BDNF对哮喘小鼠C7T5节段脊髓后角Kinesin-1表达的上调作用

目的探讨在哮喘发病中,脑源性神经营养因子(BDNF)对哮喘小鼠C7~T5节段脊髓后角内驱动蛋白-1(Kinesin-1)表达的调节作用。方法 BALB/c小鼠30只,按随机数字表法均分为正常对照组、哮喘组、Anti-BDNF抗体组,利用AniRes2005肺功能仪测小鼠气道阻力、免疫荧光方法和western blot方法检测各组小鼠C7~T5节段脊髓后角内Kinesin-1的表达。结果哮喘组小鼠吸气阻力和呼气阻力明显高于正常组(P<0.01),与哮喘组相比,Anti-BDNF抗体组吸气阻力和呼气阻力则明显降低;免疫荧光结果显示哮喘组C7~T5节段脊髓后角内Kinesin-1阳性产物的平均光密度值(MOD)显著高于正常对照组(P<0.01);而anti-BDNF抗体组与哮喘组相比,Kinesin-1阳性反应产物的MOD值则明显降低(P<0.01)。western blot方法也得到了相同的结论。结论 BDNF被阻断后,哮喘小鼠C7~T5节段脊髓后角内Kinesin-1的表达降低。     

哮喘小鼠C7-T5节段脊髓后角PKD1与PKD2的表达研究

目的探讨在哮喘发病中,蛋白激酶D1、蛋白激酶D2（proteinkinaseD1,D2,PKD1,PKD2）在哮喘小鼠c7-T5节段脊髓后角内的表达变化。方法BALB／c小鼠20只,按随机数字表法均分为正常对照组和哮喘组,利用AniRes2005肺功能仪测小鼠气道阻力、免疫荧光方法和Westernblot方法检测各组小鼠c7-T5节段脊髓后角内PKD1,PKD2的表达变化。结果哮喘组小鼠吸气阻力和呼气阻力明显高于正常组（P〈0．01）,哮喘模型建立成功。免疫荧光结果显示哮喘组c7．T5节段脊髓后角内PKD1,PKD2阳性产物的平均光密度值（MOD）显著高于正常对照组（P〈0．01）,westernblot方法检测也得到了相同的结果。结论哮喘小鼠C7-T5节段脊髓后角内PKD1,PKD2的表达升高。     

Akt对哮喘小鼠下呼吸道及内脏感觉传入部位IL-1β表达的影响

目的探讨在哮喘发病机制中,PKB/Akt对哮喘小鼠肺组织及C7-T5段脊神经节和相应节段脊髓后角IL-1β表达的调节作用。方法BALB/c小鼠30只,按随机数字表法均分为正常对照组、哮喘组、PKB/Akt阻断组,免疫组织化学检测各组小鼠肺组织及C7-T5节段脊神经节和相应节段脊髓后角IL-1β的表达,Western blot方法检测各组小鼠肺组织及C7-T5节段脊神经IL-1β的表达。结果免疫组织化学结果显示,哮喘组肺、C7-T5段脊神经节和相应节段脊髓后角IL-1β阳性产物的平均光密度值(MOD)显著高于正常对照组(P<0.01);而PKB/Akt阻断组与哮喘组相比MOD值明显降低(P<0.05)。Western blot结果显示:与正常对照组比较,哮喘组小鼠肺、C7～T5段脊神经中IL-1β的IDV(integrated density value)与β-actin IDV的比值均明显升高(P<0.01),而PKB/Akt阻断组明显低于哮喘组(P<0.05)。结论NGF介导的Akt通路的激活可上调IL-1β的表达,介导哮喘气道高反应和炎症反应。     

