LBP对LPS激活巨噬细胞内p38信号通路的影响 

目的:探讨脂多糖结合蛋白(LBP)对脂多糖(LPS)激活肺泡巨噬细胞内p38信号通路的调节作用。方法:经硫酸铵盐析、Bio-Rex70阳离子交换层析和MonoQ阴离子交换层析, 从大鼠急性期血清中分离纯化LBP。分别用0.01mg/L和1mg/L的LPS刺激肺泡巨噬细胞, 并加入不同浓度LBP(0mg/L、0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/L和10mg/L), 观察肺泡巨噬细胞中p38蛋白激酶的磷酸化程度。结果:纯化的大鼠LBP在SDS-PAGE的60kD处呈现单一条带, 并可增强LPS与单核细胞的结合。当LPS浓度为0.01mg/L时, 1mg/L以下的LBP可明显增敏LPS对肺泡巨噬细胞内p38信号通路的激活, 并且这种增敏作用随LBP浓度的增加而增强。但LBP为10mg/L时, LBP对LPS的增敏作用反而有所减弱;当LPS为1mg/L时, LBP对LPS激活肺泡巨噬细胞内p38信号通路无调节作用。结论:LBP对低浓度LPS(0.01mg/L)激活肺泡巨噬细胞内p38信号通路有明显的调节作用;而高浓度LPS(1mg/L)不需LBP的增敏作用, 可能通过LBP非依赖途径直接激活p38信号通路。     

脂多糖结合蛋白抑制肽的筛选和鉴定

目的：获得具有抑制脂多糖结合蛋白（LBP）致炎作用的可溶性多肽。 方法： 以LPS为目标分子,对噬菌体12肽库进行亲和筛选, 4轮筛选后，检测随机挑取的100个噬菌体克隆的结合活性和竞争抑制活性，将得到的可与LBP竞争性结合LPS的噬菌体克隆进行功能筛选，对获得的阳性克隆进行DNA序列测定，推导外源肽氨基酸序列，并与LBP序列比较，确定LBP致炎作用位点。固相法合成 LBP抑制性多肽，并检测其生物学活性。 结果： 16个噬菌体克隆可与LBP竞争性结合LPS，其中9个噬菌体克隆可显著抑制LBP增敏LPS的致炎作用。9个阳性克隆融合多肽的核心序列为WKXRKXFXKXXG，与LBP的91-102位氨基酸序列有明显同源性。化学合成的12肽WKVRKSFFKLQG-NH2具有显著的抑制LBP致炎功能的作用。 结论： 此12肽具有抑制LBP致炎功能的活性。     

全长人穿孔素cDNA的克隆与3'端部分表达

目的克隆人穿孔素(perforin, PFP)基因并选择性地体外表达抗原特异性C端肽段。方法利用RT-PCR技术,从人肝总RNA中克隆全长PFP cDNA并进行序列测定分析。将编码PFP C端(hPFP-C)125个氨基酸的cDNA片段亚克隆,并插入载体pGEX-2T中用IPTG诱导融合蛋白表达。目的肽段采用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析和凝血酶酶切纯化,并用溶血法测定其生物学活性。结果克隆的全长人PFP cDNA与已发表的PFP基因序列相比较,有4个碱基不同,导致3个氨基酸残基改变。重组基因在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达的融合蛋白的相对分子质量(Mr)为40 000,纯化后的hPFP-C肽段Mr为14 000。重组hPFP-C肽段与兔红细胞共育,呈现钙依赖的溶血活性。结论人PFP基因可能存在多态性,其C端肽段亦有溶解兔红细胞的活性。     

端粒重复因子2与p53的体外结合

目的 通过分析端粒主要结合蛋白端粒重复因子2(TRF2)与p53的体外结合,探讨p53通过端粒途径调节细胞增殖、衰老和凋亡的分子机制。方法 4种不同的p53-谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase,GST)融合蛋白和GST经大肠杆菌表达、谷胱甘肽-Sepharose^TM 4B纯化,其中的人重组p53包括野生型(1～393)、C端缺失体p53 N5(2～293)、N端缺失体p53 N5(95～393)、第175位氨基酸突变体(R→H)。将各纯化蛋白和人乳腺癌细胞MCF-7的细胞蛋白进行体外结合反应(pull down),Western blot检测反应物中p53和TRF2的结合。结果 纯化的GST和p53-GST融合蛋白纯度均在90％以上,且相对分子质量与预计的完全一致。TRF2的Western blot显示：野生型p53和p53-R 175H均能沉淀MCF-7中的TRF2,且结合力相似,而单独的GST则无沉淀TRF2的作用。与野生型p53和p53 R175H相比,p53 2C与TRF2的结合力相对增加,p53 N5与TRF2的结合力相对大大减弱。结论 p53和TRF2可以进行直接而特异的体外结合,且其结合部位在p53的C端(293～393)。p53和TRF2的C端依赖性结合可能与端粒动态变化所诱导的细胞活动有关。     

