逆转录—聚合酶链反应及放射免疫法对5 785例献血员

我国职业献血员尤其是单采血浆还输红细胞的献血员(单采浆血员),丙型肝炎病毒(ＨＣＶ)的感染率高达30%[1]。我中心收集自1995年8月～1997年5月,市中心血站送我院经酶联免疫吸附试验(ＥＬＩＳＡ)检测丙型肝炎病毒抗体(抗ＨＣＶ)均为阴性的待输血及血浆标本5785份,采用逆转录聚合酶链反应(ＲＴＰＣＲ)及放射免疫法(ＲＩＡ)进行复检,现将检测结果报告如下。对象与方法一、对象从1995年8月～1997年5月,收集我院待输全血及血浆5785份,其中全血3672份,血浆2113份,全部由市中心血站提供。酶联免疫吸附试验(ＥＬＩＳＡ)检测抗ＨＣＶ均为阴性。二、检…     

逆转录多聚酶链反应检测丙型肝炎病毒RNA的应用

多聚酶链反应（PCI＜）是近年发展起来的检测细菌及病毒等病原体DNA或RN』A的一种方法，敏感性极强。但这一方法也存在假阳性或假阴性。为此，我们分析了用逆转录多聚酶链反应（R”f—PCK）法检测240例丙肝病毒RNA的结果。现报道如下。对象与方法病例选择：240例病人均为本院住院患者，其中男性144例，女性96例，年龄18～63岁，平均年龄41．7土18．6岁。方法：（）主要试剂与仪器：乌骨髓细胞白血病病毒（AMV）逆转录酶、RNA酶抑制剂（RNasin）、脱氧核糖核苦（dNTP）、TaqDNA聚合酶等购自上海夏华公司。引物系列及来源：共三…     

聚合酶链反应技术对丙型肝炎病毒感染献血员的筛查

目的 对国内献血者丙型肝炎病毒“窗口期”感染的PCR筛查技术应用的调查。方法 卫生部临床检验中心组织全国12家血站，按统一标准采集上万份样品，分为两组，分别为A组（7173份）和B组（7477份），使用试剂按统一标准进行了本项调查研究，其中基因拷贝数≥10^3拷贝数/ml判为阳性。结果 A组中阳性样本数为21，百分比为0.29%，B组中未检测到阳性样本数。结论 血站有必要采用PCR技术筛查丙型肝炎病毒“窗口期”感染的献血者。但需规范采血术方法和评价适合血站筛查用的试剂。     

竞争性逆转录聚合酶链反应定量检测对HCV RNA

为了解感染丙型肝炎病素（ＨＣＶ）后的（ＨＣＶＲＮＡ）含量与丙型肝炎病情轻重，预后，治疗反应的关系，采用竞争性逆转录聚合酶链反应（ＣＲＴ－ＰＣＲ）的方法，对９例感染了ＨＣＶ患者的血清进行了ＨＣＶＲＮＡ的定量检测。结果：６．６×１０３拷贝１毫升占８８．９％，６．６×１０４拷贝／毫升占１１．１％。结果提示：急慢性丙型肝炎及无症状ＨＣＶ感染者体内均含有较高的病毒滴度，且滴度低预后好，抗病毒疗效好。     

用逆转录多聚酶链反应检测丙型肝炎病毒RNA负链

随着多聚酶链反应(PCR)的运用,在丙型肝炎病毒(HCV)感染人的血液及肝组织可检测到HCV基因,但却难以区分HCV基因是存在于肝组织内,抑或由于血液污染肝组织所致。本文作者试图通过检测HCV RNA负链,了解HCV在感染组织中的复制情况。病人和方法作者以9例慢性丙型肝炎及3例慢性乙型肝炎病人为研究对象,将病人的肝活检组织置于—80℃保存,同时采集外周血,用肝素抗凝,分离血浆和单核细胞,也置于一     

HGV RNA逆转录套式聚合酶链反应法的建立及应用

建立ＨＧＶ ＲＮＡ逆转录套式聚合酶甸反应法并应用于我国不同人群ＨＧＶ感染的检测。方法 根据中国株ＨＧＶ ５端非编码区序列设计引物，建立ＨＧＶ ＲＮＡ ＲＴ－ｎＰＣＲ方法。结果 检测３份ＨＧＶ ＲＮＡ阳性血清，其最终阳性稀释度分别为１０＾－４，１０＾－９和１０＾－９，检测５０份ＨＧＶ ＲＮＡ阴性血清均为阴性。     

