环介导等温扩增技术在致病菌检测中的应用

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术是近10年来发展起来的具有简便、快速、灵敏度高、特异性强等优点的新的恒温核酸扩增技术,已被应用于致病菌检测的研究。LAMP技术需针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物,并采用链置换型DNA聚合酶,操作步骤少,不需要聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术复杂的设备。本文就LAMP技术在致病菌检测中的应用作一综述。     

环介导等温扩增技术(LAMP)检测棘球绦虫感染犬粪DNA的研究

目的 建立快速检测棘球绦虫感染犬粪便的DNA检测方法一环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification.LAMP).方法 针对细粒棘球绦虫线粒体DNA Cox1基因6个位点特异性的设计4条LAMP引物,利用LAMP法和普通PCR方法同时检测棘球绦虫、肥胖带绦虫以及犬肠道内...     

环介导恒温扩增技术及其在病原检测中的应用

环介导等温扩增(LAMP)技术是一种崭新的核酸扩增方法。它使用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶,针对靶基因上6个不同区域设计4种引物,在恒温条件下进行核酸扩增,不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳和紫外观察等过程。具有简便、快速、特异、敏感的特点,可用于真核生物、原核生物等多种生物的DNA/RNA扩增。本文对LAMP技术基本原理、特点、在病原检测中的应用以及在单核苷酸多态性基因型检测中的应用等进行了综述。     

检测肠道病毒71型RT-LAMP技术的建立及其应用

目的为肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)感染的快速诊断建立一种简捷、敏感、特异的基因检测方法,即逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT LAMP)。方法针对EV71 VP1基因的8个区域设计6条特异性引物,建立检测该靶序列的RT LAMP方法,对其特异性及敏感性进行了验证;并对手足口病患者标本进行检测,并与RT PCR及Real time PCR方法进行了比较。结果利用RT LAMP方法能成功检测到EV71 VP1基因区,等温条件下60min内即可完成检测,该方法简便快捷、敏感性高、特异性好;其阳性率高于RT PCR方法（P<0.05）,与Real time PCR结果呈现很好的一致性（P>0.05）。结论RT LAMP方法具有灵敏度高,特异性强,操作过程简捷快速,无需特复杂仪器等优点。适用于EV71感染的快速检测及分子流行病学的监测,具有很好的开发应用前景。     

等温扩增法用于孕妇B族链球菌感染筛查的研究

目的建立可用于快速筛查孕妇B族链球菌(GBS)的等温扩增法。方法培养GBS并提取基因组DNA。根据其cfb基因设计LAMP(环介导等温扩增)和RPA(重组酶聚合酶扩增)反应引物,进行目的基因扩增。采集临床标本50份,同时用两种方法进行检测,评价方法的特异性和敏感性。结果 LAMP可在45min完成基因扩增,RPA法可在15min完成目的基因的扩增。二者均具有高度敏感性和特异性,最低检出浓度均为0.01ng DNA/μl。检测50份临床标本LAMP法4份阳性,RRP法5份阳性(其中1份假阳性)。结论 LAMP和RPA均不依赖特定仪器,在恒温条件下即可完成目的基因扩增,以LAMP方法操作更简单、快速,特异性更高,可用于女性孕期GBS感染筛查。     

环介导同温扩增检测全血日本血吸虫DNA的研究

目的建立一种检测全血标本中日本血吸虫DNA的环介导同温扩增(LAMP)方法。方法选择日本血吸虫基因组重复序列DNA SjR2(839~1 138 bp、563~764 bp)、SjSH7(204~399 bp)和Sj-nonLTR1(1 678~1 877 bp)的4段DNA序列作为扩增片段,根据LAMP原理设计合成4组引物,通过对此4组引物用于DNA LAMP扩增的敏感性和特异性进行比较分析和检测条件的优化,建立特异、敏感,可用于检测全血日本血吸虫DNA的LAMP方法。应用此方法对10只日本血吸虫感染前及感染后不同时间同一家兔的配对全血DNA进行扩增,观察其应用价值。结果 4组引物中,以日本血吸虫SjR2(839~1 138 bp)作为扩增靶片段,可特异性扩增日本血吸虫中国大陆株(检出限为10-4ngDNA)、菲律宾株和曼氏血吸虫的基因组DNA,人全血基因组DNA、华支睾吸虫基因组DNA、疟原虫基因组DNA不能扩增。以Sj-nonLTR1(1 678~1 877 bp)为靶片段,LAMP扩增无特异性。以SjR2(563~764 bp)和SjSH7(204~399bp)为靶片段,可特异性扩增日本血吸虫中国大陆株基因组DNA(检出限为10-6ng和10-3ng)及菲律宾株基因组DNA,人全血基因组DNA、华支睾吸虫基因组DNA、曼氏血吸虫基因组DNA和疟原虫基因组DNA不能扩增。用SjR2(839~1 138 bp)引物对10只日本血吸虫感染兔不同时间的配对全血标本进行扩增,感染前血样均为阴性,感染后连续5周全血基因组DNA的浓缩标本均为阳性,非浓缩标本部分阳性。结论本研究建立了检测兔全血日本血吸虫兔基因组DNA的LAMP方法。该方法对浓缩DNA标本的检出效率高于非浓缩标本,具有血吸虫感染早期诊断价值。     

