外周血内皮祖细胞改善肢体缺血的研究

目的:研究人外周血来源内皮祖细胞(EPC)移植对改善肢体缺血的作用. 方法:人外周血单个核细胞在体外诱导扩增6 d和14 d后,分别检测其EPC特异性标志的表达,并将荧光染料标记后的培养第6日的贴壁细胞通过缺血局部多点注射移植到后肢缺血的裸鼠动物模型体内,以评价其治疗效果. 结果:人外周血单个核细胞经体外诱导分化,培养第6日的贴壁细胞表达KDR, CD133, CD34和vWF,流式细胞仪检测其阳性率分别为(46.4±9.3)%, (33.8±11.7)%, (73.5±6.3)%和(38.9±8.2)%;培养第14日的贴壁细胞KDR, CD34和vWF的表达阳性率均增高,而CD133表达阳性率明显降低,流式细胞仪检测其阳性率分别为(81.5±7.6)%, (88.9±5.4)%, (78.3±13.6)%和(3.8±8.7)%;移植EPC后裸鼠缺血后肢的坏死情况和毛细血管密度均较对照组明显改善(P＜0.05);移植EPC后缺血后肢肌肉石蜡切片中可见分散不均的红色和黄绿色双色荧光的细胞掺入. 结论:从人外周血单个核细胞中可诱导出EPC,而且移植的EPC可以定向整合到后肢缺血局部,明显改善裸鼠后肢缺血.     

大鼠脾脏内皮祖细胞的分离培养及鉴定

目的 研究大鼠脾脏内皮祖细胞(EPC)的体外分离、定向培养及鉴定方法.方法 用密度梯度离心法获取大鼠脾脏中单个核细胞,用含血管内皮生长因子的DMEM培养液培养,每4天更换培养基去除非贴壁细胞,观察经过不同时间培养后的细胞形态、结构和功能变化.结果 培养4 d可发现梭形贴壁细胞,7 d后细胞呈集落状,14 d左右可观察到条索状、网状血管样结构,原代细胞培养21 d左右接近融合并呈典型的鹅卵石样排列.细胞免疫组化显示,培养7 d细胞CD31表达阳性,细胞DiI-LDL摄取和FITC-Lectin结合双阳性,流式细胞仪检测细胞CD133及VEGFR2的阳性率分别为(53.2±3.5)%和(64.5±5.1)%.结论 密度梯度离心法联合贴壁筛选及血管内皮生长因子诱导分化可以获得大鼠脾脏EPC.     

大鼠骨髓EPC的体外培养和生物学特性鉴定

目的 体外培养、诱导大鼠骨髓内皮祖细胞(EPC),观察EPC的生长特性,并进行鉴定.方法 冲洗大鼠长骨骨髓,用密度梯度离心法收集单个核细胞层,观察细胞在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导体系下生长情况并与未诱导组比较,对培养细胞进行免疫细胞化学检测.于培养3、7、14天采用流式细胞仪检测CD133 /Flk-1 双标记阳性细胞百分率.结果 贴壁细胞呈现团簇样生长、线样排列特殊形态.免疫细胞化学检测贴壁细胞CD133、CD34、Flk-1、Ⅷ因子(vWF)呈阳性表达.流式细胞检测结果显示,各个时间点诱导组CD133 /Flk-1 双标记阳性细胞百分率明显高于未诱导组(P＜0.01).结论 用密度梯度离心法在bFGF培养体系下可以获得较高纯度的EPC,该细胞具有内皮细胞的特性,经过体外诱导可以分化为内皮细胞.     

