第三届全国普外中青年医师学术交流会(续)

江志伟,男,28岁,南京军区总医院全军普外研究所主治医师。《器官移植术后供受体间细胞移居嵌合现象的研究及其意义》选择3例接受男性供体移植物的女性器官移植患者为对象,采用多聚酶链反应技术扩增Y染色体特异性DNA片段,结果在患者外周血或皮肤组织中发现Y染色体特异性DNA     

小片段游离胎儿DNA检测Y染色体性别决定区的临床意义

目的研究从早孕妇女外周血中提取小片段游离胎儿DNA检测胎儿Y染色体性别决定区（SRY）的方法,提高PCR检测的特异性和敏感性,评估利用小片段游离胎儿DNA对性连锁遗传病进行无创性产前诊断可行性。方法收集80例孕妇外周血,提取游离的胎儿DNA和提纯小片段游离胎儿DNA,PCR检测SRY基因。结果80例受试者中2种样本敏感性和特异性比较差异有统计学意义。结论可利用孕妇外周血中小片段游离胎儿DNA检测胎儿Y染色体性别决定区,敏感性和特异性优于总游离DNA,可用于孕早期性连锁遗传疾病和单基因突变疾病产前诊断。     

慢性移植肾肾病管周毛细血管内皮细胞嵌合现象分析

目的:观察慢性移植肾肾病(CAN)中血管内皮细胞被受者内皮细胞替代(内皮嵌合)的现象,分析内皮嵌合对CAN进展的影响。方法:无功能移植肾切除组织,符合慢性移植肾肾病(CAN)造成移植肾失功、男性供者女性受者标本29例,选择Y染色体长臂Yq12区域(异染色质区)DNA片段作为探针,同时选择X染色体着丝粒区(α卫星DNA)探针作为对照,通过在石蜡切片标本上进行间期细胞双色荧光原位杂交(FISH),观察肾小管周毛细血管(PTC)内皮细胞的嵌合程度。结果:CAN中PTC内皮细胞嵌合现象较普遍存在,内皮细胞的分布呈灶状,供者内皮细胞和受体内皮细胞可相邻存在。PTC密度与间质纤维化程度有关,CD31阳性的PTC每单位面积密度14.52±4.85个,微血管内皮细胞嵌合出现比例为0.16±0.04,两者无明显相关性(r=0.13,P>0.05)。结论:肾脏移植物中血管内皮细胞可以被受者来源的内皮细胞所替代,CAN中PTC密度减少,内皮细胞的嵌合的发生与CAN的进展无直接关系。     

肾脏移植物血管内皮细胞嵌合现象预后观察

目的:用荧光原位杂交方法(FISH)观察移植肾中血管内皮细胞被受体内皮细胞替代(内皮嵌合)的现象,并分析内皮嵌合对肾脏移植物预后的影响。方法:移植后2周到4个月男性供者、女性受者的移植肾穿刺活检标本34例,选择Y染色体长臂Yq12区域(异染色质区)DNA片段作为探针,同时选择X染色体着丝粒区(α卫星DNA)探针作为对照,通过在石蜡切片标本上进行间期细胞双色荧光原位杂交,分析血管内皮细胞被受体替代的现象,分析其对移植肾预后的影响。结果:肾脏移植物中血管内皮细胞嵌合现象较普遍存在,内皮细胞的分布呈灶状,供者内皮细胞和受体内皮细胞可相邻存在。血管内皮细胞嵌合的发生与否移植肾1年血清肌酐值分别为(115.88±25.06)μmol/L,(118.16±18.85)μmol/L,差异无显著性意义(P>0.05)。结论:肾脏移植物中血管内皮细胞可以被受者来源的内皮细胞所替代,对移植后1年的肾功能无明显影响,内皮嵌合对移植肾的长期存活的影响有待进一步观察。     