哮喘小鼠肺内及内脏感觉传入系统SH2-Bβ的表达

目的研究SH2-Bβ在哮喘小鼠肺及内脏感觉传入系统(C7~T5脊神经节及对应的脊髓后角)的表达,探讨SH2-Bβ在哮喘发病中的作用。方法BALB/c小鼠30只,按随机数字表法分为正常对照组、哮喘组,每组15只。利用免疫组织化学方法测定两组小鼠肺、C7~T5脊神经节及对应的脊髓后角SH2-Bβ的免疫反应变化;用免疫印迹法(Western blotting)检测肺及C7~T5节段脊髓SH2-Bβ及神经生长因子(NGF)的免疫反应变化;Metamoph图像分析系统对结果进行分析。结果免疫组织化学结果显示哮喘小鼠肺、C7~T5节段脊神经节及对应的脊髓后角SH2-Bβ免疫阳性产物平均光密度值分别为0.806±0.023、0.766±0.018、0.547±0.014,明显高于对照组(0.243±0.018、0.131±0.011、0.215±0.029)(P<0.01)。Western blotting显示SH2-Bβ及NGF在哮喘小鼠的C7~T5节段脊髓及肺内表达明显强于对照组;正常对照组脊髓及肺内的平均相对光密度值分别为0.346±0.017和0.512±0.018,哮喘组为0.738±0.021和1.526±0.022。NGF在正常对照组脊髓及肺内的平均相对光密度值分别为0.357±0.021和0.734±0.013,哮喘组为1.445±0.015和1.265±0.018;且SH2-Bβ与NGF光密度值呈正相关(r=0.651,P<0.01)。结论结果提示,SH2-Bβ在哮喘小鼠肺、C7~T5节段脊神经节及对应的脊髓后角过表达,可能是NGF参与哮喘发病的重要信号分子。     

地塞米松对哮喘豚鼠肺内、脊神经节及脊髓背角内蛋白激酶C表达的抑制作用

目的探讨地塞米松对哮喘豚鼠肺内、C7～T5脊神经节及对应节段脊髓背角内蛋白激酶C（PKC）表达的抑制作用。方法利用免疫组织化学和Western blotting方法。研究哮喘豚鼠肺内、C7～T5脊神经节及对应节段脊髓背角内PKC的免疫反应变化。结果哮喘组豚鼠肺内、C—L脊神经节及对应节段脊髓背角内PKC平均光密度值明显高于对照组（P〈0．01）,而地塞米松组则明显低于哮喘组（P〈0．01）。结论PKC可能参与哮喘的发病过程,地塞米松抑制哮喘豚鼠PKC的表达可能是其治疗哮喘的作用机制之一。     

哮喘时豚鼠下呼吸道及内脏感觉传入部位Trk A的表达以及神经生长因子对其影响

目的：探讨神经生长因子(NGF)在哮喘发病中的作用及其神经免疫调节机制。方法：应用免疫组织化学方法检测豚鼠下呼吸道和内脏感觉传入部位 NGF 高亲和力受体酪氨酸激酶 A(TrkA),用 Western blot 蛋白印迹方法检测豚鼠肺、脊神经节和脊髓背角 NGF 和 TrkA 的表达。结果：(1)与对照组相比,哮喘豚鼠气道上皮、肺内炎性细胞、血管平滑肌内的神经末梢、C_7～T_5段脊神经节及相应节段脊髓背角内 TrkA 阳性反应产物的平均灰度值均明显降低;哮喘 NGF 抗体组则明显高于哮喘组。(2)哮喘组豚鼠肺、C_7～T_5段脊神经节及相应节段脊髓样品中 TrkA 或 NGF 目标带的 IDV 与内参照 IDV 的比值均明显升高,而哮喘 NGF 抗体组则明显低于哮喘组。结论：NGF 可上调 TrkA 的表达,TrkA 介导的细胞内信号传导系统可能是 NGF 参与哮喘发病的主要途径之一。     

大鼠脊髓全横断后脑源性神经营养因子及其高亲和力受体在运动皮质表达的变化

目的：研究大鼠脊髓全横断后脑源性神经营养因子（BDNF）及其高亲和力受体（TrkB）在运动皮质表达的变化，为进一步探索脊髓损伤后再生修复机制和神经营养因子治疗脊髓损伤提供实验依据。方法：雄性SD大鼠42只随机分为3组：1.脊髓横断组：动物脊髓在胸9节段完全横断，按存活时间不同分为术后3、7、14、21及28d组；2.假手术组（只行椎板切除术）；3.正常对照组。动物到达存活时间点后，应用免疫组织化学ABC方法和图像分析技术检测TrkB及BDNF在运动皮质的表达和分布。结果：对照组和实验组运动皮质TrkB和BDNF阳性细胞主要分布在第5层，第3、4、6层也有少量阳性细胞。脊髓全横断后TrkB和BDNF的表达逐渐增高，于术后21d达高峰，28d回到正常水平，且TrkB表达上调早于BDNF。结论：脊髓全横断后运动皮质对BDNF的需求增加，内源性BDNF的增加可能有利于受损的皮质脊髓束神经元的存活与再生；在损伤早期给予外源性BDNF可能更有利于受损的皮质脊髓束神经元。     

