透明质酸/聚酰胺-胺三元纳米基因复合物的构建及其体外评价

目的 在聚酰胺-胺(polyamidoamine,PAMAM)树状大分子与DNA形成复合物的基础上添加透明质酸(hyaluronic acid,HA)形成三元纳米复合物,研究其基因递送性能的改变.方法 配制不同电荷比的三元纳米复合物,测定其粒径和电位;选择MCF-7和MDA-MB-231细胞进行转染效率的测定,选择B16和MCF-7细胞进行细胞毒性的测定.结果和结论 形成的三元纳米复合物大小均一,结构稳定.与单纯的PAMAM载体相比,增加HA提高了转染效率,降低了细胞毒性,适合用于基因的递送和转染.     

可生物降解多肽基因载体的构建与体外评价

目的 制备一种应用于基因递送系统的硫辛酸修饰的聚精氨酸多肽纳米复合物,并考察其对人胚肾细胞系HEK293细胞的转染效率及细胞毒性.方法 以不同量的半胱氨酸作为交联剂,合成4种不同交联度的还原性硫辛酸修饰的交联聚精氨酸组氨酸(LHRss),利用1H NMR和凝胶色谱鉴定合成的LHRss.取质粒DNA (pDNA)和LHRss以不同氮磷比(N/P)自组装形成纳米复合物,用粒度测定仪测定复合物的粒径和zeta电位,凝胶阻滞电泳测定载体LHRss对pDNA的包裹能力.用LHRss/pDNA纳米复合物与HEK293细胞共同培养,考察不同交联度复合物的细胞摄取情况及相关基因转染情况,并测定不同纳米复合物对HEK293细胞的细胞毒性.结果 通过结构鉴定确定LHRss多肽合成成功.组装形成的纳米复合物粒径分布均匀,N/P≥40时LHRss3/pDNA及LHRss4/pDNA复合物的zeta电位均大于30 mV.凝胶阻滞电泳结果显示N/P值为5时,LHRss3可完全包裹pDNA.当N/P值为40时,HEK293细胞对LHRss3/pDNA的摄取及转染效率高于其他3种复合物及单体硫辛酸修饰的聚精氨酸组氨酸(LHR);其中LHRss3/pGL3复合物的平均荧光强度约为LHR/pGL3复合物的3.98倍,差异具有统计学意义(P＜0.05).细胞毒性实验显示LHR/pGL3及不同交联度LHRss/pGL3转染HEK293细胞24 h后,细胞存活率均在80％以上,其毒性作用均低于bPEI-25K(20 μg/mL bPEI-25K转染细胞24 h后细胞存活率为25％左右,P＜0.05).结论 制备的硫辛酸修饰的聚精氨酸多肽纳米复合物有望成为一种高效的基因载体.     

聚乙二醇化聚酰胺-胺树枝状材料的制备及其细胞毒性研究

目的聚酰胺-胺树枝状材料（PAMAM）作为药物载体具有较好的结构优势,通过聚乙二醇（PEG）修饰后,制备低毒的复合物。方法调整PAMAM与PEG比例合成PAMAM-PEG复合物,并用。H—NMR,粒径-Zeta电位仪对其进行表征;采用MTF法检测细胞的存活率和溶血试验考察细胞溶血毒性。结果本实验获得了三种PAMAM—PEG复合物;与PAMAM处理组比较,复合物处理的KB细胞存活率显著提高,细胞的溶血率显著降低,并呈剂量一效应依赖性。结论PAMAM具有一定的细胞毒性,随聚乙二醇化程度的增加,其对KB细胞体外抑制活性降低,溶血毒性降低。     

