一种与人蛋白激酶CK2α'亚基相互作用蛋白的cDNA序列测定

目的：测定一种与人蛋白激酶CK2α’亚基相互作用蛋白的cDNA序列。方法：选择一个与人蛋白激酶CK2α’亚基相互作用蛋白的重组质粒pCADT7-Library cDNA，使用BigDyeTM荧光标记终止底物循环测序试剂盒，用载体pGADT7的T7-启动子为测序引物，在ABI PRISM310型基因分析仪上进行DNA测序。结果：该重组质粒的插入片段与泛素一核糖体蛋白S27a cDNA序列只有一个碱基的差别。结论：通过DNA测序，该种与人蛋白激酶CK2α’亚基相互作用蛋白为泛素一核糖体蛋白S27a的变体。     

蛋白激酶CK2B的相互作用蛋白筛选

目的研究与蛋白激酶CK2B发生相互作用的蛋白。方法应用酵母双杂交系统,以人蛋白激酶CK2B为诱饵,筛选成人肝cDNA文库,利用生物信息学分析,一对一酵母回复性杂交等提供的信息,筛除假阳性。结果经过酵母双杂交共获得211个克隆,经过验证分析,最终确定12个相互作用蛋白,其中3个是已知的,9个是新发现的相互作用。结论获得的9个新的相互作用蛋白可能揭示CK2新的作用机制。     

蛋白激酶CK2α亚基cDNA的克隆与序列分析

目的构建人蛋白激酶CK2α重组质粒,研究CK2结构和功能.方法采用RT-PCR、定向克隆和DNA测序方法进行实验.结果通过BT-PCR从Hep-3B肝癌细胞中获得人蛋白激酶CK2α(Protein Kinase 2α)亚基编码区1136bp的cDNA片段,将扩增基因通过粘端连接克隆到pUCm-T载体中,用PCR和限制性内切酶分析鉴定,表明获得重组质粒pUCm-T-CK2α.通过对CK2α编码区cDNA序列测序证实其与GeneBank中登记号为NM-01895的序列一致.结论成功构建了重组质粒pUCm-T-CK2α,为利用CK2αcDNA作为探针进行深入研究奠定了基础.     

CytoTrap酵母双杂交系统筛选p85α蛋白相互作用蛋白

目的筛选与p85α蛋白发生相互作用的新蛋白质分子。方法 PCR扩增小鼠p85α基因全长,并将此基因重组入pSOS载体,构建诱饵质粒pSOS-p85α,经酶切及测序鉴定构建正确后将其转化酵母菌cdc25Hα,检测其在酵母中的表达及有无自激活作用,并利用CytoTrap酵母双杂交系统筛选与诱饵蛋白p85α相互作用的蛋白质分子。结果成功获得重组诱饵质粒pSOS-p85α,并验证其可在酵母细胞中表达诱饵蛋白pSOS-p85α,且诱饵质粒在此双杂交系统中无自激活。利用此系统筛选出4个能与p85α相互作用的细胞蛋白,分别为v-Ki-ras2克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同族体蛋白KRAS、小鼠着丝粒蛋白K、小鼠多聚嘧啶结合蛋白PTBP1、小鼠雄性激素调节蛋白RP2。结论成功筛选出小鼠p85α蛋白的相互作用蛋白,为进一步研究小鼠p85α蛋白及其相关信号通路的生物学功能提供了新线索。     

蛋白激酶CK2-α′在腺样囊性癌细胞中的表达

目的 通过检测蛋白激酶CK2-α′在涎腺腺样囊性癌中的表达分布特征,探讨蛋白激酶CK2-α′与涎腺腺样囊性癌的关系及临床病理意义.方法 应用免疫荧光技术对蛋白激酶CK2-α′在同一来源不同转移能力涎腺腺样囊性癌细胞(SACC-83)及涎腺腺样囊性癌肺转移细胞(SACC-LM)的表达进行分析.结果 蛋白激酶CK2-α′在涎腺腺样囊性癌细胞及涎腺腺样囊性癌肺转移细胞中都存在高表达,并且细胞核中的表达都高于在细胞质中的表达.结论 蛋白激酶CK2-α′的表达与涎腺腺样囊性癌的肺转移呈正相关.     