逆转录聚合酶链反应检测乙型脑炎病毒核酸

本文应用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法检测乙型脑炎病毒基历。所设计引物在Ｅ基因组，引物１位于碱基序列的第１９５３～１９７２位，引物２位于第１７８８－１８０６位。反应产物为１８５ｂｐ，内含ＨａｅⅢ限制性内切酶位点。产物在含溴化乙锭的２％琼脂糖中的电泳。本法可特异性检测乙型脑炎病毒核酸，并可检出少至５ＴＣＩＤ５０的病毒ＲＮＡ。     

逆转录一聚合酶链反应快速检测血清HDV RNA

丁型肝炎病毒(HDV)是一种缺陷性共价闭环单股负链RNA病毒,长约1 700个核苷酸,由于HDV RNAG+C 含量高易形成二级结构以及易变异等原因使逆转录一聚合酶链反应(RTPCR)成功率不高[1,2].我们根据Chao等[3]报道的HDV RNA序列建立了一种RT-PCR方法,并对43份肝炎血清进行了检测,现报道如下.     

逆转录-巢式聚合酶链反应检测庚型肝炎病毒RNA的方法建立及初步应用

庚型肝炎病毒(HGV)基因组为单链,正股RNA,全长9,392Bp。根据5＇-非编码区基因序列设计合成两对引物。随机选取酶联抗-HGV阳性病人血清3份,阴性病人血清6份,应用逆转录-巢式聚合酶链反应进行检测。结果2份抗-HGV阳性血清可见较强的特异扩增带,1份抗-HGV阳性血清可见较弱的特异扩增带,其     

逆转录-聚合酶链反应在乙型脑炎诊断中的建立

目的　运用逆转录 -半套式 -聚合酶链反应技术 (RT -semi-nested -PCR) ,建立一种新的早期快速检测乙型脑炎病毒的方法。方法　收集临床诊断的 37例乙脑和 15例非乙脑病人标本 (包括血清、脑脊液 )分别为 6 3份和 30份 ,同时用RT -semi-nested -PCR、IgM捕获法ELISA(MacELISA)进行检测。 结果　血清和脑脊液中可成功检测出JEVRNA ,经1 5 %凝胶电泳 ,出现特异性条带 ,符合预计值 4 0 0bp。结论　RT -semi-nested -PCR对检测JEV感染 ,从实验设计到实验条件 ,都是合理的 ,有较高的敏感性和特异性。可用于乙脑的早期诊断。     

丙型肝炎病毒RNA聚合酶可溶性和抗原性的研究

目的在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达ＨＣＶ ＲＮＡ聚合酶,研究其可溶性的条件,进一步研究它的抗原性,为研究其活性打下基础。方法构建表达载体 ｐＱＥ－５Ｂ－ＦＬ和 ｐＱＥ－５Ｂ－△Ｃ２１。在 Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｍ１５）菌株中表达。在不同诱导条件下分析其可溶性,在获得ｐＱＥ－５Ｂ－△Ｃ２１可溶性蛋白后,通过Ｎｉ－ＮＴＡ柱纯化。纯化后得到的目的蛋白进行ＥＬＩＳＡ和 ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。结果在 Ｅ．ｃｏｌｉ中表达了 ｐＱＥ－５Ｂ－ＦＬ和 ｐＱＥ－５Ｂ－△ Ｃ２１重组蛋白,二者在 ３７℃诱导条件下均以包涵体形式存在,ｐＱＥ－５Ｂ－△２１重组蛋白在１８℃诱导条件下５０％以可溶形式存在,通过ＥＬＩＳＡ和ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析,表明该蛋白具有抗原性。结论在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达的ＨＣＶ ＲＮＡ聚合酶有良好的可溶性及抗原性。     

实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应在脊髓灰质炎病毒型内鉴定中的应用

目的应用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(rRT-PCR)对脊髓灰质炎病毒(PV)进行型内鉴定,为进行常规rRT-PCR型内鉴定方法奠定基础。方法采用世界卫生组织(WHO)推荐的rRT-PCR方法,对WHO发放的PV株和实验室分离的PV株进行型内鉴定(ITD)和疫苗衍生PV株(VDPV)筛选。结果 ITD rRT-PCR的实验结果与毒株的VP1编码区序列测定结果完全相符,VDPV rRT-PCR的结果与VP1编码区序列测定结果大部分相符,但有2株Ⅱ型脊髓灰质炎疫苗类似株(SL)PV2-SL被错判为非疫苗类似株(NSL),假阳性率为3.03%;1株Ⅲ型SL被错判为NSL,假阳性率为1.92%。结论在新疆脊髓灰质炎实验室rRT-PCR可以应用于脊髓灰质炎病毒的常规监测及型内鉴定。     

逆转录-聚合酶链反应用于肾综合征出血热病毒基因分型诊断

目前，用于肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）分型的方法主要是空斑减少中和试验（ＰＲＮＴ）。由于操作过于复杂与繁琐，仅用于实验研究。逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）是以ＲＮＡ为模板，联合ＲＴ与ＰＣＲ，具有快速、简便、灵敏、特异等优点。近年来，国内外已...     

丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶在大肠埃希菌中的表达

目的 表达具有野生起点的丙型肝炎病毒(HCV)RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)并研究其聚合活性，分析其是否具有逆转录酶活性。方法 构建截短的具有野生起点的HCV RdRp表达质粒，观察不同诱导温度对表达产物可溶性的影响。以多聚腺昔为模板，分别观察在寡聚脱氧胸苷和寡聚尿苷引导下RNA的合成。以互补引物模板评价所表达的HCV RdRp的逆转录酶活性。结果 在16℃诱导温度条件下获得截短具有野生起点的HCV RdRp的可溶性表达。在聚合反应体系中同时具有引物与模板时，获得RNA链的合成，多聚核昔为引物的聚合效率明显高于以多聚脱氧核昔为引物的聚合效率。在表达的HCV RdRp指导下，脱氧核苷掺入到互补引物模板体系中，随着反应时间的延长，10聚的互补引物/模板延伸为13聚的产物，但不能延长至14聚。结论 获得可溶性的HCV RdRp表达，具有RNA依赖的RNA聚合酶活性及有限的逆转录酶活性。其RNA依赖的RNA聚合酶活性有一定的引物依赖性。     

献血员100例血清和外周血单个核细胞中丙型肝炎病毒RNA的检测

为了解丙型肝炎病毒抗体(抗ＨＣＶ)阴性献血员中隐匿性ＨＣＶ感染的状况,我们采用逆转录套式聚合酶链反应(ＲＴＮｅｓｔｅｄＰＣＲ)对100例献血员血清和外周血单个核细胞(ＰＢＭＣ)中ＨＣＶＲＮＡ进行了检测,现将结果报告如下。材料和方法一、检测对象随机选择血清抗ＨＣＶ阴性,血清丙氨酸氨基转移酶(ＡＬＴ)正常的献血员100例。其中,男58例,女42例,取血清-20℃冻存待检。二、ＰＢＭＣ分离及ＨＣＶＲＮＡ提取取肝素抗凝血5ｍｌ,立即用淋巴细胞分离液分离出ＰＢＭＣ,用Ｈａｎｋ液漂洗ＰＢＭＣ5次后,冻存于-70℃备检。ＰＢＭＣ和血清中ＨＣＶ…     

用于HCV RNA逆转录聚合酶链反应测定的血清(浆)样本的质量控制

目的 确定用于丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ测定血清（浆）样本的最佳收集贮存条件。方法 采集ＨＣＶ ＲＮＡ阳性的血样按设定的不同条件处理,用荣光定量ＰＣＲ试剂测定ＨＣＶ ＲＮＡ。结果 血凝集后２小时内离心分离血清ＨＣＶ ＲＮＡ含量无明显改变（降低１０．４２％）;４小时变化明显（降低４０．４９％）。采用抗凝剂的血浆管ＨＣＶ ＲＮＡ含量显著高于血清管（枸橼酸钠抗凝管高出４０．９％,ＥＤＴＡ抗凝管高出５３     

逆转录聚合酶链反应追踪检测小鼠心肌中柯萨奇病毒B3的表达

目的：病毒直接感染心肌细胞是病毒性心肌炎发病的一个重要机制，经多因素分析认为病毒RNA的持续存在可改变心肌细胞的基因表达而有独立的预后意义。但当病毒性心肌炎的病程发展多年，经过机体长期的作用后，心肌内是否还有病毒基因的表达。由于心内膜心肌活检的应用限制，我们制作了不同时期的病毒性心肌炎小鼠模型，以观察病毒基因在不同期小鼠，尤其是感染病毒后发展到老年的小鼠一t5肌中的存在。方法：5周龄Balb／c小鼠腹腔接种柯萨奇B3病毒制成心肌炎模型，分别提取第10天，28天，50天，60天，90天，120天，150天的病毒性心肌炎小鼠的心肌组织的总RNA，采用RT—PCR技术检测柯萨奇B3病毒mRNA。结果：各期小鼠心肌标本里都可检测出柯萨奇B3病毒基因。结论：在病毒性心肌炎的病程发展中，病毒长期持续存在的可能性是存在的，其对心肌细胞的直接作用不能忽视。RT-PCR是一种敏感的检测方法，可以检测出慢性心肌炎心肌中病毒核酸。