可降解非病毒基因载体PEG-b-(PG-g-PEI)的合成与表征

目的结合重组低分子量PEI 和PEG结构修饰两种手段合成出新型可生物降解的非病毒基因载体聚乙二醇-b-(聚谷氨
酸-g-聚乙烯亚胺)。方法用相对分子质量600 的聚乙烯亚胺氨解嵌段聚合物PEG-b-PBLG,合成非病毒基因载体聚乙二
醇-b-(聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺);利用核磁共振氢谱、凝胶渗透色谱、激光粒度分析仪、zeta电位仪和凝胶电泳对载体及其与DNA
复合物进行了表征,并通过体外细胞实验考察了载体的细胞毒性与转染效率。结果我们成功合成出窄分布的非病毒基因载体
聚乙二醇-b-(聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺);凝胶电泳测定结果表明当N/P比大于5时载体能很好地包裹DNA;载体与DNA形成的
复合物粒径为120 nm,zeta电位25 mV;通过MTT实验和体外质粒转染实验显示出载体在测量范围内具有极低的细胞毒性和
很高的转染效率。结论聚合物聚乙二醇-b-(聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺)有望作为非病毒基因传递载体。
     

对叔丁基杯[4]芳烃酸偶合低相对分子质量聚乙烯亚胺作为非病毒转基因载体的体外研究

目的合成对叔丁基杯[4]芳烃酸偶合低相对分子质量聚乙烯亚胺聚合物作为非病毒转基因载体,并评价其毒性、压缩DNA的能力,携带报告基因转染细胞的能力。方法采用新方法合成对叔丁基杯[4]芳烃酸偶合聚乙烯亚胺聚合物,通过核磁共振方法表征。将合成的新聚合物与DNA混合,得到新聚合物/DNA复合物,用琼脂糖电泳试验测定不同N/P比值形成复合物时对质粒DNA电泳的阻滞情况,评价其压缩DNA能力。透射电镜法检测复合物的大小,MTT法检测其对细胞的毒性作用,使用新聚合物携带报告基因转染细胞,并与PEI25000比较转染率。结果新聚合物压缩质粒DNA的能力随N/P比值增大而增强,在N/P比为6时可以完全阻滞质粒DNA的电泳,在N/P比为60时,复合物粒径约291 nm,复合物的表面电荷约14.6 m V。细胞毒性试验表明新聚合物与PEI25000相比毒性明显下降,携带报告基因转染MCF-7细胞转染效率与PEI25000相近。结论对叔丁基杯[4]芳烃酸聚乙烯亚胺新聚合物具有较强压缩质粒DNA能力,对细胞毒性低,转染效率高,是一种可应用于基因治疗的新型非病毒载体。     

聚-羟丙基-天冬氨酸-谷氨酸-聚乙烯亚胺共聚物作为非病毒载体的研究

目的:选用聚-羟丙基-天冬氨酸-谷氨酸材料作为骨架偶联低分子量聚乙烯亚胺,以构建低毒、高效的新型非病毒性基因载体.方法:用聚-羟丙基-天冬氨酸-谷氨酸(PHPAG)为基本骨架,偶联低分子量的聚乙烯亚胺(PEI 1.8 kDa)形成聚-羟丙基-天冬氨酸-谷氨酸-聚乙烯亚胺(PHPAG-PEI 1.8 kDa)的载体材料.通过核磁共振氢谱(1H-NMR)、粒径测定、凝胶体积排除色谱法(GPC)等化学物理方法,凝胶电泳阻滞实验、MTT细胞毒性实验、细胞转染等生物学实验,对聚合物的结构及性能进行研究.结果:成功合成载体材料PHPAG-PEI 1.8 kDa.通过1H-NMR证实材料PHPAG-PEI 1.8 kDa在5或6个氨基酸上能偶合1个PEI 1.8 kDa.GPC结果表明PHPAG、PHPAG-PEI 1.8 kDa 2种材料的分子量约为1.2×104.粒径检测结果显示,PHPAG-PEI/pDNA复合物的平均粒径为200 nm左右.凝胶电泳阻滞实验表明,PHPAG-PEI/pDNA复合物在N/P为3.5∶1时可以完全阻滞DNA.细胞毒性实验表明,在COS-7和A293 2种不同的细胞中,载体材料显示出较低的毒性,与对照组PEI 1.8 kDa相近.在B16细胞、Hela细胞上的转染实验表明,PHPAG-PEI/pCAG-Luc3的复合物在N/P为25∶1时的转染效率最高,高于对照组PEI 25 kDa.结论:PHPAG-PEI聚合物载体材料是一种有潜在用途的非病毒基因药物载体.     

聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体制备及体外实验研究

目的 制备聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体并研究其理化性质的表征参数和体外转染效率.方法 通过化学还原法制备聚乙烯亚胺修饰的纳米金基因载体,用绿色荧光蛋白质粒(pAcGFP-N1)做报告基因,纳米基因载体可通过静电吸附的方式结合质粒DNA.用紫外分光光度计检测其吸收光谱,用透射电镜观察其形态特征,激光粒度分析仪测定其粒度分布、表面电位(Zeta电位),1％琼脂糖凝胶电泳检测该基因载体与质粒DNA的结合稳定性,CCK-8实验检测聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体及DNA-纳米金复合物对HEK293细胞的细胞毒性作用,通过荧光显微镜观察聚乙烯亚胺纳米基因载体介导pAcGFP-N1在体外培养的HEK293细胞中的表达,并分析其转染效率.结果 聚乙烯亚胺还原氯金酸可以得到带正电荷的纳米颗粒,呈单分散球形分布,其粒径为(12.3 ±3.3)nm.在pH =7.2时,Zeta电位为+(29.7±5.1)mV.1％琼脂糖凝胶电泳结果表明,当纳米金/质粒DNA≥0.5时,质粒DNA可完全结合到纳米金表面.体外转染实验表明,聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体能介导pAcGFP-N1转染HEK293细胞并在细胞中表达绿色荧光蛋白,其转染效率可达25％.结论 聚乙烯亚胺修饰纳米金是一种新型非病毒基因载体,具有转染效率高、对细胞毒性小等优势.     

PELA作为基因载体的研究

目的　研究可生物降解聚合物 PEL A作为控制释放的基因载体。方法　合成聚乳酸 -聚乙二醇二元共聚物(PEL A) ,包裹质粒 p CH110 ,探讨了 PEL A作为基因载体包裹 DNA的各种影响因素 ,这种控制释放体系的体外降解及释放行为以及对其细胞毒性及体外转染效率进行了测定。结果　制备的 PEL A微球平均粒径 1μm～ 3μm,包裹效率为6 2 %。采用包裹了质粒 p CH110的微球对 COS- 1细胞的细胞毒性及转染实验中得出 :PEL A的细胞毒性较小 ,转染效率较高 ,且能持续表达 96 h,缓释效果较明显。结论　可生物降解聚合物材料 PEL A作为基因载体具有较强的优越性     

非病毒基因载体脂质-聚阳离子复合物的研究进展

基因递送系统运载基因的能力是基因治疗的关键因素之一.脂质-聚阳离子复合物是一种新型的药物递送系统,脂质体与高分子基因载体具有协同增效作用,具有良好的稳定性、低细胞毒性以及高转染效率.     

电离辐射促羟基磷灰石纳米载体介导的hGM-CSF基因在人肝癌HepG2细胞中的转移及表达

目的观察电离辐射对羟基磷灰石(HA)纳米载体介导的质粒pOR F-hGM-CSF基因转染的影响,并探索能提高HA转染效率的方法。方法转染细胞前,依据不同辐射剂量下的HepG2细胞剂量-存活曲线选出2、4和6 Gy3种不同剂量进行分组照射。48 h后R T-PCR检测HepG2细胞内hGM-CSF的mR NA表达水平以比较转染效率。结果电离辐射可以促进HA纳米载体介导的基因在HepG2细胞中的转移和表达,在辐射剂量为6和4 Gy时,hGM-CSF基因mRNA相对表达量可达(0.9941±0.0703)和(0.9501±0.5619),与剂量为0 Gy的表达量差异有显著性(P<0.05),但与Lipofectamin 2000组比较差异无显著性(P>0.05),故当辐射剂量为6和4 Gy时,HA纳米载体的转染效率可接近Lipofectamin 2000的转染效率。辐射剂量为6、4、2和0 Gy时,培养基中hGM-CSF的分泌量分别为(499.20±5.76)、(497.06±4.54)、(472.53±3.91)和(428.65±7.16)ng/106cell。结论电离辐射可以提高HA纳米载体的转染效率,并且HA纳米载体转hGM-CSF基因的自体肿瘤疫苗联合放疗治疗人类肝细胞癌有望成为可能。     