单克隆抗体CD133在内皮祖细胞表达的实验研究

目的 研究CD133在内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）表面表达，为内皮祖细胞的鉴定提供依据。方法 取兔髂骨骨髓，经密度梯度离心法分离并培养骨髓间充质干细胞（mensenchymal stem cell，MSC），在血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子等诱导条件下定向向内皮祖细胞分化，流式细胞仪检测不同时间内皮祖细胞CD133表达。结果 定向诱导分化细胞形态学呈现“鹅卵石”样或“铺路石”样外观，流式细胞仪检测发现细胞表达CD133，并随时间推移表达逐渐下降。结论 内皮祖细胞高表达CD133与培养时间密切相关。     

大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养及鉴定

目的: 探讨内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)分离培养鉴定方法及其生物学特性。方法： 采用梯密度离心法结合差速贴壁法分离获取大鼠骨髓单核细胞,培养于EGM 2 MV SingleQuots内皮细胞培养液中,分别取48 h内贴壁细胞(早期EPCs)和48 h后贴壁细胞(晚期EPCs),在倒置显微镜下观察细胞形态,应用流式细胞术鉴定EPCs表面抗原标志CD34,CD133和血管内皮生长因子受体 2（VEGFR 2）,激光共聚焦检测EPCs吞噬功能,透射电镜观察EPCs内部超微结构。结果： 单核细胞接种后呈小圆形,早期EPCs呈长梭形,晚期以纺锤形为主,培养7 d后有明显干细胞集落;增殖至第6代以后,形态开始逐渐接近于内皮细胞,并出现管腔样结构。内皮祖细胞表面标志CD34,CD133和VEGFR 2均呈阳性表达,能吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白并结合FITC标记的凝集素 1。透射电镜可观察到内皮细胞特征性细胞器Weible Palade小体。结论： 梯密度离心法结合差速贴壁法能够成功地从骨髓中分离、纯化、培养出内皮祖细胞,其增殖能力强,数量充足,生物学特性稳定。     

人脐血内皮祖细胞的体外培养

目的从人脐带血中分离内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）,建立人脐血内皮祖细胞体外培养的方法,为实现内皮祖细胞的移植及实验研究提供足量的细胞来源。方法采用密度梯度离心法分离人脐带血内皮祖细胞,在EGM-2培养基中培养,采用流式细胞仪、免疫组化和免疫荧光鉴定EPCs。结果脐带血单个核细胞在经EGM-2培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;1周后既分化成EPCs,细胞免疫荧光CD133染色率在培养第7天为（67.2±2.12）%,免疫组化CD34染色率为（89.67±2.05）%,流式细胞仪鉴定该种细胞CD133与KDR的双阳性率达87.8%。可确定该细胞为EPSc。结论采用本培养方法可获得良好的内皮祖细胞用于实验研究。     

人脐血内皮祖细胞体外扩增、鉴定和生物学活性

目的 建立一种稳定的体外分离培养和鉴定人脐血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)的方法 ,并探讨利于EPCs增殖的最佳接种浓度.方法 采用密度梯度离心法分离得到单个核细胞,制成1×106/ml、1.5×106/ml、2 × 106/ml、2.5×106/ml、3 × 106/ml、3.5×106/ml、4×106/ml 7个密度接种于铺被人纤维连接蛋白的培养瓶,比较各接种密度的贴壁细胞数和细胞集落形成情况,并采用激光共聚焦显微镜、流式细胞仪和免疫荧光鉴定EPCs.结果 不同接种密度得到的贴壁细胞数和细胞集落数有差别,在2.5×106/ml密度接种时得到的最佳贴壁细胞数和细胞集落数,与其他密度比较差异有统计学意义(P<0.05);双染色阳性细胞为正在分化EPCs;流式细胞仪检测内皮祖细胞对CD34、AC133、VEGFR2的阳性表达率分别为(1.67±0.35)%、(12.63±9.70)%、(66.81±6.63)%;免疫荧光检测内皮祖细胞一致性表达CD34、AC133、VEGFR2;黏附能力和迁移能力检测结果 分别为(33.7±1.6)、(29.2±1.2).结论 采用Ficoll密度梯度离心法结合贴壁筛选法可以较好地分离人脐血EPCs,以2.5×106/ml的密度接种培养可获得良好的细胞分化和增殖.     