蛋白激酶CK2与Wnt信号转导途径

蛋白激酶CK2是一种真核中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶,到目前为止,已发现其300多种底物,且数目还在增加,涉及到许多细胞生命过程,如从DNA复制、转录到细胞生长的信号转导、增殖、转化、细胞凋亡等。近来研究发现,CK2与Wnt信号转导途径存在着很大的联系,CK2可以与-βcatenin和dishevelled等Wnt信号蛋白相结合使它们磷酸化,正性调节Wnt信号转导途径。在肿瘤发生和早期胚胎发育过程中CK2增强Wnt信号转导,本文将从这两个方面加以综述。     

蛋白激酶CK2在肿瘤生物学中的作用

蛋白激酶CK2是一种在真核细胞中普遍存在的高度保守信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶,功能多样,对细胞生长、增殖、凋亡及生物节律等均具有很重要的调控作用。其表达失衡与肿瘤的发生发展关系密切。近年来,CK2的研究取得一些重要的进展,鉴于与肿瘤的发生发展的密切联系,有关蛋白激酶CK2的研究越来越受到人们的关注,尤其是其在肿瘤及其他相关疾病的发生发展中所起的作用以及在肿瘤治疗中的应用。     

蛋白激酶CK2β在胃癌中的表达及临床意义

目的研究蛋白激酶CK2β在胃癌中的表达及临床意义。方法采用免疫组织化学法检测94例胃癌及其癌旁正常胃黏膜组织芯片中CK2β的表达水平,分析CK2β的表达与胃癌患者临床病理特征的相关性。结果 94例胃癌组织中,CK2β阳性表达率为92.6%(87/94),癌旁正常胃黏膜组织中的阳性表达率为8.51%(7/94),两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。CK2β阳性表达率与胃癌患者TNM分期(P=0.012)、肿瘤分化程度(P=0.036)、淋巴结转移(P=0.023)相关。结论 1CK2β在人胃癌组织的表达水平显著高于其癌旁组织;CK2β的高表达与胃癌的临床病理特征相关。2CK2β可能成为潜在的胃癌分子标志物或治疗靶点。     

应用酵母双杂交筛选与FAM172A相互作用蛋白的研究

目的 应用酵母双杂交技术（蛋白与蛋白的相互作用）,筛选人胎脑cDNA文库中与FAM172A蛋白相互作用的蛋白,为深入研究新发现的蛋白质FAM172A生物学功能及在疾病中的作用奠定基础.方法 构建pGB-FAM172A诱饵质粒,转化酵母菌株Y190.人胎脑cDNA转化诱饵酵母菌,于营养缺陷型培养基（SD/-Leu/-Trp/-His）上生长,从中筛选到35个单克隆进行β-半乳糖苷酶克隆转移滤纸实验,对蓝色克隆者进行质粒抽提,转入大肠杆菌DH/OB,进行抗性筛选,从中提取质粒,一对一与诱饵质粒pGB-FAM172A共转酵母细胞Y190,进行验证鉴定,提取质粒DNA进行测序并进行BLAST比对分析.结果 成功构建pGB-FAM172A质粒,经严格筛选,共有10个阳性克隆,分别进行测序、序列比对,成功筛选出6个与FAM172A存在相互作用的蛋白：RTCD1、MOCS2、A2M、KCNIP1、BTBD2和TOX2.结论 利用酵母双杂交系统筛选出6个可能与FAM172A相互作用的蛋白,为进一步研究FAM172A蛋白的生物学功能提供了线索.     