两例嵌合Y染色体长臂大片段缺失的产前诊断及文献回顾分析

目的分析两例胎儿羊水细胞嵌合Y染色体长臂大片段缺失病例，为产前诊断提供遗传咨询。方法综合应用细胞遗传学核型分析、荧光原位杂交（FISH）、二代测序法等对胎儿的羊水细胞进行鉴定。结果例1孕妇因高龄行母亲外周血游离DNA（NIPT）检测提示性染色体异常就诊，羊水细胞核型为45,X[9]/46,X,+mar[91]，FISH及二代测序法结果提示SRY基因及AZFa区域完整，AZFb和AZFc区域完全缺失；引产儿为男性，阴茎正常大小，未发现其他异常。例2孕妇孕晚期因B超检查提示多囊肾及胎儿宫内发育迟缓就诊（唐氏综合征筛查低风险），FISH及二代测序法提示羊水细胞存在50%XO嵌合，SRY基因及AZFa区域完整，AZFb和AZFc区域完全缺失；引产儿表型为女性，生长发育迟缓。两例家属外周血核型结果均正常，均拒绝作进一步病理检查。结论嵌合Y染色体长臂大片段缺失不仅影响胎儿性别及生长发育，还影响胎儿的生殖能力。目前唐氏综合征筛查和超声检查对其有局限性，建议行NIPT检测或产前诊断以防漏诊。     

同种异体黑素细胞移植治疗白癜风

目的：探索同种异体纯培养黑素细胞移植治疗白癜风的可行性。方法：用负压吸疱法在一位女性稳定期白癜风志愿白斑妪吸疱,注入来自健康男性供体的培养黑素细胞悬液,连续观察外观效果,并通过组织病理学和Y染色体特异性片段检测的方法确定异体黑素细胞的转归。如果移植区色素有一定恢复,则重复实验,检测结果的可靠性。结果：首例患移植一月后移植区有色素开始恢复,75天后颜色与邻近正常皮肤颜色接近。160天后复色区组织病理显示基底层有黑素细胞存活,并向周围的角质形成细胞分泌大量黑素颗粒;组织DNA中检查出有Y染色体特异性片段。再次移植另一个供体的黑素细胞,移植区域也有明显色素恢复。而原先恢复的色素仍然稳定存在。在其他志愿中有的也重复出了类似结果。结论：同种异体黑素细胞移植可以在白癜风患身上存活,使皮肤恢复颜色。它有希望成为治疗白癜风的一个新方法。     

肝脏移植术后移植物抗宿主病三例报告

目的 探讨与总结肝脏移植术后移植物抗宿主病(GVHD)的诊断及治疗经验。方法 跟踪并分析3例原位肝脏移植患者急性GVHD的临床经过和实验室检查结果。临床表现、皮肤活检、外周血HLA及聚合酶链反应扩增短串联重复序列(PCR—STR)检查作为其诊断依据。并对免疫抑制剂进行调整。结果 3例在术后3～8周内均出现不明原因的发热、皮疹、腹泻、中性粒细胞减少或全血细胞减少,期间肝功能均正常或接近正常,巨细胞病毒(CMV)早期抗原(pp65)、EB病毒抗体(IgM)均阴性。术后受体外周血淋巴细胞可检测到供体HLA抗原,1例女性受体外周血PCR—STR检测到供体Y染色体嵌合。3例患者最终均死于感染、消化道出血、多器官功能衰竭等并发症。结论 肝移植术后GVHD的发生并非罕见,早期易被误诊,治疗效果令人失望。     

肾移植术后受者体内微嵌合状态的研究

目的:探讨肾移植术后受者体内微嵌合状态与移植肾功能、排斥反应之间的关系.方法:采用对人类性别决定基因SRY扩增的巢式PCR方法,对接受79例男性供肾的女性肾移植患者外周血的微嵌合进行检测分析.结果:总的微嵌合发生率为55.70%(44/79),其中移植后6个月内微嵌合的发生率为35.71%,6～18个月内发生率为46.67%,18个月以上发生率为71.43%.10例患者术后14 d至6个月连续观察发现微嵌合的出现呈波纹式动态变化.嵌合阳性患者的排斥反应发生次数明显少于嵌合阴性患者(P＜0.05),但二者血肌酐值差别无显著性(P＞0.05).结论:微嵌合阳性患者的排斥反应发生率明显降低.     

