Mda7基因增强放射线抑制前列腺癌PC-3细胞生长的作用

目的 检测Mda7基因联合放射线抑制前列腺癌PC-3细胞生长的作用.方法 PC-3细胞接受不同剂量X-射线照射,流式细胞术检测细胞凋亡;pcDNA-Mda7质粒转染PC-3细胞,流式细胞术检测细胞凋亡,集落形成法检测细胞生长;pcDNA-Mda7质粒与X-射线联合应用,流式细胞术检测细胞凋亡.结果 PC-3细胞凋亡率随X-射线照射剂量升高而增高,在10 Gy及以上剂量照射细胞凋亡率明显高于对照组(P＜0.01);pcD-NA-Mda7质粒转染PC-3细胞,细胞凋亡率明显增高(P ＜0.001),集落形成百分数明显降低(P＜0.001);pcDNA-Mda7质粒与X-射线联合应用效果明显好于单纯照射组和单纯转染组(P＜0.01).结论 PC-3细胞具有辐射抗性,pcDNA-Mda7质粒转染可以显著抑制PC-3细胞生长,pcDNA-Mda7质粒与X-射线联合应用效果好于单纯照射和单纯基因作用.     

靶向survivin的RNAi联合X线照射对肺腺癌A549细胞周期、凋亡及增殖的影响

目的 构建靶向生存素(survivin)基因的RNA干扰(RNAi)载体,观察其联合X射线照射对肺腺癌A549细胞周期、凋亡及增殖影响.方法 根据GenBank中survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰survivin的重组干扰质粒pGenesil2-survivin.酶切、测序鉴定正确后,干扰质粒经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞,联合5 Gy射线照射,应用PI单染、流式细胞仪检测细胞周期与凋亡变化,MTT检测细胞增殖的变化.结果 酶切和测序结果显示,载体构建正确;转染空载体pGenesil2对细胞G0/G1期、S期及凋亡,增殖能力影响不大,降低了G2/M期(P＜0.05);而干扰质粒pGenesil2-survivin能延长G0/G1期,缩短S期,诱导细胞凋亡增加,降低细胞增殖能力(P＜0.05);5 Gy照射对细胞周期影响不大,增加细胞凋亡,降低增殖能力(P＜0.05);转染pGenesil2-survivin后,进行5 Gy X射线照射,延长G0/G1期,缩短S期,诱导细胞凋亡增加,降低细胞增殖能力(P＜0.05,P＜0.01).结论 靶向survivin的RNAi可延长G0/G1期,缩短S期,增加细胞凋亡,降低细胞增殖能力,X射线照射能够增强该质粒的作用.     

Smac/DIABLO过表达对人结肠癌细胞凋亡的影响

Smac／DIABLO是一种线粒体促凋亡蛋白，研究表明其在结肠癌细胞中表达降低。目的：研究Smac／DIABLO对人结肠癌细胞生长的影响及其可能的促凋亡机制。方法：将pcDNA3.1-Smac质粒或pcDNA3.1空质粒以脂质体转染人人结肠癌细胞株LoVo,以未转染细胞作为空白对照。以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Smac mRNA表达，蛋白质印迹法检测Smac蛋白表达，Hoechst33258染色观察凋亡细胞核形态学变化，Annexin V-FITC／PI双染流式细胞仪分析检测细胞凋亡率,PI染色流式细胞仪分析检测细胞周期。Caspase-3分光光度法检测试剂盒检测Caspase-3活性。结果：pcDNA3.1-Smac质粒转染12h后，kVo细胞Smac mRNA表达增加；转染48h后，Smac蛋白表达增加。转染48h后,Smac组LoVo细胞呈现明显凋亡细胞核形态学特征。凋亡率显著高于hVo细胞组和空质粒组，GO／G1期细胞增多,Caspase-3活性亦显著高于空质粒组（P〈0．05）。结论：Smac／DIABLO可激活caspase-3途径，抑制人结肠癌细胞生长,促进细胞凋亡。使细胞周期阻滞于G0／G1期。     

Cyclin G_2表达载体的构建及其对乳腺癌MCF-7细胞的作用

目的构建包含Cyclin G2基因的真核表达载体,探讨其对乳腺癌MCF-7细胞体外增殖的作用。方法运用RT-PCR和基因克隆技术构建pDsRed2-Cyclin G2重组质粒,脂质体法转染至MCF-7细胞中,荧光显微镜下观察其蛋白的表达及定位;AnnexinⅤ-FITC染色流式细胞术检测细胞凋亡率。结果成功构建了pDsRed2-Cyclin G2融合表达质粒,转染MCF-7细胞后散在分布于细胞质和细胞,核转染重组质粒的MCF-7细胞凋亡率明显增高（P〈0.01）。结论 Cyclin G2重组质粒转染至MCF-7细胞后能有效促进细胞凋亡。     