蛋白激酶CK2a特异性siRNA增强喉癌细胞Hep-2对顺铂敏感性的研究

目的探讨RNA干扰技术抑制蛋白激酶CK2α表达后,喉癌细胞Hep-2对顺铂敏感性的变化。方法构建蛋白激酶CK2α特异性siRNA表达质粒psiRNA—hH1neo—CK2α和非特异性表达质粒psiRNA—hH1neo—cont,脂质体转染法转染Hep-2细胞。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）、Western blot技术检测转染后Hep-2细胞蛋白激酶CK2α mRNA和蛋白表达。设立正常对照组、顺铂（5μg/ml）组、psiRNA—hH1neo—CK2α组和psiRNA—hH1neo—CK2α＋顺铂（5μg/ml）组,应用MTT法检测转染后Hep-2细胞对顺铂敏感性的变化。结果psiRNA—hH1neo—CK2α特异性地抑制了Hep-2细胞中蛋白激酶CK2α mRNA和蛋白的表达（P〈0．05）。顺铂组（5μg/ml）及psiRNA—hH1neo—CK2α组Hep-2细胞的增殖能力分别为正常对照组的（55．32&#177;4．68）％和（49．68&#177;5．33）％（P〈0．05）,但均高于二者联合组（26．12&#177;5．51）％（P〈0．05）,转染psiRNA—hH1neo—CK2α后,Hep-2细胞对顺铂敏感性增加了2．12倍。结论RNA干扰技术抑制蛋白激酶CK2α表达能增加喉癌细胞Hep-2对顺铂的敏感性。     

人早幼粒细胞cDNA文库中与GINS2发生相互作用靶蛋白的筛选和鉴定

目的:采用酵母双杂交系统筛选与人GINS2编码蛋白发生相互作用的靶蛋白,阐明其在急性早幼粒细胞白血病(APL)中的致病信号及相关机制.方法:采用热激法将诱饵质粒pGBKT7-GINS2与人早幼粒细胞cDNA文库质粒共同转化至酵母AH109感受态细胞中,筛选与GINS2编码蛋白相互作用的文库蛋白.利用多重报告基因检测和D...     

低表达NADH脱氢酶[辅酶Q]铁硫蛋白4对乳鼠心肌细胞线粒体功能的影响

目的 探讨低表达NADH脱氢酶[辅酶Q]铁硫蛋白4(NDUFS4)蛋白对乳鼠心肌细胞线粒体功能的影响.方法 通过原代培养30只乳鼠心肌细胞,将培养出的心肌细胞80盘简单随机分为siRNA处理组和对照组,每组40盘细胞.siRNA处理组:在乳鼠心肌细胞上转染NDUFS4 siRNA;对照组:在乳鼠心肌细胞上转染无义siRNA.继续培养48 h后,比较两组细胞在NDUFS4蛋白的表达、线粒体膜电位、细胞活性氧簇(ROS)水平、线粒体钙离子摄取能力和线粒体呼吸控制率上的差异.结果 乳鼠心肌细胞NDUFS4蛋白表达处理组较对照组下调73.58％(P＜0.001),线粒体的膜电位处理组较对照组下降20.49％ (P＜0.05),同时ROS水平处理组较对照组上升32.11％(P＜0.001).乳鼠心肌细胞线粒体钙离子摄取能力处理组较对照组降低33.33％ (P ＜0.001),细胞最大呼吸速率处理组较对照组下降29.18％ (P ＜0.05).结论 NDUFS4在乳鼠心肌细胞线粒体中维持膜电位、ROS的生成、MPTP的开放和能量供应等过程中发挥着重要的功能.     

与人巨细胞病毒UL130 编码蛋白相互作用蛋白的筛选

 目的利用酵母双杂交技术筛选与人巨细胞病毒（HCMV）UL130 表达产物有相互作用的细胞蛋白及其编码基因,了解其
在宿主基因组中的地位功能。方法将成功构建的酵母诱饵表达载体pGBKT7-UL130 转化到酵母菌AH109 中,再将人胎脑文
库DNA转化到含有pGBKT7-UL130的酵母细胞中,筛选与HCMV UL130 编码蛋白相互作用的细胞蛋白,并对阳性克隆进行测
序和生物信息学分析。结果最终确认9 个克隆与HCMV UL130 编码蛋白相互作用,其中2 个克隆与突触小体相关蛋白
（SNAP）高度同源。结论成功应用酵母双杂交系统筛选出与HCMV UL130 编码蛋白相互作用的蛋白,其中SNAP 在HCMV
感染致病过程中可能起重要作用。     