板蓝根抑制脂多糖诱导的p38蛋白激酶活性研究

目的　探讨板蓝根对内毒素介导的信号传导的影响。方法　取出BALB c小鼠腹腔内的单核细胞 ,分别用板蓝根提取液Ⅲ组分 (1mg ml) +LPS 10 0 μg ml;板蓝根提取液Ⅲ组分 (1mg ml) +金黄色葡萄球菌 (10 6 CFU ml) ;只用LPS 10 0 μg ml;不加LPS和其它药物 ,直接用DMEM培养液 ,培养 6h。取培养上清液检测TNF、IL 6、NO水平 ,收集细胞检测胞内p38MAPK(丝裂原活化蛋白激酶 )活性。然后将板蓝根液按倍比稀释至 1∶8倍时 ,加入LPS 10 0 μg ml,培养 6h后收集细胞测p38MAPK活性。结果　加入板蓝根提取液的单核细胞p38MAPK活性未见明显增强 ,TNF、IL 6、NO水平无明显上升 ,与单独加入LPS后这些指标显著增高相比 ,差异有极显著性 (P <0 .0 1)。而加入金黄色葡萄球菌组单个核细胞p38MAPK活性 ,产生TNF、IL 6、NO浓度仍然较高。板蓝根液倍比稀释后 ,p38MAPK活性逐渐上升。结论　板蓝根可特异性抑制由内毒素介导的p38活性 ,并呈浓度依赖性。     

人N端脂多糖结合蛋白基因在sf21昆虫细胞中的表达

目的 表达重组人N端脂多糖结合蛋白（truncated lipopolysaccharide binding proten,tIBP）。方法 通过病毒鉴定、SDS-PAGE、western blot、毛细管电泳、体外结合实验、细胞活性实验对重组病毒及重组蛋白tLBP的分子量、纯度和生物学活性进行分析。结果 重组病毒空斑分析确定MOI(multiplicity of infection)为8～10,SDS-PAGE显示感染时间65～72h为最佳表达分析;凝胶扫描显示特异表达蛋白占总产物的9.8%,纯化蛋白的分子量约27000u,纯度达95%以上;毛细管电泳显示表达产物呈单一峰型;Lowry法测定约1L上清液可获9mg纯化蛋白;Western blot间接显示表达产物反应带与预期值相符;酶联体外结合实验证实该蛋白可特异结合LPS。应用U937细胞,经LPS(1ng/mL）刺激与LPS（1mg/mL）刺激加纯化蛋白细胞中获得高效表达,并观察到它在体外具有结合或中和内毒素的活性作用。     

内毒素结合肽模拟肽P11的体外活性研究

目的 对从噬菌体展示随机肽库筛选获得的内毒素结合肽模拟肽进行体外拮抗内毒素活性鉴定.方法 采用FMOC固相合成法化学合成内毒素结合肽模拟肽P11,并进行拮抗内毒素活性和细胞毒性测定.结果 亲和ELISA检测显示P11与LPS有较高的亲和力,通过生长曲线和流式细胞学分析细胞周期显示P11对人U937细胞生长无明显影响.流式细胞检测显示P11呈剂量依赖性抑制FITC-LPS与人外周血单核细胞(PBMC)结合.细胞因子生成抑制实验显示10 μg/ml P11可显著抑制LPS诱导PBMC和U937细胞TNF-α mRNA转录和蛋白表达.结论 体外活性鉴定结果表明化学合成的模拟肽P11可抑制LPS诱导的炎性反应.     

全长人穿孔素cDNA的克隆与3′端部分表达

目的 克隆人穿孔素（perforin,PFP)基因并选择性地体外表达抗原特异性C端肽段。方法 利用RT－PCR技术,从人肝总RNA中克隆全长PFP cDNA并进行序列测定分析。将编码PFPC端（hPFP-C)125个氨基酸的cDNA片段亚克隆,并插入载体pGEX-2T中用IPTG诱导融合蛋白表达。目的肽段采用谷胱基肽琼脂糖亲和层析和凝血酶酶切纯化,并用血法测定其生物学活性。结果 克隆的全长人PFP cDNA与已发表的PFP基因序列相比较,有4个碱基不同,导致3个氨基酸残基改变。重组基因在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达的融合蛋白的相对分子质量（Mr)为４００００,纯化后的hPFP-C肽段Mr为14000。重组hPFP-C肽段与兔红细胞共育,呈现钙依赖的血活性。结论 人PFP基因可能存在多态性,其C端肽段亦有溶解兔红细胞的活性。     