人脐血内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

目的探索人脐静脉血内皮祖细胞的分离培养,为内皮祖细胞的临床应用提供实验方法。方法选择脐静脉血,应用密度梯度离心法,获取单个核细胞,接种于预先包埋了人纤维连接蛋白的培养板,用加入生长因子VEGF165和bFGF的内皮细胞专用培养基EGM-2MV培养细胞,3d后,洗掉非贴壁细胞,换培养液继续培养至7d,收集贴壁细胞进行细胞分析。激光共聚焦显微镜进行细胞功能学鉴定,流式细胞术测定祖细胞和内皮细胞系标志,MTT比色法检测细胞的生长状态。结果经过梯度密度离心和贴壁法选择的细胞能特异性吸附FITC标记的荆豆凝集素并内吞DiI-acLDL,祖细胞标志CD133及内皮细胞特异性抗原CD34、KDR检测,其阳性率分别为(27.05±2.94)%、(16.37±2.69)%和(56.67±7.29)%;体外培养的内皮祖细胞具有良好的细胞增殖活性。结论人脐静脉血中可以分离培养内皮祖细胞,为内皮祖细胞的进一步研究及临床应用奠定了基础。     

内皮祖细胞的分离培养及生物学特性的鉴定

目的 探讨大鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPC)体外诱导、培养和扩增的方法.方法 梯度离心法采集大鼠骨髓单个核细胞,分为血管内皮生长因子(VEGF)诱导组和非诱导组进行体外培养,应用免疫细胞化学和流式细胞术分别进行鉴定.结果 大鼠骨髓单个核细胞(MNC)经过培养,形成线样结构和类血管样结构,表达EPC特异性抗原CD133和内皮细胞(EC)的特异性抗原Ⅷ因子、Flk-1、和CD34,培养细胞同时具有EPC和EC的表面蛋白特性,且诱导组阳性细胞数多于非诱导组,形成特殊结构的时间早于非诱导组.结论 ①通过分离骨髓MNC进行诱导培养可以提高EPC的纯度.②VEGF可促进EPC的增殖和血管样结构的形成.③体外培养1周左右是EPC增殖的高峰期.     

不同细胞因子组合对脐带血AC133+细胞体外扩增效率的影响

目的探讨不同细胞因子组合对脐带血AC133+细胞体外扩增效率的影响.方法采用免疫荧光标记法,使用流式细胞仪测定新鲜分离的、不同培养条件下体外培养7、14d的脐带血AC133+细胞的扩增效率.结果新鲜脐带血AC133+细胞的比例为(0.93±0.2)%.短期液体扩增培养后,脐带血AC133+细胞的比例发生明显变化,其中在细胞因子SCF、FL和IL-3组合下,AC133+细胞的细胞数及扩增倍数与SCF、FL和IL-11组合相比较,差异非常显著(P＜0.01).结论在体外短期扩增培养中,早期效应细胞因子能显著上调脐带血AC133+细胞的比例;用SCF、FL和IL-3组合扩增脐带血造血干/祖细胞,能够获得更高的体外扩增效率.     

美乐托宁对ox-LDL诱导的人脐静脉血内皮祖细胞增殖、凋亡及Bcl-2表达的影响

目的:探讨美乐托宁(melatonin,Mel)对氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导的人脐静脉血内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)增殖、凋亡及Bcl-2表达的影响.方法:密度梯度离心法获取人脐静脉血单个核细胞,培养7 d后,贴壁细胞分成7组:对照组以RPMI1640培养液培养;ox-LDL各浓度组(共3组)分别用含5,10,20 mg/L ox-LDL的RPMI 1640培养液孵育;Mel各浓度组(共3组)分别先用含0.5,1.0,2.0 mmol/L Mel的RPMI 1640培养液培养24h,然后移去含Mel的RPMI 1640培养液,加入含10 mg/L ox-LDL的RPMI 1640培养液孵育.采用MTT法检测EPC增殖能力;流式细胞仪检测细胞凋亡率;提取细胞RNA,采用逆转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测Bcl-2 mRNA表达;采用免疫细胞化学法检测Bcl-2蛋白表达水平.结果:ox-LDL呈浓度依赖性抑制EPC增殖,诱导EPC凋亡;在加ox-LDL(10 mg/L)前加Mel干预,EPC增殖能力较ox-LDL组明显增强,细胞凋亡率明显降低;RT-PCR和免疫细胞化学法检测显示,ox-LDL组EPC的Bcl-2 mRNA和蛋白表达明显低于对照组,Mel组明显高于ox-LDL组(P＜0.01).结论:ox-LDL呈浓度依赖性诱导EPC凋亡、抑制EPC增殖,Mel能抑制ox-LDL的上述作用,其机制与上调Bcl-2表达有关.     

