重组凋亡相关蛋白PDCD5的纯化及稳定性

目的：建立简便、有效的原核表达促凋亡相关蛋白PDCD5的纯化路线，获得高纯度的PDCD5蛋白，并观察其稳定性。方法：以包涵体形式表达的PDCD5融合蛋白，经包涵体洗涤、变性、复性、酶切、DEAE Sepharose Fast Flow和Sephacryl S-200两步层析分离获得PDCD5蛋白。选用毛细管电泳方法检定蛋白质纯度，SDS—PAGE检定蛋白质的稳定性。结果：经毛细管电泳方法检测PDCD5蛋白纯度为100％，相对分子质量15800，等电点5．9。生物学活性分析PDCD5蛋白能够促进撤除细胞因子的HL-60细胞的凋亡，呈现一定的量效关系。稳定性研究发现储藏中的PDCD5蛋白不稳定，对温度敏感，4℃和25℃极易降解，而-20℃和冻干保存则相对稳定。结论：本研究建立的蛋白纯化方法可以获得大量、高纯度PDCD5蛋白。稳定性实验提示PDCD5宜在-20℃以下或冻干保存。     

泛素--核糖体蛋白S27a基因的克隆、测序及其原核GST融合表达和纯化

目的：克隆泛素-核糖体蛋白S27a基因并在大肠杆菌细胞内高效表达,并纯化该蛋白.方法：从HL-60细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增获得泛素/核糖体蛋白S27a的编码区cDNA,将Hind Ⅲ/NdeⅠ双酶切的PCR产物连接到同样双酶切的GST融合表达载体pGEXGST构建为融合表达质粒pGEXGST-S27a,转化感受态的大肠杆菌JM109实现质粒的扩增与纯化,经DNA测序确证后再转化感受态表达菌BL21,表达并纯化出融合蛋白.结果： （1） PCR 扩增获得长约560bp 的泛素-核糖体蛋白S27a 基因片段.（2） SDS - PAGE 证明, 泛素-核糖体蛋白S27a-GST融合蛋白的分子量为43kDa.（3）通过过柱法纯化出泛素-核糖体蛋白S27a-GST融合蛋白.结论：成功克隆出泛素-核糖体蛋白S27a的基因,并在表达菌BL21中可见GST融合表达,并纯化出该融合蛋白,为进一步研究其功能获得了候选蛋白分子.     

程序化死亡基因5(PDCD5)在骨关节炎软骨中的表达及意义

目的：研究程序化死亡基因5(PDCD5)在正常及骨关节炎关节软骨中的表达规律，探讨PDCD5在骨关节炎发病中的作用。方法：取20例骨关节炎及10例股骨颈骨折行关节置换术时切除的关节软骨，分离软骨细胞，留取组织块制作石蜡切片。分别用流式细胞术、直接免疫荧光、激光共聚焦显微镜及RT-PCR检测PDCD5在正常及骨关节炎软骨细胞内的表达水平及部位，免疫组织化学检测PDCD5在关节软骨内的表达特征。结果：在骨关节炎软骨细胞中PDCD5表达上调，以细胞核内增强为主；在骨关节炎的组织切片中PDCD5表达增强，阳性细胞主要分布在表层及深层，而在股骨颈骨折中PDCD5阳性细胞主要分布在表层及中层。结论：PDCD5可能参与了骨关节炎软骨细胞的凋亡过程，在骨关节炎的发病中发挥作用。     