人参多糖动员的造血干/祖细胞移植重建造血衰竭小鼠造血功能的研究

目的:探讨经人参多糖动员的外周血造血干/祖细胞移植对造血衰竭小鼠造血重建的作用。方法:建立小鼠造血衰竭模型,移植经人参多糖动员的外周血单个核细胞,检测受体小鼠生存时间,外周血WBC,脾湿重及脾集落数,进行染色体嵌合实验。结果:经人参多糖动员的雄性小鼠外周血MNC1×105个输注给致死剂量照射的雌性小鼠,可明显延长小鼠存活时间;提高受体小鼠外周血WBC数;亦能增加脾湿重,提高脾集落(CFU-S)数;经Y染色体检测(PCR法)受体小鼠外周血单个核细胞可检出581bpY染色体序列。结论:经人参多糖动员小鼠的外周血中存在数量较多的造血干/祖细胞,回输给造血衰竭小鼠能重建小鼠造血功能。     

肾移植急性排斥反应时尿中供体细胞DNA检测的临床意义

目的通过对肾移植患者急性排斥反应时尿中出现的供体细胞的DNA进行检测,试图找到一种方便快速、无创性诊断肾移植急性排斥反应的新方法.方法以供体为男性,受体为女性或HLA-DR抗原有错配的肾移植患者80例为研究对象,其中急性排斥反应34例,肾功能正常者41例,药物性肾功能损伤5例.利用PCR及PCR-SSP法分别检测Y染色体上特异的基因片断SRY、DYZ-1和HLA-DR抗原的基因片断DRBl.结果供体为男性的女性急性排斥反应患者11例,SRY阳性10例(90.9%),DYZ-1阳性11例(100%);对照组肾功能正常患者14例,SRY的检测结果为阳性1例,阴性13例(92.8%);DYZ-1阳性2例,阴性12例(85.7%).HLA-DR抗原有错配的急性排斥反应23例,DRBl阳性21例(91.3%),阴性2例,经抗排斥治疗17例转为阴性;对照组肾功能正常患者27例,DRBI阳性3例,阴性24例(88.9%).药物性肾功能损伤5例的PCR检测结果均为阴性.结论肾移植术后急性排斥反应发生时,患者尿中来自供体细胞的DNA高频率地出现,随着抗排斥治疗移植肾功能恢复而消失.同时,肾功能正常及药物性肾功能损伤患者供体细胞的DNA检测为阴性,说明肾移植患者尿中供体细胞DNA的PCR检测可以作为诊断急性排斥反应并与药物性肾功能损伤进行鉴别的一种崭新方法.     

Use of PCR and PCR-SSP for detection of urinary donor-origin DNA in renal transplant recipients with acute rejection

Objective To analyze the urine of renal recipients for the pressence of donor DNA in an attempt to establish an alternative diagnostic means of acute rejection.Methods Sixty-four renal transplant recipients were examined.Thirty-seven were normal after transplantation,while 22 others developed acute rejection,based on serum creatinine levels and/or needle biopsy findings of the graft.Five developed drug-induced renal dysfunction.In female recipients with a male graft,we examined urine for the presence of Ychromosome(SRY and DYZ-1) and in recipients receiving and HLA mismatched graft,we looked for HLA-DR gene(DRB1)using PCR.Results Among the 14 female recipients with male grafte demonstrating stable renal function,only one was positive for SRY and DYZ-1 on the Y chromosome.However,sry AND DYZ-1 were found in the urine of four female patients with acute rejection,but these DNA fragments were not detected in 3 of the 4 after anti-rejection therapy.The last patient was referred to hemodialysis.Of 23 recipients of a graft from HLA mismatch donors with stable renal function,DRB1 was negative in 21(91%).Of 18 patients with acute rejection,DRB1 was positive in 16(89%)and negative in 2.these ENA fragments were no longer found in 13 patients after anti-rejection therapy.In all patients with drug induced renal dysfunction,donor-derived DNA was negative.Conclusions Presence of door specific DNA in the urine of the recipient is strongly associated with acute rejection.Analysis of dna DNA derived from donor cells in urine was an effective and accurate method for the diagnosis of acute rejection of a renal transplant.     