环介导等温扩增技术及其在寄生虫学研究中的应用

环介导等温扩增(LAMP)技术是利用2对特殊设计的引物,一种具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下特异、高效地扩增DNA的新技术,扩增产物为一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物,电泳图谱呈阶梯式带状分布,反应伴有白色的副产物焦磷酸镁沉淀产生,可通过肉眼定性判断反应结果。作为一种新的核酸扩增技术,已被应用于疟疾、血吸虫等寄生虫的研究中。LAMP方法敏感、特异,简便,在寄生虫学研究中有广阔的应用前景。     

淡水鱼华支睾吸虫囊蚴 LAMP 检测方法的建立

目的 建立一种高效灵敏的环介导等温扩增(LAMP)方法检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴。 方法 以华支睾吸虫 ITS2 基因序列为靶序列,合成 Cs-1、Cs-2、Cs-3 三组 LAMP 引物体系。 以华支睾吸虫囊蚴 DNA 样本为模板,日本血吸虫成虫、带绦虫成虫、蛔虫虫卵及其他吸虫囊蚴 DNA 样本为参考,比较三组引物体系的特异度;以不同浓度的华支睾吸虫成虫基因组 DNA 为模板,比较三组引物体系的灵敏度;用 LAMP 法及 PCR 法平行检测 16 份华支睾吸虫囊蚴样本和 23 份其他吸虫囊蚴样本,评价 LAMP 法的敏感性和特异性。 结果 三组引物体系的灵敏度及特异度以 Cs-3 为最优,以其建立的 LAMP 法反应体系,检测华支睾吸虫成虫 DNA 的最低检出浓度可达到 3. 33×10^-4ng / μL,敏感性和特异性与 PCR 法一致,均为 100%。 结论 成功建立了一种可用于检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的 LAMP 方法,为淡水鱼寄生虫病监测工作提供了便捷高效的检测手段。     

环介导等温扩增技术检测牛源隐孢子虫的研究

目的 用环介导等温扩增技术检测牛源隐孢子虫.方法 提取牛粪中隐孢子虫卵囊DNA.根据隐孢子虫18S rRNA序列及环介导等温扩增(100p-mediated isothermal amplification,LAMP)技术的原理,设计4条隐孢子虫特异引物,利用LAMP检测牛粪中隐孢子虫卵囊DNA和蓝氏贾第鞭毛虫DNA,以正常牛粪DNA为阴性对照.LAMP产物经SYBR Green I显色及电泳后观察结果,绿色判为阳性,棕色判为阴性,对LAMP产物进行电泳分析,观察其特征条带的情况.结果隐孢子虫卵囊DNA检测管经显色后时不再呈绿色,阴性对照及蓝氏贾第鞭毛虫DNA呈棕色.隐孢子虫LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,阴性对照及蓝氏贾第鞭毛虫DNA无扩增产物.结论 LAMP方法敏感、特异、简便,可用于检测牛粪中的隐孢子虫.     

环介导等温扩增技术检测牛源隐孢子虫的研究

目的 用环介导等温扩增技术检测牛源隐孢子虫.方法 提取牛粪中隐孢子虫卵囊DNA.根据隐孢子虫18S rRNA序列及环介导等温扩增(100p-mediated isothermal amplification,LAMP)技术的原理,设计4条隐孢子虫特异引物,利用LAMP检测牛粪中隐孢子虫卵囊DNA和蓝氏贾第鞭毛虫DNA,以正常牛粪DNA为阴性对照.LAMP产物经SYBR Green I显色及电泳后观察结果,绿色判为阳性,棕色判为阴性,对LAMP产物进行电泳分析,观察其特征条带的情况.结果隐孢子虫卵囊DNA检测管经显色后时不再呈绿色,阴性对照及蓝氏贾第鞭毛虫DNA呈棕色.隐孢子虫LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,阴性对照及蓝氏贾第鞭毛虫DNA无扩增产物.结论 LAMP方法敏感、特异、简便,可用于检测牛粪中的隐孢子虫.     