高氧对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞NADH脱氢酶亚单位4、5表达的影响

目的 探讨高氧对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（AEC Ⅱ）还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）脱氢酶亚单位4、5表达的影响.方法 原代培养Sprague-Dawley（SD）胎鼠AEC Ⅱ,待其生长至接近汇合状态时随机分为高氧组和正常对照组,高氧组持续暴露于常压高浓度氧中（氧浓度〉90%.CO2浓度5%）,正常对照组仍置于5%CO2培养箱中,两组均继续分别培养6、12、24h;采用免疫细胞化学染色SP法检测NADH脱氢酶亚单位4（DN4）蛋白的表达.采取半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）测定ND4、NADH脱氢酶亚单位5（ND5）mRNA的表达.结果 （1）SP法结果显示,与正常对照组比较,高氧组6h AEC Ⅱ ND4蛋白的表达增强,12h AEC Ⅱ ND4蛋白的表达减弱,但差异均无统计学意义（均P〉0.05）,24hAEC Ⅱ ND4蛋白的表达显著减弱（P〈0.05）;（2）RT-PCR检测结果显示,与正常对照组比较,高氧组6h AEC Ⅱ ND4、ND5 mRNA表达增强,差异均无统计学意义（均P〉0.05）.12、24h AECⅡ ND4、ND5 mRNA表达显著减弱（P〈0.05）.结论 持续高氧下调胎鼠AEC Ⅱ ND4、ND5 mRNA和AEC Ⅱ ND4蛋白的表达,这种改变可能参与高氧肺损伤的发病过程.     

黄酮类化合物对抑制重组人蛋白激酶CK2全酶的二维定量构效关系

目的研究黄酮类化合物对抑制重组人蛋白激酶CK2全酶的二维定量构效关系作用.方法采用密度泛函理论、分子力学和统计学相组合的方法,对一系列对重组人蛋白激酶CK2全酶具有抑制作用的黄酮类化合物进行二维的定量构效关系（2D-QSAR）的相关性进行分析.结果所建立的2D-QSAR方程具有较好的回归性（R2达到0.829）.结论黄酮类化合物分子的最高占据轨道的能量（EHOM）O对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制活性起着关键的作用,同时,黄酮类化合物分子的体积大小也对CK2的抑制活性起着重要的作用.     

槲皮素对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制作用及其动力学分析

目的 观察槲皮素对重组人蛋白激酶CK2全酶的直接作用及其酶动力学机制。方法 利用基因工程克隆，表达和纯化获得重组人蛋白激酶CK2α和β亚基，在体外等摩尔数混合构成有最大生物活性的重组CK2全酶，在不同条件下测定CK2的活性，CK2活性通过测定转移到CK2底物上的[γ-^32P]ATP的[^32P]放射活度来检测。结果 重组人蛋白激酶CK2是一种Ca^2 ,cAMP和cGMP等第二信使非依赖性蛋白激酶，与天然CK2的性质一致，槲皮素对重组人CK2全酶具有很强的抑制作用，IC50为522nmol/L，抑制作用大于CK2已知抑制剂DRB和A3，槲皮素对重组人蛋白激酶CK2的动力学研究表明；它与ATP和酪蛋白分别呈竞争性和非竞争性抑制作用。结论 槲皮素是CK2有效抑制剂，该抑制作用可能是槲皮素抗肿瘤作用又一分子机制。为今后筛选更有效的CK2抑制剂提供了一种较为简便的筛选方法。     

酵母双杂交筛选TEB4相互作用蛋白

目的 酵母双杂交筛选与TEB4(MARCH-VI)有相互作用的蛋白,构建该蛋白基因序列的重组栽体.方法 以人TEB4为诱饵质粒,利用酵母双杂交技术筛选人淋巴瘤cDNA文库.在SD/-4培养基上共获得150多个阳性克隆,将酵母菌扩增后抽提质粒,转化大肠杆菌,进行序列分析,并经过回复杂交验证,发现了一个与TEB4相互作用的蛋白:ATP synthase F0 subunit 6(ATP-C6).PCR法扩增ATP-C6,亚克隆到质粒pCMV-HA中,获得重组质粒pCMV-HA-ATP-C6,酶切和测序进行鉴定.结果 从人淋巴瘤cDNA文库筛选到一个与TEB4有相互作用的蛋白ATP-C6,并成功构建重组质粒pCMV-HA-ATP-C6. 结论应用酵母双杂交系统从人淋巴瘤cDNA文库中筛选并初步验证了与TEB4有相互作用的蛋白,为TEB4蛋白功能的进一步研究奠定了基础.     