胎儿生长受限孕妇外周血及新生儿脐血中内皮祖细胞数量与功能的变化

目的:观察胎儿生长受限(FGR)孕妇外周血及新生儿脐血中内皮祖细胞(EPCs)数量与功能的变化.方法:选择FGR孕妇及新生儿15例和对照组健康孕妇及新生儿15例,密度梯度离心法收集外周血及脐血中单个核细胞(MNCs),接种在人纤维连接蛋白包被的培养板,诱导分化培养9 d后收集贴壁细胞进行细胞化学分析.激光共聚焦显微镜下...     

VEGF,b-FGF诱导人脐血单个核细胞向血管内皮祖细胞分化的研究

目的:研究VEGF, b-FGF诱导下人脐血单个核细胞向血管内皮祖细胞(EPCs)分化.方法:从新鲜脐血中用Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞,在加有VEGF,bFGF的M199培养基中培养,培养7 d,免疫组化(SABC法)和免疫荧光检测细胞表面抗原的表达.结果:人脐血血单个核细胞(MNCs)经体外VEGF, b-FGF的诱导分化,表达内皮祖细胞的表面标志KDR, CD1133和CD34.结论:人脐血单个核细胞在一定的培养条件下可诱导分化为内皮祖细胞.     

内皮祖细胞移植治疗的研究进展和临床应用前景

内皮损伤或功能缺失会导致宿主发生一系列的心血管疾病如动脉粥样硬化、心肌梗死、脑卒中、高血压 和周围血管疾病等。内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞,有早期内皮祖细胞和晚期内皮祖细胞两种类型,两者 的功能和表面标志不同。晚期内皮祖细胞主要表达CD133,CD31,KDR,CD144,CD34等表面标志,具有吞噬低密 度脂蛋白、结合荆豆凝集素和体内外形成血管的功能。内皮祖细胞不仅参与新血管的形成,与损伤内皮的修复也密 切相关。移植的内皮祖细胞能够迁移到血管损伤部位,修复损伤内皮细胞并能促进新血管的形成,在治疗心血管疾 病、缺血性疾病上有很大的应用前景。     

非对称性二甲基精氨酸对肉皮生长晕细胞生物学功能的影响

目的 观察非对称性二甲基精氦酸（ADMA）对内皮生长晕细胞（EOC）及其生物学功能的影响。方法分离脐血中单个核细胞,采用贴壁培养法培养EOC,以免疫细胞化学染色及荧光染色法鉴定其内皮细胞特性。以10μmol／LADMA及配制ADMA的溶剂（含0.5％DMSO的EBM-2培养基）,分别与第二代细胞孵育72h,检测并对比细胞的凋亡率、增殖能力及血管生成能力。结果免疫细胞染色后可见细胞表面Ⅷ因子相关抗原、CD34以及FIk-1均阳性表达,Dil-ac—LDL和FITC—UEA—Ⅰ荧光染色后可见双染色阳性细胞均为正在分化的EOC。ADMA组细胞凋亡率[（5.96±0．12）％]显著高于正常组[（1．48±0．03）％]（P〈0.01）,而细胞增值活性及血管生成活性（0．27、0.02、8．25、0.96）均明显弱于正常组（8.25、0．96、16.25、1.71）（P〈0．05或0.01）。结论ADMA能促进EOC凋亡,抑制其增值活性及血管生成活性,其对EOC细胞功能的损伤作用可能是通过氧化应激机制实现的。     