建立肝肠联合移植大鼠模型及移植肝对小肠的免疫保护作用

目的：建立新型肝肠联合移植大鼠模型，并研究移植肝是否对移植肠具有免疫保护作用。方法：肝肠联合移植切取移植物时，保留门静脉完整性，利用供体胸段下腔静脉在门静脉侧壁上建立～袖套，并安置套管。受体手术时，将此袖套与受体门静脉残端套管法吻合。动脉重建通过供体肠系膜上动脉与受体右肾动脉端端吻合。免疫保护作用通过术后病理学检查评估。结果：用此法建立肝肠联合移植大鼠模型手术无肝期显著缩短，与Kamada双套管法肝移植无肝期相同，血流动力学影响小，手术成功率高。术后7、14天异基因小肠移植组出现重度排斥反应，而肝肠联合移植组仅表现为中度排斥。结论：用该方法建立一期大鼠肝肠联合移植模型方便可行，且成功率高。肝肠联合移植时移植肝对移植小肠具有免疫保护作用。     

一种新型肝肠联合移植大鼠模型的建立及肝对小肠免疫保护作用初探

目的建立一种新型的大鼠肝肠联合整体移植模型,并研究移植肝是否对移植肠具有免疫保护作用.方法肝肠联合移植在切取移植物后,利用供体胸段下腔静脉在门静脉侧壁建立一袖套,并安置套管.受体手术时,将此门静咏侧壁袖套与受体门静脉残端套管法吻合.供体肠系膜上动脉与受体右肾动脉吻合.免疫保护作用通过术后病理学检查评估.结果本法使受体手术无肝期与Kamada双套管法肝移植无肝期相同,血流动力学影响小,手术成功率高.术后肝肠联合移植组排斥反应程度较小肠移植组轻.结论用本方法建立大鼠肝肠联合移植模型是可行的.肝肠联合移植时肝对小肠具有保护作用.     

Endothelial cell chimerism by fluorescence in situ hybridization in gender mismatched renal allograft biopsies

Background  The blood vessels of a transplanted organ are the interface between donor and recipient. The endothelium in the blood vessels is thought to be the major target for graft rejection. Endothelial cells of a transplanted organ can be of recipient origin after transplantation. In this study, we tested whether endothelial chimerism correlated with the graft rejection and cold ischemia.
Methods  We studied the biopsy samples from 34 renal transplants of female recipients who received the kidney from a male donor for the presence of endothelial cells of recipient origin. We examined the tissue sections of renal biopsy samples by fluorescence in situ hybridization (FISH) for the presence of endothelial cells containing two X chromosomes using a biotinylated Y chromosome probe and digoxigenin labelled X chromosome probe, and then analyzed the relationship between the endothelial cell chimerism and the rejection and cold ischemia.
Results  Endothelial chimerism was common and irrespective of rejections (P>0.05). The cold ischemic time of chimerism group was longer than no chimerism group ((14.83±4.03) hours vs (11.27±3.87) hours, P<0.05).
Conclusions  There is no correlation between the percentage of recipient endothelial cells in vascular endothelial cells and the type of graft rejection. The endothelium damaged by ischemic injury might be repaired by the endothelial cells from the recipient.