酵母双杂交RRS筛选系统对已知蛋白间相互作用的验证

目的:通过一对已知蛋白Pak和Chp间的相互作用介绍酵母双杂交RRS筛选系统,以期将此系统更广泛的用于蛋白间相互作用的研究.方法:挑选酵母温度缺陷株cdc25-2的低回复突变单克隆,醋酸锂法制备酵母感受态细胞.重组质粒Met425-Myc-Ras-Pak 单独转化酵母,排除诱饵蛋白的白激活作用.将两重组质粒Met425-Myc-Ras-Pak和Ura-M-ChpAc共转化酵母,设置不同质粒组合和不同培养基平板作为对照,观察酵母在36℃的生长情况.结果:制备感受态的cdc25-2细胞无回复突变发生.质粒Met425-Myc-Ras-Pak转化酵母后对细胞既无毒性也无自激活作用.只有当能够表达两已知蛋白的重组质粒共转化酵母,并且在适合它们表达的培养基上,cdc25-2细胞才能够在36℃生长.结论:(1)RRS筛选系统正确验证了Pak和Chp间的相互作用,可将其用于其它已知蛋白间相互作用的研究.(2)可以利用某已知蛋白构建诱饵,通过RRS筛选系统去寻找与已知蛋白相互作用的未知蛋白.     

BRCA2与LIM结构域蛋白FHL2的相互作用

目的：应用酵母双杂交方法筛选BRCA2相互作用蛋白编码基因，验证其相互作用并研究其功能联系。方法：以BRCA2基因3′端片段构建酵母双杂交质粒，筛选正常人乳腺上皮细胞cDNA库，获得编码相互作用蛋白的基因，采用免疫共沉淀、哺乳细胞双杂交和荧光酶测定等方法进一步验证蛋白间相互作用和功能联系．结果：采用酵母双杂交系统筛选，获得了多个编码BRCA2相互作用蛋白的基因，其中包括已知的FHL2蛋白；免疫共沉淀和哺乳动物细胞双杂交试验显示BRCA2和FHL2在体内特异性结合，并证实FHL2在体内形成同源二聚体；转录活性分析发现BRCA2与FHL2有协同转录激活作用。结论：发现BRCA2与FHL2蛋白间相互作用和功能联系，为BRCA2功能研究提供了新的方向。     

与人巨细胞病毒UL132编码蛋白相互作用蛋白的初步筛选和鉴定

目的：探讨应用酵母双杂交系统筛选出与人巨细胞病毒（HCMV）UL132编码蛋白相互作用的人胎脑cDNA文库组织蛋白,阐明其在先天性巨细胞病毒感染中可能的致病机制。方法：采用聚合酶链式反应扩增HCMV UL132片段,酶切、纯化扩增的目的片段及酵母诱饵表达载体pGBKT7,连接HCMV UL132片段到载体pGBKT7上,将连接后的重组体pGBKT7-UL132转化到酵母菌AH109中,再将人胎脑文库DNA也转化到酵母AH109中,筛选与HCMVUL132编码蛋白相互作用的人胎脑文库蛋白,并对阳性克隆进行测序和生物信息学分析。结果：成功构建诱饵表达载体pGBKT7-UL132,双酶切鉴定可见800及7500bp2条目的条带;转化文库质粒后计算转化效率为6.6×10³ cfu·μg^-1,显色反应显示有95个菌落呈蓝色,最终确认10个克隆与HCMV UL132编码蛋白相互作用,Blast结果显示7个克隆与CAML高度同源。结论：利用酵母双杂交系统成功筛选出与HCMVUL132编码蛋白相互作用的人胎脑cDNA文库蛋白CAML,推测该目的蛋白可能在HCMV感染所致神经系统损伤、病毒的入侵和增殖过程中发挥重要作用。