单核细胞产生的中性粒细胞趋化因子(MDNCF/IL-8)以其氨基末端序列的长度不同划分为三种类型

本文作者通过MDNCF/IL-8亲和层析(获率达65％)和高压液相层析(HPLC-CM)自LPS刺激的人外周血单核细胞培养上清纯化获得MDNCF/IL-8纯品(5.8×10~4μ/ml),并对其氨基末端核酸序列进行分析,发现存有3种类型,其结果如下所述。由亲和层析纯化的MDNCF/IL-8经HPLC-CM纯化(获率为85%)后,梯度洗脱可产生4个完全分     

应用基因工程方法制备新型重组人肿瘤坏死因子-α

目的　应用基因工程技术 ,制备一种新型的重组人肿瘤坏死因子 α (novelrecombinanthumantumornecrosisfactor α ,nrhTNF α) ,并对其生物学活性、理化性质进行鉴定 ,为进入临床前研究提供基础。方法　应用PCR技术 ,将hTNF α基因的 5′端 17个氨基酸的编码序列删除 ,基因中Pro8Ser9Asp10 的编码序列用Arg Lys Arg的编码序列取代 ,同时Leu157的密码子被Phe的密码子所取代。将hTNF α突变基因 ,插入原核高效表达载体pBV2 2 0中 ,构建高表达工程菌株。纯化表达产物 ,对连续 3批制备的新型rhTNF α,按人用《重组DNA制品质量控制要点》检定要求进行鉴定。结果DNA序列分析和蛋白质N末端、C末端部分氨基酸序列分析表明 ,nrhTNF α与天然的hTNF α相比较 ,N末端缺失了 7个氨基酸 ,13位氨基酸为Arg Lys Arg ,其后为天然hTNF α 11位以后的氨基酸。 15 7位Leu的密码子被Phe的密码子所取代。产物表达量占菌体蛋白的 6 7.4 %。经 (NH4) 2 SO4沉淀、Q SepharoseF .F .及S SepharoseF .F .柱层析分离纯化后 ,产品的纯度达 99% ,比活性达 1× 10 9IU/mg蛋白。结论成功地制备了nrhTNF ,对连续 3批制备的nrhTNF α按人用《重组DNA制品质量控制要点》检定要求进行鉴定 ,所有项目均合格     

小鼠IgG类单克隆抗体三种纯化方法的比较

单克隆抗体纯化技术目前仍在发展中,为适应其在临床诊断、治疗等方面日益广泛的应用,本文详细介绍了辛酸硫酸铵二步沉淀、羟基磷灰石层析和葡萄球菌A蛋白亲和层析纯化小鼠IgG类单克隆抗体的技术及其重要改进,为规模性制备纯化单克隆抗体制剂提供了经验。     

中华绒螯蟹重组金属硫蛋白的原核表达与分离纯化

金属硫蛋白(MT)由于其独特的结构和性质,而成为潜在的医用蛋白资源。本研究将重组中华绒螯蟹金属硫蛋白基因cDNA克隆入原核表达载体pET-GST,转化大肠杆菌BL21。重组蛋白以可溶和包涵体两种形式表达。根据金属硫蛋白的特性,优化了表达条件。Western blot证实了表达产物的正确性,用锌柱亲合层析得到高纯度的重组金属硫蛋白。为以后金属硫蛋白的生物学功能研究奠定了良好的基础。     

肿瘤抗原p185蛋白的纯化及其鉴定

目的：从转染ＨＥＲ２／ｎｅｕ 基因的３Ｔ３／ｎｅｕ细胞中纯化ｐ１８５蛋白,研究其免疫原性和作为肿瘤疫苗的可能性。方法：采用溴化氰活化的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ为基质,通过交联５２０Ｃ９单克隆抗体（杂交瘤腹水中沉淀的γ－球蛋白）,用亲和层析的技术纯化ｐ１８５蛋白。经梯度盐溶液解离与抗体结合的ｐ１８５蛋白,收集到蛋白洗脱峰,用ＥＬＩＳＡ检测ｐ１８５的免疫反应性,并经ＳＤＳＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏ     