基于聚赖氨酸和聚乙二醇星形嵌段共聚物的基因载体研究

目的：合成以聚乙烯亚胺（PEI）为内核、聚赖氨酸（PLL）为内层、聚乙二醇（PEG）为外围的系列星形三嵌段共聚物（PEI-g-（PLL-b-PEG））,研究其作为基因载体的性能。方法：用超支化PEI表面氨基引发赖氨酸酸酐的开环聚合,再将活化的PEG以不同接枝率修饰得PEI-g-（PLL-b-PEG）。通过体外细胞实验测定系列共聚物对293T细胞毒性和转染效率。结果：成功合成PEI-g-（PLL-b-PEG）系列共聚物,在共聚物外围接入少量PEG时,不仅可降低细胞毒性,还可有效提高转染效率。结论：PEI-g-（PLL-b-PEG）可用作潜在的非病毒基因载体。     

A RGD-Containing Oligopeptide (K)_(16)GRGBSPC: A Novel Vector for Integrin-Mediated Targeted Gene Belivery

A 23 amino acid, bifunctional integrin-targeted synthetic oligopeptide was evaluated for ex vivo gene delivery to rabbit bone marrow stromal cells (BMSCs). Synthesis of the peptide (K)16GRGDSPC was performed on a solid-phase batch peptide synthesizer. BMSCs were transfected with plasmid DNA coding for luciferase by (K)16GRGDSPC and the transfection efficiency was assayed. The influences of chloroquine and polyethyleneimine on the transfection efficiency were also examined. The target specificity of (K)16GRGDSPC to mediate exogenous gene into BMSCs was analyzed using cell attachment test and gene delivery inhibition test. The results showed that the transfection efficiency of the oligopeptide vector was lower than that of Lipofectamine. But in the presence of endosomal buffer chloroquine or endosomal disrupting agent polyethyleneimine, the transfection efficiency of the vector was greatly enhanced. In addition, RGD-containing peptides inhibited BMSCs' attachment to the 96-well plates pretreated with fibronectin or vitronectin and significantly decreased the transfection efficiency of the oligopeptide vector. These studies demonstrated that oligopeptide (K)16GRGDSPC was an ideal novel targeted non-viral gene delivery vector, which was easy to be synthesized, high efficient and low cytotoxicity. The vector could effectively deliver exogenous gene into rat BMSCs.     

Combined pluronic P85- and ultrasound contrast agents-mediated gene transfection to HepG2 cells

This study examined the effect of P85 (a pluronic block copolymer) and microbubble (MB)ultrasound contrast agents under ultrasound irradiation on gene transfection and expression.The pEGFP plasmids tha...     

含RGD肽CP9修饰的聚乙烯亚胺复合物的理化特性及其转基因功能的研究

目的：构建含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽CP9修饰的聚乙烯亚胺（PEI），观察其理化特性和转基因功能。方法：通过琥珀酰亚胺-3-（2-嘧啶二硫）丙酸酯（N-Succinimidyl-3-（2-pyridyldithio）]propionate，SPDP）将CP9偶联到PEI上，合成新型转基因载体CP9-PEI。用^1H-NMR和FT-IR验证CP9的偶联；用凝胶电泳阻滞实验、电镜和粒径检测，观察CP9-PEI浓缩质粒DNA的能力以及浓缩质粒DNA后形成的转染颗粒形态和粒径；通过CP9-PEI在人肝癌细胞株HepG2中的转染实验来验证CP9对PEI的转染效率的影响；通过游离CP9肽的竞争抑制实验验证CP9-PEI的整合素靶向功能。结果：CP9成功偶联到PEI上；CP9-PEI能有效浓缩质粒DNA，形成的转染颗粒形态为圆形或类圆形，在N／P比为10时，粒径约为200nm。CP9-PEI的转染效率是PEI的2倍，游离CP9肽能抑制CP9-PEI的转染效率。结论：修饰了CP9的PEI能有效增加转染效率，具有整合素的靶向能力，是一种具有应用前景的转基因载体。     

基因载体MPEG-PLL共聚物与DNA形成复合物的体外研究

目的 研究非病毒基因载体聚乙二醇单甲醚(MPEG)-聚-L-赖氨酸(PLL)共聚物的组成在体外介导基因传递的影响.方法 将含有不同量MPEG的MPEG-PLL共聚物,与DNA形成复合物.测定MPEG-PLL/DNA复合物的粒径、Zeta电位,并进行凝胶阻滞分析,观察其对Hela细胞的毒性和转染率.结果 MPEG侧链并未...     