大鼠体神经-内脏神经吻合后脑源性神经营养因子及其受体的表达变化

为了研究大鼠体神经-内脏神经吻合后脑源性神经营养因子(BDNF)及其受体酪氨酸激酶B(TrkB)在脊髓前角神经元中的表达变化,以正常大鼠为对照,运用RT-PCR技术检测大鼠体神经-内脏神经吻合术后不同时间脊髓腰4(L4)前角神经元中BDNF及TrkB mRNA的表达变化。结果显示,在正常大鼠L4前角神经元中,BDNF及TrkB的mRNA均存在一定水平的表达;体神经-内脏神经吻合术后7d、14d、1m和2m,BDNF和TrkBm RNA的表达均升高,术后7d达到高峰,14d开始下降;2m时BD-NF mRNA的表达量仍显著高于正常组(P<0.01),而TrkB mRNA的表达量到2m时虽仍高,但与正常组相比,其差异已无统计学意义(P>0.05)。上述结果表明,大鼠体神经-内脏神经反射弧建立后,脊髓L4前角神经元的内源性BDNF及其受体TrkB的表达均增高,它们可能作为保护性因子有利于受损神经元的存活和再生。     

实验性哮喘豚鼠内脏感觉传入部位SP免疫反应的研究

用免疫组织化学方法结合显微图像分析 ,观察哮喘豚鼠脊神经节、结状神经节、脊髓和孤束核内 P物质的变化。正常豚鼠 C7～ T5 脊神经节及结状神经节内存在 SP阳性反应细胞 ,其细胞质内充满棕色阳性反应颗粒 ,并可见大量的阳性反应纤维。 P物质免疫反应也见于 C7～ T5 脊髓后角板层 、板层 、中间带外侧核 ,呈点状分布 ,偶见阳性纤维。孤束核内可见大量的 P物质阳性反应。哮喘豚鼠结状神经节、C7～ T5 脊神经节和相应节段脊髓后角、孤束核内 P物质阳性反应的密度明显增多而平均灰度值却明显地低于对照组。上述结果表明 ,哮喘豚鼠内脏感觉传入部位 P物质表达增强 ,提示这些部位的 P物质可能参与哮喘的发病过程     

臂丛根性撕脱伤激活脊髓表达磷酸化CaMKⅡ的时程及定位研究

目的研究大鼠臂丛根性撕脱伤后磷酸化CaMKⅡ的时间和空间定位。方法将SD大鼠(6～8周龄)在手术显微镜下做臂丛根性撕脱伤手术后,应用Western blot方法测定相应脊髓节段(C7、C8)磷酸化CaMKⅡ在1、2、3 d时间点及正常大鼠的表达水平。同时应用免疫荧光染色方法检测目标蛋白在1 d时间点大鼠脊髓节段的表达水平及空间定位。结果正常大鼠脊髓相应节段检测不到磷酸化CaMKⅡ,在臂丛根性撕脱伤后1～2 d对应脊髓节段的磷酸化CaMKⅡ表达明显升高,撕脱伤后3d明显下降并接近正常水平;免疫荧光结果显示:臂丛根性撕脱伤后1 d,损伤侧脊髓前角运动神经元和中间神经元明显表达磷酸化CaMKⅡ,对侧脊髓前角运动神经元和中间神经元也有表达,但强度较撕脱侧明显减弱。结论臂丛根性撕脱伤诱导磷酸化CaMKⅡ在损伤节段1 d时高表达,然而在3 d时逐步下降到正常水平。     

哮喘豚鼠脊髓内CGRP免疫反应的定量分析

应用免疫组织化学和显微图像分析方法，对１６ 只哮喘豚鼠Ｃ７～Ｔ５ 节段脊髓后角内的ＣＧＲＰ免疫反应产物进行了定量研究。结果表明，哮喘豚鼠Ｃ７～Ｔ５ 节段脊髓后角内ＣＧＲＰ阳性反应纤维的密度大大高于正常对照组和实验对照组（Ｐ＜ ０．０１），平均灰度值明显低于正常对照组和实验对照组（Ｐ＜ ０．０１）。本研究结果提示，Ｃ７ ～Ｔ５ 节段脊髓后角内的ＣＧＲＰ可能参与支气管哮喘发病的病理生理过程。本实验结果为进一步探讨哮喘发病的中枢机制提供了一定的形态学依据。     