髓系KLF5基因缺失小鼠腹主动脉瘤形成的生物信息学分析

背景　腹主动脉瘤（AAA）是一种老年常见高死亡率的心血管系统疾病，发病机制不明确，临床上无有效治疗药物。本课题组前期研究发现，KLF5基因在人和小鼠AAA组织中表达升高，但是对于详细的KLF5基因调控炎症相关基因表达的网络分析未见报道。目的　利用基因芯片技术对髓系KLF5基因表达缺失（LyKLF5-/-）小鼠AAA的差异表达基因进行生物信息学分析，探讨KLF5基因在AAA中的调控机制。方法　研究时间为2015年1月-2019年4月。将SPF级KLF5-flox小鼠和SPF级LysM-cre小鼠杂交培育的雄性髓系遗传性LyKLF5-/-小鼠与同笼野生型（WT）C57BL/6小鼠各3只作为实验动物。通过CaPO4诱导小鼠AAA模型，并提取肾下腹主动脉组织总RNA行mRNA芯片筛查。对于筛选出的差异表达基因，利用在线数据库Metascape进行GO功能富集分析和KEGG富集分析，再利用STRING在线数据库进行蛋白互作网络分析。结果　mRNA芯片共筛选到上调表达基因646个，下调表达基因1 410个（|FC|≥2，P<0.05）。与WT小鼠比较，抑制炎症的基因在LyKLF5-/-小鼠表达增加，Bcas3、Hck基因表达分别上调3.96、3.14倍；促进炎症的基因在LyKLF5-/-小鼠表达降低，Retnla、Olig1、Tnfrsf11a分别下调7.68、5.07、3.66倍。GO功能富集分析显示上调差异基因主要参与多肽抗原合成和表达的调控、核苷二磷酸代谢过程、肌节组织的正向调节等过程；下调差异基因主要参与生长发育、细胞对葡萄糖刺激反应的胰岛素分泌调节、平滑肌细胞迁移的正调控等过程。KEGG富集分析显示上调差异基因主要影响破骨细胞分化、吞噬小体、氨基酸的生物合成等通路；下调差异基因主要影响血管平滑肌收缩、泛素介导的蛋白水解作用以及肌动蛋白细胞骨架的调控等通路。蛋白互作网络分析证实，小鼠髓系LyKLF5-/-导致参与血管炎症相关基因Bcas3、Hck表达上调和Retnla、Olig1、Tnfrsf11a表达下调。结论　Bcas3、Hck、Retnla、Olig1、Tnfrsf11a基因可能是参与血管炎症和AAA形成的重要候选基因。     

白藜芦醇对BGC-823细胞人程序化死亡分子5表达及凋亡的影响

目的：探讨白藜芦醇对胃癌BGC-823细胞中凋亡相关基因人程序化死亡分子5（PDCD5）表达的影响,并观察白藜芦醇诱导BGC-823细胞凋亡的效应。方法：分别用25、50、100和200μmol/L的白藜芦醇处理BGC-823细胞24、48和72h后,采用免疫细胞化学和原位杂交方法检测PDCD5表达的变化;运用流式细胞仪和TUNEL法检测细胞凋亡情况。另设空白对照组和溶剂对照组。结果：同一时间点,6组PDCD5蛋白及mRNA的表达差异均有统计学意义（F蛋白=211.881、242.438和184.866,P均〈0.001;FmRNA=207.366、148.411和158.661,P均〈0.001）;同一浓度,24、48和72h时点各组比较,PDCD5蛋白及mRNA的表达差异均无统计学意义（F蛋白=0.950、1.870、2.218和2.232,P均〉0.05;FmRNA=1.267、2.376、1.221和2.292,P均〉0.05）。各组BGC-823细胞凋亡指数比较,差异有统计学意义（F=230.069,P〈0.001）。结论：凋亡相关基因PDCD5可能在白藜芦醇诱导胃癌BGC-823细胞凋亡过程中发挥重要作用。     

凋亡相关蛋白 PDCD5在 Graves′病患者中的表达

目的：通过检测凋亡相关蛋白 PDCD5在 Graves′病（GD）患者外周血单个核细胞（PBMC）中的表达情况,探讨程序性死亡因子5（PDCD5）与 GD 发生发展之间的关系。方法采用 Western blot 方法测定50例 GD患者和30例健康对照者 PBMC 中 PDCD5的蛋白表达。结果与健康对照者比较,PDCD5蛋白在 GD 患者 PBMC中的阳性表达率和表达水平均升高,其中 PDCD5的表达水平差异有统计学意义（P ＜0．05）,且 GD 患者高 T3水平（T3≥4 ng／mL）者 PDCD5蛋白的表达显著高于低 T3水平（T3＜4 ng ／mL）者（P ＜0．05）。结论PDCD5在 GD 患者 PBMC 中表达升高,并且随着病情加重表达逐渐增加,提示 PDCD5可能与 GD 淋巴细胞凋亡异常有关,参与了GD 的发病过程。     