A RGD-Containing Oligopeptide （K）16GRGDSPC： A Novel Vector for Integrin-Mediated Targeted Gene Delivery

A 23 amino acid, bifunctional integrin-targeted synthetic oligopeptide was evaluated for ex vivo gene delivery to rabbit bone marrow stromal cells （BMSCs）. Synthesis of the peptide （K）16GRGDSPC was performed on a solid-phase batch peptide synthesizer. BMSCs were transfected with plasmid DNA coding for luciferase by （K）j6GRGDSPC and the transfection efficiency was assayed. The influences of chloroquine and polyethyleneimine on the transfection efficiency were also examined. The target specificity of （K）16GRGDSPC to mediate exogenous gene into BMSCs was analyzed using cell attachment test and gene delivery inhibition test. The results showed that the transfection efficiency of the oligopeptide vector was lower than that of Lipofectamine. But in the presence of endosomal buffer chloroquine or endosomal disrupting agent polyethyleneimine, the transfection efficiency of the vector was greatly enhanced. In addition, RGD-containing peptides inhibited BMSCs＇ attachment to the 96-well plates pretreated with fibronectin or vitronecfin and significantly decreased the transfection efficiency of the oligopeptide vector. These studies demonstrated that oligopeptide （K）16GRGDSPC was an ideal novel targeted non-viral gene delivery vector, which was easy to be synthesized, high efficient and low cytotoxicity. The vector could effectively deliver exogenous gene into rat BMSCs.     

聚乙烯亚胺/DNA复合物处方工艺优化及体外转染效率

目的:考察聚乙烯亚胺(PEI)相对分子质量、氮磷比(N/P比)、溶剂、离子强度等对PEI/DNA复合物形成、表面性质以及细胞转染效率的影响。方法:制备不同相对分子质量PEI/DNA复合物,通过凝胶电泳和紫外吸收检测确定PEI与DNA的复合能力(N/P比),测定不同溶剂、离子强度下的粒径和Zeta电位,考察复合物在HepG2细胞中的转染情况。结果:PEI与DNA的复合能力与PEI的相对分子质量呈正相关,不同溶剂、离子强度会影响复合物的表面性质,以磷酸盐缓冲液(PBS)为溶剂、PEI(25kD)为载体、N/P比为12～15时,PEI/DNA复合物细胞转染效率明显优于质粒DNA,仅略低于阳性对照组。结论:经优化的PEI/DNA复合物可显著提高DNA在细胞中的转染效率。     

Gene Transfection Mediated by Ultrasound and Pluronic P85 in HepG2 Cells

In order to assess whether gene transfection could be mediated by ultrasound in associa- tion with P85 and find the appropriate parameters of ultrasound irradiation, the effects of ultrasound with or without P85 on gene transfection of HepG2 cells were examined. The HepG2 cells were irra- diated by ultrasound at 1 MHz, 0.4-2.0 W/cm2 and 50% duty cycle with plasmid encoding enhanced green fluorescent protein (EGFP) as a report gene. Forty-eight h later, the expression of EGFP was detected under the fluorescence microscopy. Transfection efficacy was quantitatively assessed by flow cytometry, and cell viability was evaluated by trypan blue exclusion. The results showed that the transfection efficacy was increased with the increases in ultrasound output power and the ideal trans- fection efficacy was achieved in HepG2 cells irradiated by ultrasound at 0.8 W/cm2 for 30 s. The transfection efficacy in ulstrasound P85 group was three times higher than in single ultrasound group [(17.63±1.07)% vs (5.57±0.56)%, P<0.05]. The cell viability was about 81% and 62% in ultrasound group and ultrasound P85 group respectively. It was concluded that ultrasound in combination with P85 could mediate the gene transfection of HepG2 cells, ideal transfection efficacy was achieved by ultrasound irradiation at 0.8 W/cm2 for 30 s, and P85 could somewhat increase the damage to cells caused by ultrasound.