN45细胞系为对照组。 CCK8法检测MKN45细胞的增殖情况,通过targetscan预测miR-148a的靶基因,Western-blot检测靶基因的表达水平。结果54例（90．0％,54/60）胃癌组织中miR-148a的表达量较癌旁组织下调,其中37例（61．7％,37/60）下降2倍以上;淋巴结转移、有无癌旁血管浸润及TNM分期Ⅲ～Ⅴ期者其表达量明显降低（P＜0．05）。转染miR-148a后3 d,MKN45细胞生长明显受抑,转染组吸光度值（0．978±0．091）明显低于对照组（1．182±0．074,P＝0．000）。转染组CDC25B（通过targetscan发现的miR-148a靶基因）蛋白表达较对照组明显降低。结论 miR-148a在胃癌组织中的表达明显低于癌旁组织;其具有抑制胃癌细胞增殖的作用,CDC25B可能是miR-148a发挥抑癌作用的靶基因。     

PTEN-PI3K/AKT信号传导途径对胃癌细胞株MKN28凋亡的影响

目的 探讨PTEN-PI3 K/AKT信号传导途径对胃癌细胞株MKN28凋亡的调控作用及其机制.方法 构建PTEN真核表达载体,转染至胃癌细胞株MKN28中(转染组);同样方法转染空载体和等量的PBS分别作为阴性对照组和空白对照组,检测对胃癌细胞株MKN28凋亡的影响及对PI3K、AKT、Caspase-3、Caspase-9的影响.MTT检测细胞生长曲线,TUNEL染色法检测细胞凋亡,Western blot检测蛋白的表达.PI3K抑制剂LY294002处理未转染PTEN的胃癌细胞株MKN28(处理组);对照组加入等量的PBS,抑制PI3K活性后检测细胞凋亡蛋白及凋亡相关蛋白的表达.组间比较采用t检验,时间依赖性检验采用相关分析方法.结果 成功构建PTEN真核表达质粒并转染至胃癌细胞株MKN28中,获得稳定过表达PTEN的细胞模型.MTT检测发现转染组胃癌细胞株MKN28生长明显受到抑制,且呈时间依赖性(r =0.938,P＜0.05).转染组平均凋亡率达到27.86％ ±4.78％,明显高于阴性对照组的0.01％±0.01％(t=9.527,P＜0.05).转染PTEN后,转染组PI3K蛋白表达量为0.25±0.03,明显低于空白对照组的0.93 ±0.16及阴性对照组的0.96±0.15(t=7.235,8.883,P＜0.05).转染组活化的AKT (P-AKT)蛋白表达量为0.21±0.03,明显低于空白对照组的0.93 ±0.13及阴性对照组的0.91±0.12(t =9.347,9.802,P＜0.05).而转染组凋亡相关蛋白Caspase-3及Caspase-9表达量分别为0.86±0.11和0.87±0.12,明显高于阴性对照组的0.16±0.03和0.18 ±0.04及空白对照组的0.15±0.02和0.16 ±0.03(t=10.634,10.999,9.448,9.942,P＜0.05).抑制PI3K活性后,处理组细胞凋亡率为28.60％ ±4.50％,明显高于对照组的0.12％±0.06％(t=10.961,P＜0.05).Western blot检测发现处理组PI3K和P-AKT的蛋白表达量分别为0.18 ±0.02和0.11 ±0.01,明显低于对照组的0.93 ±0.14和0.90 ±0.12(t =9.186,11.363,P＜0.05);同时处理组PTEN的蛋白相对表达量为1.15 ±0.15,明显高于对照组的0.21±0.08(t =9.577,P＜0.05).处理组的凋亡相关蛋白Caspase-3及Caspase-9相对表达量分别为0.86 ±0.12和0.88 ±0.11,明显高于对照组的0.25±0.02和0.21±0.03(t =8.685,10.178,P＜0.05).结论 高表达PTEN可以抑制PI3K/AKT途径,促进胃癌细胞凋亡;抑制PI3K途径可以促进PTEN的表达,两者之间相互作用,共同调控着胃癌细胞的凋亡.     