     

MN基因型定型在异基因脐血干细胞移植植活证据检测中的应用

目的：探讨异基因脐血干细胞移植植活证据检测中简单易行的方法。方法：取供者和受者移植前及移植后15、300d的标本，抽提DNA。根据已发表的基因序列设计合成两对引物，采用PCR-SSP方法检测MN血型基因型。结果：供者为NN型，受者移植前为MM型，移植后15d为MN型（嵌合型），移植后300d为NN型（供者型）。NN基因在移植植活证据中作为供者的标记物在受者体内发现。结论：采用MN血型基因检测作为植活证据，可以对异基因脐血干细胞移植进行早期监控，且标本量小，较其他方法更加敏感。     

胰肾联合移植治疗老年2型糖尿病合并终末期肾病

四川大学华西医院于2007年3月对一位65岁高龄的2型糖尿病患者成功施行了胰肾联合移植手术.患者为男性,患2型糖尿病史15年,合并肾功能衰竭5年,并出现糖尿病眼底病变、周围神经损害等症状.手术将供肾移植于左侧髂窝,供胰移植于右侧髂窝,胰腺外分泌引流采用经肠道、内分泌回流采用经体循环途径的术式.术后第1 d C-肽即达正常水平,第4 d血肌酐恢复正常,第11 d血尿素氮恢复正常;血糖逐渐趋于稳定,第16 d完全停用胰岛素.术后3周OGTT结果显示移植胰腺功能正常.无任何并发症.术后随访6月余,血糖稳定,完全停用胰岛素,肾功能正常,视力也有一定程度的恢复.     

MN基因型定型在异基因脐血干细胞移植植活证据检测中的应用

目的探讨异基因脐血干细胞移植植活证据检测中简单易行的方法。方法取供者和受者移植前及移植后15、300d的标本,抽提DNA。根据已发表的基因序列设计合成两对引物,采用PCR-SSP方法检测MN血型基因型。结果供者为NN型,受者移植前为MM型,移植后15 d为MN型(嵌合型),移植后300 d为NN型(供者型)。NN基因在移植植活证据中作为供者的标记物在受者体内发现。结论采用MN血型基因型检测作为植活证据,可以对异基因脐血干细胞移植进行早期监控,且标本量小,较其他方法更加敏感。     

改进技术的大鼠异体全小肠移植术

目的：为了减少并发症，提高成活率，通过改进外科技术，建立成功的大鼠小肠移植模型。方法：１９６只大鼠施行异位全小肠移植，术前缩短禁食时间，补充能量，术中静脉输液，保持血压稳定，以增加对手术的耐受性；减少对供肠的机械和缺血性损伤，改善供肠生机；重建供肠血管采用腹主动脉－腹主动脉吻合及门静脉－左肾静脉套管法吻合，缩短热缺血时间，保证供肠血供充足与回流通畅。结果：９８只接受小肠移植大鼠的存活率为８９％，最长存活已超过２９６天。结论：改进外科技术后的大鼠小肠移植术具有并发症少、存活率高的特点，并且稳定、实用     

猪全胰十二指肠移植空肠引流及门静脉回流模型的建立

目的　建立猪的全胰十二指肠移植空肠内引流 ,门静脉回流模型。方法　 40头杂种猪分为供体组和受体组 ,对供体组 ( n=2 0 )进行 U W液低温灌注 ,切取全胰十二指肠以及部分腹主动脉和门静脉。修剪移植胰腺和十二指肠 ,U W液保存移植物的肠系膜上动脉开口和腹腔动脉开口分别与供体的髂内外动脉端 -端吻合呈“Y”形。切除受体组胰腺建成 型糖尿病模型 ,移植物的门静脉与受体的肠系膜上静脉吻合 ,移植物“Y”形的髂总动脉与受体腹主动脉端侧吻合。十二指肠与空肠侧侧吻合。结果　本实验完成全胰十二指肠移植 2 0例 ,胰腺移植手术中因麻醉过深呼吸抑制死亡 1例 ,2例手术后移植胰腺形成血栓、梗死。 17例手术后 2 4h外周血检测血糖正常 ,移植胰腺存活时间平均 18.6± 2 .6d。结论　成功地建立了猪全胰十二指肠移植空肠引流及门静脉回流的模型