Smac基因过表达联合顺铂对SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨Smac基因过表达联合顺铂对肝癌细胞增殖和凋亡的影响.方法 采用脂质体介导的转染方法 ,将重组质粒pcDNA3.1+hSmac导入人肝癌细胞株SMMC-7721中,采用Western blot和流式细胞术检测转染前后Smac蛋白表达情况.转染24 h后分别加入终浓度为5、15、25 μg/ml的顺铂诱导细胞凋亡.采用四甲基偶氮唑盐比色法检测癌细胞的增殖抑制作用,吖啶橙-溴化乙锭荧光染色法和膜联蛋白V/碘化丙啶双染标记流式细胞术检测细胞凋亡. 结果 Westernblot和流式细胞术检测结果证实转染后Smac蛋白表达明显增加(P＜0.01).与空白对照相比,Smac基因过表达可抑制癌细胞增殖,促进凋亡(P＜0.01).而且给予顺铂处理后,与空白对照组相比,细胞生长抑制率随剂量增加而显著上升,且转染Smac的细胞生长抑制率较相应未转染Smac的细胞明显升高(P＜0.01).吖啶橙-溴化乙锭荧光染色法和流式细胞术检测显示,转染Smac加顺铂处理组较单纯顺铂处理组细胞凋亡明显增加,差异具有统计学意义(P＜0.01).这表明Smac基因过表达可增强顺铂对肝癌细胞的增殖抑制和凋亡促进作用. 结论 促凋亡基因Smac可在肝癌细胞中过表达,抑制癌细胞的增殖和促进凋亡;而且过表达的Smac基因可增强癌细胞对化疗药物顺铂的敏感性,这为研究Smac在癌细胞凋亡过程中的调控作用以及肝癌化学治疗效果的改善提供了实验基础.     

放疗对人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡的影响

目的探讨放疗对人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡的影响。方法采用6MV-X射线照射细胞,提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳,检测DNA-LADDER的形成,Western印迹方法检测细胞凋亡蛋白Caspase-3的表达。结果照射后48h,2、4、6Gy剂量组出现明显DNA降解（梯形结构）,但对照组及8、10Gy剂量组无“梯形结构出现”。Western印迹方法分析发现照射后48h,2、4、6Gy剂量组HepG2细胞Caspase-3蛋白表达明显增高,与假照射对照组（0Gy）比较,差异具有显著性（P〈0.05,P〈0.01）。结论X射线能在体外诱导HepG2细胞凋亡,其机制可能是通过激活Caspase-3蛋白表达实现的。     

Cx43基因修饰对大肠癌细胞的放射增敏作用

目的通过重组质粒pBudCE4.1-Cx43转染人大肠癌SW480细胞,探讨Cx43基因修饰对大肠癌SW480放射增敏性的影响。方法用Lipofectamine TM2000转染的方法将重组表达质粒pBudCE4.1-Cx43转染入大肠癌SW480细胞,通过RT-PCR、Western印迹检测Cx43在转染后的mRNA和蛋白的表达情况,转染48 h后,分别测定各个处理组细胞Cx43 mRNA水平及其蛋白表达水平,划痕染料示踪法检测细胞间通讯功能。各组细胞分别接受不同剂量6 MV X射线照射,通过集落形成实验检测细胞放射敏感性,流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。每组实验重复3次。通过构建人大肠癌裸鼠移植瘤模型,观察10 Gy照射后肿瘤生长状况,并检测其Bcl-2基因活性。结果 Cx43 mRNA和蛋白表达,转染组与阴性对照组和空白组相比显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。细胞传递的荧光强度,转染组与阴性对照组和空白组相比亦显著升高,差异有统计学意义(P0.01),与阴性组和空白对照相比,经过射线放射处理后,转染组细胞的增殖能力显著降低(P0.05);经过0～8 Gy射线处理后细胞克隆形成的能力明显下降(P0.05);10 Gy照后,转染组凋亡率为(19.86±1.53)%,明显高于阴性对照组[(6.75±1.20)%]和空白组[(6.90±1.17)%,P0.05];同时射线处理后移植瘤生长受到显著抑制作用;移植瘤细胞的Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P0.05)。结论转染Cx43基因能够提高人大肠癌SW480细胞对X射线的敏感性,概系因降低了细胞Bcl-2的基因表达使然。     