C2基因对人胃癌细胞周期的影响

目的 探索新克隆的编码人蛋白翻译起始因子的全长基因（C2基因）对细胞周期的影响及与细胞凋亡的关系。方法 构建C2基因真核表达载体,转染人胃癌细胞系SGC7901,获得瞬时和稳定表达C2蛋白的人胃癌细胞株,应用流式细胞分析法检测C2蛋白在转染细胞上的表达和转染细胞细胞细胞周期的改变并在电镜下观察转染细胞超微结构的改变。结果 成功构建了C2基因真核表达载体;流式细胞分析法检测转染细胞C2蛋白表达率为32．3％,空白对照为0．9％;细胞周期检测提示瞬时和稳定转染了C2基因的细胞均发生凋亡;电镜下可见转染了C2基因的胃癌细胞发生凋亡。结论 C2基因转染可引起胃癌细胞发生凋亡,机制有待进一步研究。     

γ-synuclein基因真核表达载体的构建及其对结肠癌细胞SW1116体外侵袭转移潜能的影响

目的构建针对γ-synuclein基因的真核表达载体并观察其对结肠癌细胞sw1116体外侵袭及与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）黏附能力的影响。方法从结肠癌细胞系HT29提取总RNA,经RT．PCR获得γ-synucleincDNA全长片段,经过酶切连接等反应定向克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1上,以脂质体转染的方法将重组质粒转染至结肠癌细胞系SW1116,经G418筛选出稳定转染的细胞株。采用Transwell小室法检测细胞体外侵袭能力。将细胞接种于铺有HUVEC的96孔板中,酶标仪读取荧光强度来表示黏附细胞的相对数。结果成功构建pEGFP-γ-synuclein真核表达载体,经过筛选后可在SW1116细胞中稳定表达,且能在体外翻译出GFP-γ-synuclein融合蛋白质。转染γ-synuclein后,穿过Matrigel胶及Transwell小室膜的细胞数明显增加（198．4±20．7比98．8±13．2,P〈0．05）,与HUVEC黏附的细胞数（荧光强度）亦显著增加（3．08±0．36比1．22±0．21,P〈0．05）。结论γ-synuclein可显著增强结肠癌细胞SW1116体外侵袭转移潜能。     

T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1与胃癌细胞侵袭移行能力的相关性研究

目的：检测T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1（Tiam1）在胃癌细胞株中的表达并分析其与胃癌细胞侵袭、移行能力的关系。方法：采用层黏连蛋白黏附法，从胃癌MKN-45细胞株（Mo）中筛选获得高黏附亚株（Mh）和低黏附亚株（ML）。应用RT-PCR和SABC免疫组化技术分别检测Tiam 1mRNA与蛋白在Mo、ML、Mh细胞中的表达。应用Boyden小室测定Mo、ML、Mh细胞的体外侵袭、移行能力并分析其与Tiam1表达间的关系。结果：胃癌MKN-45细胞高黏附亚株（MH）的体外侵袭、移行能力均较MKN-45细胞（Mo）及其低黏附亚株（Mo为强（P〈0.05），但Mo与ML细胞间无差异（P〉0.05）。Tiam 1mRNA和蛋白在MH细胞中的表达均较其在Mo和ML细胞中的表达为强（P〈0.05），但在Mo与ML细胞中的表达无差异（P〉0.05）。Tiam1蛋白和mRNA表达水平与胃癌细胞体外侵袭、移行能力呈正相关（P〈0.05或P〈0.01）。结论：Tiam1基因表达水平升高有可能促进胃癌细胞侵袭、移行能力的增强。     

shRNA-CXCR4对人胃癌BGC823细胞增殖迁移的影响

目的 构建针对人CXCR4基因的shRNA干扰表达载体,观察CXCR4基因表达对人胃癌细胞株BGC823细胞增殖和迁移能力的影响.方法 根据人CXCR4序列设计并构建CXCR4基因的shRNA真核表达载体,以脂质体转染的方法将CXCR4干扰质粒转染至人胃癌细胞株BGC823,经G418筛选出稳定转染的阳性细胞,应用流式细胞仪技术检测其细胞周期变化,噻唑蓝(MTT)比色法检测CXCR4干扰对胃癌细胞增殖的影响,采用Trans-well小室法检测细胞体外迁移能力.结果 经测序证明CXCR4的shRNA基因已成功插入Psilencer4.1质粒中,构建的干扰质粒能够显著抑制CXCR4的表达,CXCR4 mRNA被抑制了(2.7±0.2)倍(P＜0.01).CXCR4基因的表达下调将胃癌细胞阻滞在G1期(由84.2％升至94.1％),MTT法检测CXCR4-shRNA干扰细胞增殖(P＜0.05),且穿过Trans -well小室膜的细胞数显著下降(P＜0.05).结论 干扰CXCR4的表达可显著抑制胃癌细胞的增殖和迁移能力.     