抗Ig融合蛋白Fc段单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究

目的：制备并鉴定抗Ig融合蛋白Fc段的单克隆抗体(mAb)，建立用于检测Ig融合蛋白的夹心ELISA法和纯化Fc融合蛋白的亲和层析法。方法：以hBCMA—Ig融合蛋白为抗原免疫BALB／c小鼠，通过细胞融合制备抗Fc段mAb，用ELISA等方法鉴定mAb的Ig亚类、表位以及种属特异性，建立用于检测Ig融合蛋白的夹心ELISA法;Western blot检测mAb对变性Ig融合蛋白的反应性。将mAb与Sepharose4B交联，制备亲和层析柱，对LAIR1-Ig融合蛋白进行纯化。结果：获得7株稳定分泌抗Fc段mAb的杂交瘤(FMUFcl-FMUFc7)。利用FMUFc4作为包被mAb，FMUFc5作为酶标记mAb，成功地建立了检测Ig融合蛋白的ELISA法，敏感度达到2μg／L；在7株mAb中，FMUFc6可用于Ig融合蛋白的western blot检测。用FMUFc 6mAb制备的亲和层析柱，可有效地纯化LAIRl—Ig融合蛋白。结论：成功地制备了抗Ig融合蛋白Fc段的mAb，建立了可用于Ig融合蛋白检测和纯化的方法，为Ig融合蛋白的应用提供了有力手段。     

人体25羟维生素D的竞争蛋白结合测定及冬夏季正常值

本文采用二氯甲烷/乙醇粗提血浆,高压液相色谱精分,竞争蛋白结合测定法求得25羟维生素D值,夏季北京居民正常值为13.2±5.9ng/ml(33.0±14.8nmol/L)(n=68),其中男性为13.0±5.7ng/ml(32.5±14.3nmol/L)(n=39),女性为13.5±6.2ng/ml(33.8±15.5nmol/L)(n=29);冬季正常值为10.4±3.8ng/ml(26.1±9.6nmol/L)(n=45),其中男性为10.2±4.2ng/ml(25.4±10.4nmol/L)(n=22),女性为10.7±3.6ng/ml(26.6±8.9nmol/L)(n=23),性别间无显著性差异,夏冬季P值均大于0.5;夏季值之间差异显著(P<0.01)。 文中还对响影测定的有关问题作了讨论。     

家兔MT—I基因克隆及其在大肠杆菌中的表达与分离

采用 RT- PCR方法扩增镉诱导后的家兔肝脏金属硫蛋白 - I(Metallothionein- I,MT- I)基因的 c DNA全长 ,克隆入原核融合表达载体 p QE4 0 ,转化大肠杆菌 M15。菌落印迹法检测阳性菌株 ;Western blotting分析重组融合蛋白的表达方式 ;经 SDS- PAGE电泳后 ,Im age Master VDS software分析融合蛋白诱导表达条件 ;并采用 Ni-NTA agarose纯化融合蛋白。结果发现 ,重组融合蛋白在原核细胞中表达存在可溶和不可溶 (包涵体 )两种形式 ,表达量随 IPTG诱导时间延长而增加 ,9h达高峰 (占菌体不溶性蛋白总量的 5 7.4 % ) ,经 Ni- NTA亲合层析纯化得到重组融合蛋白 ,为进一步分离目的蛋白单体并研制和开发这一产品提供了可靠依据     

Purification of murine monoclonal antibodies by affinity chromatography using protein A-Sepharose

Summary A simple method is described for the isolation of murine monoclonal immunoglobulin G subclasses using protein A-Sepharose affinity chromatography.     

抗Resistin合成多肽抗体的制备及鉴定

目的制备抵抗素合成肽及其抗体.方法根据人抵抗素cDNA编码的氨基酸序列合成抵抗素分子22～34位的13个氨基酸的多肽(CSMEEAINERIQE),并利用MBS双功能试剂将人工合成多肽成功地与KLH进行偶联,免疫家兔制备抗抵抗素合成多肽的抗体,并经亲和层析进行了纯化.结果对此抗体进行鉴定的结果表明,抗人抵抗素合成多肽抗体可与天然抵抗素分子发生特异性反应,并可用于免疫沉淀和Western blot.结论该抗体的制备为Resistin分子功能的研究及肥胖和2型糖尿病的机制研究提供了有用的工具.     

The isolation and characterization of a mouse myeloma protein with anti-dextran activity

A myeloma protein in ascitic fluid from BALB/c mice bearing W3129 plasma cell tumors was isolated by affinity chromatography. This protein exhibits anti-dextran activity and has been obtained in highly purified form by selective adsorption on isomaltosyl-Sepharose and elution with isomaltose solution. The isomaltosyl-Sepharose was synthesized from maltose, p-aminophenyl glucoside and cyanogen bromide-activated Sepharose by a new procedure utilizing glucosyltransferase and chemical coupling reactions. Results of gel electrophoresis, isoelectrofocusing and agar diffusion experiments showed that the purified myeloma protein consisted of 6 isomeric proteins with each isomer possessing anti-dextran activity. Data from hapten inhibition studies were interpreted to show that the W3129 myeloma protein combines with terminal isomaltosyl units of branched dextrans and oligosaccharides.