靶向PDCD5-Caspase-3 融合基因过表达 对HepG2 肝癌细胞增殖与凋亡的影响

目的 探讨靶向PDCD5-Caspase-3 融合基因过表达对HepG2 肝癌细胞体外增殖与凋亡的影响。 方法 利用基因重组技术构建PDCD5-Caspase-3 融合基因,克隆到带有EGFP 基因的GV358 慢病毒表达载 体,与辅助质粒共同转染293T 细胞,通过同源重组,获得融合基因重组慢病毒PDCD5-Caspase-3。体外 转染人肝癌HepG-2 细胞72 h 后,Western bolt 检测肝癌HepG-2 细胞中PDCD5 蛋白和Caspase-3 蛋白表 达,CCK-8 法检测PDCD5-Caspase-3 融合基因过表达对HepG-2 肝癌细胞增殖的影响,流式细胞术观察其 对细胞凋亡的影响。结果 PDCD5-Caspase-3 融合基因过表达可增加HepG-2 肝癌细胞中PDCD5 蛋白和 Caspase-3 蛋白合成（P <0.05）;与对照组或空白组相比,转染72 h 后实验组细胞增殖能力下降（P <0.05）; 与对照组或空白组比较,转染72 h 后实验组细胞凋亡率增加（P <0.05）。结论 促凋亡基因PDCD5 和 Caspase-3 联合表达可抑制HepG2 肝癌细胞增殖,并促进其凋亡,可作为肝癌治疗潜在靶点。     

PDCD5蛋白对地塞米松诱导的多发性 骨髓瘤细胞凋亡的影响及机制初探

目的：观测程序化细胞死亡分子5（programmed cell death 5,PDCD5）表达蛋白对地塞米松诱导人多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）细胞（KM3）凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法：将不同浓度的重组人程序化细胞死亡分子5 (human recombinant PDCD5, rhPDCD5)蛋白单独或/和地塞米松（dexamethasone,DXM）同时加入处于对数生长期的KM3细胞,共同培养一段时间,收集细胞后行以下检测：（1）Annexin V-FITC & PI双染法应用流式细胞术（flowcytometry,FCM）检测KM3细胞凋亡率;（2）蛋白免疫印迹方法检测KM3细胞中caspase-3活性;（3）免疫细胞化学法检测KM3细胞survivin蛋白表达。结果：KM3细胞凋亡率,在rhPDCD5和DXM联用组较单用组明显增加,且浓度较高PDCD5蛋白组作用更明显。KM3细胞caspase-3蛋白活性,在rhPDCD5和DXM联用组较单用组明显上调,高浓度PDCD5蛋白组（20 mg/L）的caspase-3活化较低浓度 (10 mg/L)组明显。KM3细胞survivin蛋白表达,在rhPDCD5和DXM联用组较单用组表达明显下调,并且浓度较高的PDCD5蛋白组survivin表达下调更明显。结论：PDCD5蛋白可直接作用于多发性骨髓瘤细胞使细胞凋亡,并对地塞米松诱导的KM3细胞凋亡有明显的促进作用。PDCD5蛋白可能通过激活caspase-3和下调survivin蛋白表达发挥其促进多发性骨髓瘤细胞凋亡的作用。     

miR-144/451基因簇调控网络的生物信息学分析

目的生物信息学方法是预测miRNA二级结构及miRNA靶基因的有用工具。miRNA、转录因子和靶基因之间的调控网络参与多种生理、病理活动的分子机制。文中用生物信息学方法预测mir-144/451基因簇的调控网络结构。方法运用多个在线数据库,研究miR-144/451基因簇的上游转录因子及下游靶基因间的多个反馈和前反馈环路,对参与miR-144/451基因簇调控环路的基因进行功能聚类分析,绘制miR-144/451基因簇的核心调控网络图。结果 miR-144/451基因簇与其上游转录因子GATA1有17个共调控的靶基因,与生物体蛋白磷酸化、性腺发育、上皮细胞分化、葡萄糖代谢等生化学过程密切相关,并参与胰岛素信号通路、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒作用、Toll样受体信号通路、ErbB信号通路及黄体酮调节卵细胞成熟等体内重要生理过程。结论对miR-144/451基因簇调控网络的生物信息学分析有助于理解其在细胞发育、细胞周期调控和肿瘤发生过程中的作用机制,为后续实验提供了理论依据。     