低温对人脐血内皮祖细胞的影响

目的将人脐血中分离培养出的内皮祖细胞进行低温保存和快速复苏,建立EPC细胞系,比较冻存前后细胞形态及生物学功能是否改变。方法采集人脐血,分离出单核细胞,对细胞进行冻存和复苏,测定内皮祖细胞增殖能力及黏附能力。结果内皮祖细胞经冻存和复苏后测得细胞的存活率为（84.17±4.02）%,细胞的形态学未见明显改变;与未冻存的细胞相比,刚复苏后即行增殖和黏附能力的检测,细胞的增殖和黏附能力有显著变化,P〈0.05;细胞复苏后继续培养48h行增殖和黏附能力检测,两者未见明显差异,P〉0.05。结论对低温保存后复苏的EPC,立即行增殖和黏附能力检测其能力均降低,复苏后继续培养48h再次检测未见明显差异。     

人脐带血内皮祖细胞的分离、培养与鉴定

目的:分离、培养、鉴定人脐带血内皮祖细胞（EPCs）,为获取大量血管内皮祖细胞提供方法。方法:脐带血采集后,采用6%羟乙基淀粉沉降法和密度梯度离心法获取脐带血单核细胞,再将单核细胞接种于铺设有纤维连接蛋白的培养瓶中,经过体外诱导、培养、分化,完成传代扩增;通过免疫组织化学、免疫荧光染色、流式细胞术对细胞进行鉴定。结果:细胞培养第5天呈现集落样生长,单个细胞呈圆形或梭形,2周后细胞长满瓶底,呈鹅卵石样外观。免疫组织化学检测显示,CD31兔抗人单克隆抗体阳性率91.5%,Anti-Von Willebrand factor antibody（vWF）相关抗原兔抗人单克隆抗体的阳性表达率为72.4%;细胞免疫荧光染色检测显示,吞噬Dil标记的乙酰低密度脂蛋白（+）,发出红色荧光;结合FITC标记的荆豆凝集素Ⅰ（+）,发出绿色荧光;双染（+）,呈黄色荧光。流式细胞术检测CD34阳性率93%,血管内皮细胞生长因子受体2阳性率88.5%,CD133阳性率84.8%。结论:从脐带血中可获取大量CD34+、VEGFR-2+及CD133+血管内皮祖细胞。     

脐带血中血管内皮前期细胞的分离

目的：从脐带血中分离单个核细胞以获得血管内皮前期细胞,并观察其生物学行为。方法：用密度为1.077的淋巴细胞分离液分离脐带血中单个核细胞,种植在铺有纤维连接素的培养板中,3 d后去除未附着细胞,观察附着细胞的生长情况,采用免疫组化法进行鉴定。结果：单个核细胞培养3 d后可见大量的附着细胞和少量梭形细胞,梭形细胞数量在第7天时达到高峰。附着细胞对第八因子相关抗原呈阳性反应。结论：在纤维连接素上培养来源于脐带血的单个核细胞可获得血管内皮前期细胞。     

人脐带间充质干细胞培养上清液对甲状腺乳头状癌细胞诱导人脐静脉内皮细胞血管形成的影响

目的: 探讨人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs）对甲状腺乳头状癌细胞TPC-1诱导人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVEC）血管形成的作用。方法: 使用不同浓度的hUCMSCs培养上清液（hUCMSC-CM）刺激甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1;采用基质胶小管形成实验检测经hUCMSC-CM作用后的TPC-1细胞对HUVEC血管形成的影响;CCK-8法检测hUCMSC-CM对TPC-1细胞增殖能力的影响;实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法、酶联免疫吸附实验（ELISA）分别检测经hUCMSC-CM作用后的TPC-1细胞中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的mRNA和蛋白表达及其培养上清液中VEGF的含量。结果： 与对照组相比,hUCMSC-CM可显著抑制TPC-1细胞的增殖（P<0.05和P<0.01）;经hUCMSC-CM刺激后的TPC-1细胞诱导HUVEC血管形成能力显著下调（P<0.001）,且TPC-1细胞中VEGF的mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P<0.001）,其培养上清液中VEGF含量显著降低（P<0.05）。结论： hUCMSC-CM可显著下调TPC-1细胞中VEGF的表达及分泌,抑制TPC-1细胞诱导HUVEC血管形成的能力。