神经生长因子对哮喘豚鼠内脏感觉传入部位MMP-2表达的影响

目的探讨基质金属蛋白酶-2(MMP-2)在哮喘豚鼠内脏感觉传入部位的表达及神经生长因子(NGF)对MMP-2的调节作用。方法应用免疫组织化学方法检测豚鼠内脏感觉传入部位MMP-2免疫反应的变化。用W estern b lot蛋白印迹方法检测豚鼠C7~T5段脊神经节和相应节段脊髓背角NGF和MMP-2的表达。用Luzex-F实时图像分析系统和凝胶成像分析系统分别对结果进行图像分析。结果①免疫组织化学结果显示:豚鼠C7~T5段脊神经节和相应节段脊髓背角内MMP-2阳性免疫反应产物的平均灰度值(0-深色,255-浅色),生理盐水组(175.50±4.67、166.47±6.20)与单纯致敏组(172.63±9.51、165.20±5.14)比较没有显著差异(P>0.05);哮喘组(139.87±4.88、125.93±4.49)明显低于生理盐水组和单纯致敏组(P<0.01);哮喘+NGF抗体组(鼻腔吸入NGF抗体,169.73±6.24、152.37±8.67)则明显高于哮喘组(P<0.01)。②W estern b lot结果显示:与生理盐水组和单纯致敏组比较,哮喘组豚鼠C7~T5段脊神经节及相应节段脊髓样品中MMP-2和NGF阳性产物的IDV(Integrated Density Value)与β-actin IDV的比值均明显升高(P<0.01),而哮喘+NGF抗体组则明显低于哮喘组(P<0.01),表明NGF可上调豚鼠内脏感觉传入部位MMP-2的表达。结论C7~T5段脊神经节以及相应节段脊髓背角内的MMP-2可能也参与哮喘的发病过程,NGF诱发MMP-2的表达可能是NGF参与哮喘发病的机制之一,NGF抗体抑制哮喘时MMP-2的表达有可能延缓气道重塑的发生,可能是治疗哮喘的新途径。     

BDNF及其受体TrkB在成年恒河猴脊髓的表达

目的观察脑源性神经营养因子BDNF及其高亲合力受体TrkB在成年恒河猴胸髓的表达分布,为成年恒河猴脊髓BDNF、TrkB的功能研究提供形态学依据。方法灌注固定成年雄性恒河猴,取其胸段脊髓制作冰冻切片,用BDNF、TrkB特异性抗体行免疫组织化学SP法染色,观察BDNF、TrkB免疫阳性物质在胸段脊髓的分布。结果成年恒河猴胸髓内均可见BDNF、TrkB免疫反应阳性神经元,反应产物呈棕黄色颗粒。BDNF和TrkB免疫反应阳性细胞遍及胸髓灰质各板层,在腹角、侧角以及中央管邻近区域均可见阳性神经元,它们的阳性产物主要定位于神经元胞浆中,胞浆着色深,胞浆与胞核的界线清楚。BDNF免疫反应细胞的胞核未见染色,而不同的TrkB阳性细胞其胞核染色不一。结论成年恒河猴胸髓存在BDNF、TrkB的表达,其作用可能与猴脊髓的正常生理功能和损伤后的修复有关。     

Knockdown of BDNF suppressed invasion of HepG2 and HCCLM3 cells, a mechanism associated with inactivation of RhoA or Rac1 and actin skeleton disorganization

Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and its primary receptor tropomysin-related kinase B (TrkB) mediate critical signalings for supporting survival and growth of neurons. Even though we have previously confirmed that more expressions of BDNF and TrkB were closely correlated with multiple and advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the exact mechanisms underlying have not been investigated. The expressions of BDNF and TrkB were examined by western blot and BDNF secretion was evaluated by ELISA in human HCC cell lines of HepG2 and HCCLM3 with high metastatic potential. BDNF knockdown was performed by specific BDNF-siRNA transfection in HCC cells, actin cytoskeleton was shown by FITC-phalloidin staining and the activations of RhoA, Rac1 or Cdc42 were determined using western blot. Cell apoptosis and invasion were examined by flow cytometry and transwell assay, respectively. More expressions of BDNF and TrkB were found in HCCLM3 than in HepG2 cells. Inhibited expression of BDNF by specific siRNA showed impaired actin polymerization and decreased activations of RhoA or Rac1 in both HepG2 and HCCLM3 cells. BDNF knockdown also induced apoptosis and suppressed invasion of both HepG2 and HCCLM3 cells. Our results suggested a role of BDNF/TrkB in confering HCCLM3 cells advantage of metastasis, and BDNF knockdown inhibited cell invasion probably through the blocked actin polymerization and the correlated inactivation of RhoA or Rac1. Aiming at BDNF/TrkB signaling interruption may be an effective strategy to prevent HCC progression.     

脊髓小胶质细胞P2X_4受体在rrTNF诱导的病理性疼痛中的作用

目的:研究P2X4受体在坐骨神经周围给予重组大鼠TNF-α(recombinant rat TNF-α,rr TNF)引起的机械痛敏中的作用。方法:采用雄性SD大鼠(180~200 g),Western blot检测坐骨神经周围给予rr TNF后3 d、7d和14 d脊髓背角P2X4受体的表达水平,免疫荧光双染观察脊髓背角P2X4受体的表达部位;在坐骨神经周围给予rr TNF的大鼠前鞘内注射TNP-ATP,行为学检测大鼠50%机械撤足阈值的变化,Western blot检测脊髓背角TNF-α的表达是否发生变化。结果:与对照组相比,坐骨神经周围给予rr TNF(100 ng/L)后3 d、7 d和14 d同侧脊髓背角P2X4受体的表达水平明显升高(P0.01);P2X4受体只表达于小胶质细胞中,神经元和星形胶质细胞中没有表达。坐骨神经周围给予rr TNF的大鼠前鞘内注射TNP-ATP可防止rr TNF诱导的机械痛敏并抑制脊髓背角TNF-α的上调。结论:小胶质细胞P2X4受体可能通过上调脊髓背角的TNF-α介导rr TNF诱导的机械痛敏。     

地塞米松对哮喘豚鼠肺及内脏感觉传入系统神经生长因子表达的抑制作用

目的：探讨地塞米松对哮喘豚鼠肺及内脏感觉传人系统(C7-T5脊神经节及对应的脊髓后角)神经生长因子(NGF)表达的影响。方法：利用免疫组织化学和Westem印迹方法,观察生理盐水组、单纯致敏组、哮喘组和地塞米松组豚鼠肺及内脏感觉传人系统(C7-T5脊神经节及对应的脊髓后角)NGF表达的变化。结果：哮喘组豚鼠NGF在肺及内脏感觉传人系统(C7-T5脊神经节及对应的脊髓后角)表达明显高于对照组,而地塞米松组则明显低于哮喘组。结论：NGF可能参与哮喘的发病过程,地塞米松抑制哮喘豚鼠NGF的表达可能是其治疗哮喘的机制之一。     

TrkA对哮喘小鼠下呼吸道气道阻力及IL-1β表达的上调作用

目的研究NGF的特异性高亲合力受体TrkA对哮喘小鼠下呼吸道气道阻力及IL-1β的表达的调节作用,探讨TrkA介导的信号通路在哮喘发病机制中的作用。方法BALB/c小鼠30只,按随机数字表法均分为正常对照组、哮喘组、TrkA抗体阻断组。利用An iRes2005肺功能仪测小鼠气道阻力,利用免疫组织化学方法测定IL-1β表达,M etamoph图象分析系统对结果进行分析。结果哮喘小鼠吸气阻力和呼气阻力明显高于正常组小鼠(P<0.01),TrkA组吸气阻力和呼气阻力明显低于哮喘组。免疫组织化学结果显示TrkA抗体阻断组肺(0.324±0.013)、C7-T5节段脊神经节(0.301±0.065)及对应的脊髓后角(0.216±0.019)IL-1β免疫阳性产物平均光密度值明显低于哮喘组小鼠(0.796±0.025、0.745±0.016、0.528±0.011,P<0.01)。结论NGF介导的TrkA通路的激活可上调IL-1β的表达,介导哮喘气道高反应和炎症反应。