PDCD5在子宫内膜癌中的表达及临床意义

目的：检测程序性细胞死亡因子5（programmed cell death 5,PDCD5）在子宫内膜癌（Endometrial carcinoma ,EC）组织中的表达水平,结合临床资料,并分析其意义,初步探讨PDCD5的表达与子宫内膜癌发生的相关性。方法分别采用实时荧光定量PCR和免疫组织化学法检测PDCD5 mRNA和蛋白的表达水平。结果子宫内膜癌中PDCD5 mRNA的表达明显低于对照组,且差异有统计学意义,P＜0.05。结果显示PDCD5的表达水平和EC患者的临床分期、组织学分级、肌层浸润以及有无淋巴结转移有相关性（P均＜0.05）,而与子宫内膜癌患者的年龄未发现明显的关联性（P＞0.05）。结论 PDCD5;可能成为一种潜在的子宫内膜癌的早期诊断分子标记物。     

多囊卵巢综合征患者黄素化颗粒细胞中PDCD5蛋白的表达

目的:了解程序化细胞死亡蛋白5(programmed cell death 5,PDCD5)在多囊卵巢综合征(polysystic ovary syndrome,PCOS)及对照组卵巢颗粒细胞中的表达情况,探讨PDCD5与PCOS的发病关系.方法:选择体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF)中PCOS患者及对照组各30例,收集其颗粒细胞,分别用流式细胞技术、直接免疫荧光以及免疫组化技术检测PDCD5蛋白在颗粒细胞中的表达水平及定位.结果:与对照组相比,PCOS颗粒细胞亚二倍体细胞数明显增加,颗粒细胞中PDCD5的表达明显上调(P<0.05),PDCD5阳性细胞主要表达在胞浆,部分表达在胞核.结论:PCOS患者黄素化颗粒细胞凋亡较对照组增加,提示细胞凋亡可能在PCOS的发病中起一定作用, 凋亡调控蛋白PDCD5可能参与了正常及PCOS卵巢颗粒细胞的凋亡.     

PDCD5和TRAIL诱导胃癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨PDCD5及TRAIL对胃癌细胞株MKN28体外诱导凋亡的作用及机制。方法培养,MTT法分析细胞增殖抑制率及细胞存活率,流式细胞仪分析细胞凋亡及细胞周期．AO／EB染色进行观察凋亡细胞？结果TRAIL可明显抑制MKN28细胞增殖,并可诱导凋亡。PDCD5对MKN28细胞抑制增殖、诱导凋亡作用不明显。PDCD5、TRAIL联合应用对MKN28细胞有显著的抑制增殖、诱导凋亡作用。两者具有协同作用。结论TRAIL对MKN28细胞株有一定程度的凋亡诱导作用。PDCD5对MKN28细胞的凋亡作用不明显。TRAIL联合PDCD5可以高效诱导MKN28细胞凋亡。     

程序化细胞死亡因子5过表达促进雷公藤内醇酯诱导的类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡

目的:探讨程序化细胞死亡因子5(progrmmed cell death 5,PDCD5)过表达对雷公藤内醇酯(triptolide)诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(rheumatiod arthritis fibroblast-likes synoviocytes,RA FLS)凋亡的作用.方法:体外分离培养RA FLS进行腺病毒Ad-PDCD5(含有PDCD5基因的腺病毒载体)的转染,分别用免疫印迹法和流式细胞术检测Ad-PDCD5转染后的RA FLS中PDCD5蛋白表达及经雷公藤内醇酯处理后的PDCD5蛋白过表达的RAFLS的凋亡率.结果:用感染复数(multiplicity of infection,MOI)分别为50、100、200和300的Ad-PDCD5感染RAFLS 36 h后,PDCD5蛋白表达水平呈现剂量依赖性增加.未经雷公藤内醇酯处理的非感染组、Ad-null组(不含目的基因的空载体)和Ad-PDCD5组RA FLS的凋亡之间差异无统计学意义,经雷公藤内醇酯处理后,其RA FLS的凋亡率分别为(22.51±3.87)%,(28.77±12.97)%和(48.87±12.69)%.表明此腺病毒体系能够有效地使PDCD5蛋白过表达,在RA FLS中,单独使用雷公藤内醇酯或者单独转染PDCD5都不能明显地诱导细胞凋亡,但过表达PDCD5再进行雷公藤内醇酯处理可以诱导细胞凋亡.结论:腺病毒Ad-PDCD5转染使PDCD5过表达,从而能够促进雷公藤内醇酯诱导的RA FLS凋亡,为类风湿关节炎的临床治疗提供了一个可能的干预靶点.     