环介导恒温扩增(LAMP)技术及其在寄生虫检测中的应用

近年来开发出一种新的恒温核酸扩增方法,即环介导恒温扩增(loop-mediated isithermal amplification,LAMP)法.LAMP技术具有简便、快速、高效、特异性强等优点,尤其适用于人类和动物疾病的检测.该文简要介绍了LAMP技术的原理,并对其在检测寄生虫如锥虫、疟原虫、巴贝虫、隐孢子虫和水生动物孢子虫等方面的应用进行综述.     

Detection of Haemophilus influenzae by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of the outer membrane protein P6 gene

It is difficult and time-consuming to distinguish Haemophilus influenzae from the genotypically similar Haemophilus parainfluenzae, which is a commensal of the human oral cavity. The novel nucleic acid amplification technique of loop-mediated isothermal amplification (LAMP), which amplifies DNA under isothermal conditions (63 degrees C) with high specificity, efficiency, and rapidity, was evaluated for H. influenzae detection. A H. influenzae-specific LAMP primer set was designed for the outer membrane protein P6 gene. Primer set specificity was validated using 4 Haemophilus spp. and 13 other species. Within 60 min, LAMP detected 100 or more copies of purified DNA with a sensitivity that was 10-fold higher than that of conventional PCR. This method can be used to differentiate H. influenzae from H. parainfluenzae strains. Thus, LAMP may represent a sensitive and reliable means of diagnosing H. influenzae infection.     

环介导等温扩增技术用于肠杆菌检测的研究现状

肠杆菌是肠道疾病的一种病原体。环介导等温扩增技术（LAMP）是一种新的核酸扩增技术,具有敏感性高、特异性强和简便快速等优点,可用于肠杆菌的快速诊断。本文拟就LAMP检测肠杆菌的研究现状进行综述。     

简单异尖线虫环介导等温扩增(LAMP)鉴定方法的建立和应用

目的 建立快速鉴定简单异尖线虫的环介导等温扩增方法(LAMP). 方法 根据简单异尖线虫ITS保守区域的基因序列设计特异性引物进行LAMP扩增,对反应体系中dNTPs、Mg2+、Betaine和2对引物的浓度,以及反应温度、反应时间等进行优化;在优化后的体系下,将10倍比稀释的简单异尖线虫ITS序列重组质粒进行灵敏性试验;用典型异尖线虫、对盲囊线虫、针蛔线虫对该方法进行特异性试验;并用7份简单异尖线虫样品进行验证. 结果 LAMP的最佳反应体系为0.8 mmoL/L dNTPs、10 mmol/L Mg2+、0.8 mmoL/L Betaine、0.2μmol/L外引物、1.6μmoL/L内引物、8 U Bst DNA聚合酶大片段以及适量的模板,反应温度为62℃,反应时间为60 min;检测简单异尖线虫的灵敏度达到10拷贝/μl,且对典型异尖线虫、对盲囊线虫、针蛔线虫无交叉反应;7份简单异尖线虫样品经LAMP验证均为阳性.结论 LAMP方法灵敏性高、特异性强,并且操作简便、成本低,是鉴定简单异尖线虫的有效手段.     

环介导等温扩增技术检测牛源隐孢子虫的研究

目的 用环介导等温扩增技术检测牛源隐孢子虫.方法 提取牛粪中隐孢子虫卵囊DNA.根据隐孢子虫18S rRNA序列及环介导等温扩增(100p-mediated isothermal amplification,LAMP)技术的原理,设计4条隐孢子虫特异引物,利用LAMP检测牛粪中隐孢子虫卵囊DNA和蓝氏贾第鞭毛虫DNA,以正常牛粪DNA为阴性对照.LAMP产物经SYBR Green I显色及电泳后观察结果,绿色判为阳性,棕色判为阴性,对LAMP产物进行电泳分析,观察其特征条带的情况.结果隐孢子虫卵囊DNA检测管经显色后时不再呈绿色,阴性对照及蓝氏贾第鞭毛虫DNA呈棕色.隐孢子虫LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,阴性对照及蓝氏贾第鞭毛虫DNA无扩增产物.结论 LAMP方法敏感、特异、简便,可用于检测牛粪中的隐孢子虫.