能稳定表达外源抑癌基因PTEN的胆管癌细胞系QBC939的建立

目的：为研究抑癌基因PTEN对胆管癌细胞生物学行为的影响，建立能稳定表达外源PTEN的胆管癌细胞系。方法：将野生型、突变型PTEN质粒和空载体质粒分别转化细菌，提取纯化后，脂质体介导法转染体外培养的胆管癌细胞系QBC939;嘌呤霉素筛选抗性克隆;Western blot 检测标签蛋白HA的表达;RT-PCR， Western blot和免疫细胞化学法分析目的基因PTEN的表达。结果：野生型、突变型PTEN和空载体转染细胞株均获得嘌呤霉素抗性;野生型和突变型PTEN转染细胞株均检测到ＨＡ的表达，而空载体转染细胞株和未转染细胞株均未检测到ＨＡ的表达;野生型及突变型PTEN转染细胞株中目的基因PTEN在mRNA和蛋白质表达水平上均较空载体转染细胞株和未转染细胞株增强。结论：成功构建了分别能稳定表达外源野生型PTEN，突变型PTEN或空载体pBP的胆管癌细胞系。     

PTEN基因对人胃癌细胞SGC-7901的生物学效应

目的　研究PTEN基因对人胃癌细胞SGC 790 1增殖、细胞周期及凋亡的影响。方法　将携带有PTEN基因的真核表达载体pBabe Puro PTEN以及pBabe Puro ,以脂质体介导的基因转染方法转入SGC 790 1细胞系中 ,嘌呤霉素筛选获得稳定表达PTEN基因的转染细胞 ,通过细胞活力实验、流式细胞仪和DNA凝胶电泳 ,观察PTEN基因对SGC 790 1细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。结果稳定转染PTEN基因的SGC 790 1细胞中PTEN蛋白稳定表达 ,转染PTEN基因的SGC 790 1细胞生长速度较对照组明显减慢。流式细胞仪显示 ,细胞周期发生G1期阻滞。转染PTEN的细胞在透射电镜下可出现典型的凋亡形态学的改变 ;细胞核DNA琼脂糖凝胶电泳显示凋亡细胞特有的“梯状”条带 ,而对照组没有出现。结论　外源性PTEN基因导入SGC 790 1细胞后 ,可引起SGC 790 1细胞G1期阻滞 ,抑制肿瘤细胞增殖 ,并促进凋亡的发生     

尾型同源盒基因2基因表达对胃癌细胞生长影响的研究

目的 观察尾型同源盒基因2(Cdx2)基因过表达对胃癌细胞生物学性状的影响.方法 构建人Cdx2真核表达载体,并转染胃癌细胞MGC-803.实验分为四组:未转染组、转染pCMVHA组、转染pCMV-GAPDH-HA组、转染pCMV-Cdx2-HA组.应用荧光定量PCR检测各组Cdx2基因的表达情况,Western blot法检测各组Cdx2蛋白的表达情况,MTT法观测细胞增殖,透射电镜观察转染细胞形态学的改变,流式细胞仪分析细胞周期和凋亡.结果 成功构建了pCMV-Cdx2-HA真核表达载体,在瞬时转染pCMV-Cdx2-HA质粒48 h的MGC-803细胞有较高水平的Cdx2基因mRNA和蛋白的表达;与未转染组、转染pCMV-HA组、转染pCMV-GAPDH-HA组比较,转染pCMV-Cdx2-HA组的胃癌细胞在转染72 h时生长受到明显抑制,G0/G1期比例上升,S期比例下降,胃癌细胞的凋亡率也明显升高(P＜0.05);转染pCMV-Cdx2-HA的胃癌细胞胞核消失,核染色质固缩、解体,内质网、高尔基复合体膨大成泡状.结论 Cdx2基因可明显抑制胃癌细胞的生长,提示Cdx2参与了胃癌的生长调控.