白藜芦醇对裸鼠胃癌移植瘤中PDCD5蛋白表达及细胞凋亡的影响

目的探讨白藜芦醇(Res)对裸鼠胃癌移植瘤细胞凋亡相关基因PDCD5蛋白表达及细胞凋亡的影响。方法将BGC-823细胞复苏后,通过右前肢腋部皮下移植构建裸鼠胃癌移植瘤模型。建模成功后的荷瘤裸鼠随机分为空白对照组、Res组、顺铂组和联合用药组(白藜芦醇+顺铂),各组分别在成瘤部位皮下注射0.2ml相应的药物,每日1次,治疗1周。停药后将裸鼠处死,剥离肿瘤组织。采用免疫组织化学方法检测移植瘤组织中PDCD5蛋白表达,采用原位末端标记法(TUNEL)检测移植瘤组织中细胞凋亡情况。结果 Res组中PDCD5蛋白表达水平明显高于空白对照组,但低于顺铂组和联合用药组,上述各组两两相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。TUNEL法检测到胃癌移植瘤中凋亡细胞核呈棕褐色,染色深浅不一,染色质分布不均,空白对照组中仅见到少数凋亡细胞,Res组、顺铂组和联合用药组凋亡细胞数依次增加,上述各组两两相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论白藜芦醇可上调裸鼠胃癌移植瘤细胞中PDCD5的蛋白表达,表明其可能通过上调PDCD5的表达进而诱导细胞凋亡。     

PDCD5 Correlates with Disease Activity and IL-17 in Rheumatoid Arthritis

Background Programmed cell death 5 (PDCD5) is a novel apoptotic regulatory gene, which has a promoting effect on apoptosis of various tumor cells. Studies showed that PDCD5 accelerates the apoptosis of synoviocytes in vitro, implying its potential role in the pathogenesis of rheumatoid arthritis (RA). The objective of this study was to examine the expression of PDCD5 in serum and synovial fluid of RA and to determine its effect on the expression of inflammatory cytokine, interleukin-17 (IL-17), as well as the assessment of disease activity in RA. Methods PDCD5 and IL-17 levels in serum and synovial fluid from 18 RA patients and 22 Osteoarthritis (OA) patients were detected by ELISA. The concentrations of serum PDCD5 in 40 healthy people were also detected as control. As disease activity indices, C-reactive protein (CRP), erythrocyte sedimentation rate (ESR), rheumatoid factor (RF), and X-ray grading scale were also evaluated. Results The serum and synovial fluid PDCD5 levels in RA patients were significantly higher than those in OA and healthy controls. The serum PDCD5 level was inversely correlated with CRP and ESR. Further, serum PDCD5 level in RF negative group was significantly higher than that in positive group. In addition, PDCD5 level had a negative correlation with IL-17 level both in serum and synovial fluid of RA patients. However, the differences of synovial fluid PDCD5 level in RA patients with different Larsen stages were not detectable. Conclusions These results suggest that PDCD5 might play a role in the pathogenesis of RA. Insufficient apoptosis of FLS and inflammatory cells in RA could possibly cause the increased expression of PDCD5 protein. Meanwhile, PDCD5 level correlated negatively with disease activity indices and IL-17 level, implying it as a potential target in the diagnosis and treatment of RA.     

Programmed cell death 5 correlates with disease activity and interleukin-17 in serum and synovial fluid of rheumatoid arthritis patients

Background Programmed cell death 5 (PDCD5) is a novel apoptotic regulatory gene that promotes apoptosis in various tumor cells.Studies have shown that PDCD5 accelerates the apoptosis of synoviocytes in...