siRNA抑制PTTG表达对人结肠癌LoVo细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

目的 探讨siRNA抑制人垂体瘤转化基因PTTG表达对人结肠癌LoVo细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响.方法 LoVo细胞分为3组:正常细胞对照组、Lipo2000+ pGenesil-2.1 HK组(HK阴性对照组)、Lipo2000+ pGenesil-2.1-PTTG siRNA组.应用Western印迹法检测转染48 h后各组细胞PTTG蛋白表达,MTT法检测转染24、48和72 h后各组细胞增殖情况,流式细胞术检测转染48 h后各组LoVo细胞凋亡和细胞周期情况.结果 pGenesil-2.1-PTTG siRNA质粒转染LoVo细胞后PTTG蛋白表达明显低于正常和HK阴性对照组.MTT比色分析法显示,pGenesil-2.1-PTTGsiRNA质粒转染LoVo细胞后,在24、48和72 h细胞增殖能力均显著低于正常对照组和阴性对照HK组(均P＜0.05).流式细胞术检测结果显示,与对照组相比,转染pGenesil-2.1 PTTG siRNA质粒后LoVo细胞Go/G1期细胞百分率均高于正常和阴性HK对照组(均P＜0.01),而S期细胞百分率均低于正常和阴性HK对照组(均P＜0.01);Annexin V-PI双染结果显示,转染pGenesil-2.1 PTTG siRNA质粒后LoVo细胞凋亡百分率高于正常和阴性HK对照组(均P＜0.01).结论 pGenesil-2.1-PTTG siRNA质粒可明显抑制LoVo细胞PTTG蛋白表达,并进而抑制LoVo细胞增殖,促进其凋亡,使细胞阻滞于G0/G1期.     

Smoothened shRNA载体的构建及其对乳腺癌细胞增殖的影响

目的构建并筛选Smoothened（SMO）基因的RNAi表达质粒,了解Hedgehog信号通路影响乳腺癌细胞增殖的作用机制。方法以脂质体Lipofectamine^TM2000介导转染乳腺癌MCF-7细胞。转染后48 h,采用实时定量RT-PCR技术检测转染细胞中SMO基因mRNA的转录水平,筛选有效的SMO RNAi质粒,Western blot检测SMO蛋白在乳腺癌MCF-7细胞中的表达,CCK-8法比较转染前后乳腺癌细胞增殖变化,实时定量RT-PCR检测SMO短发夹状RNA（shRNA）对cyclinD1 mRNA表达的影响。结果 4个SMO shRNA表达载体SMO shRNA-1、SMO shRNA-2、SMO shRNA-3和SMO shRNA-4经测序鉴定证明插入正确。转染48 h后,与MOCK组相比,SMO shRNA-1、SMOshRNA-3、SMO shRNA-4组SMO mRNA表达量均下降（P=0.015、0.002、0.000）,其中转染SMO shRNA-4的MCF-7细胞中SMO mRNA表达水平低于SMO shRNA-1、SMO shRNA-2、SMO shRNA-3组（P=0.007、0.000、0.046）。SMOshRNA-4干扰抑制效率为87%。Western blot可检测到SMO在MCF-7中的表达,干扰片段SMO shRNA-4的抑制效果较好。转染SMO shRNA-4的MCF-7细胞增殖受到明显抑制（P〈0.01）,转染SMO shRNA后cyclinD1 mRNA表达下降（P=0.000）。结论已成功构建并筛选出SMO基因的RNAi表达质粒,SMO shRNA对乳腺癌细胞增殖有明显的抑制作用,Hedgehog信号通路可通过活化cyclinD1诱导细胞恶性增殖。     

HIF-1α对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响及其机制探讨

目的 观察缺氧诱导因子1α（HIF-1α）基因对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响,并探讨其可能的机制.方法 构建并筛选HIF-1 α基因的RNAi表达质粒,以脂质体LipofectamineTM 2000介导转染MCF-7细胞.转染后48h,采用实时定量RT-PCR技术检测转染细胞中HIF-1α mRNA的转录水平,筛选有效的HIF-1 αRNAi质粒;CCK-8法比较转染前后乳腺癌细胞增殖变化,实时定量RT-PCR检测顺滑蛋白（SMO）mRNA表达.结果 成功构建含HIF-1α短发夹状RNA（shRNA）1～4的RNAi表达质粒,其中HIF-1 αshRNA-4干扰抑制效率为74％,干扰效果最强（P均＜0.05）.HIF-1 αshRNA-4干扰48、72、96 h后,MCF-7细胞的生长抑制率明显升高（P均＜0.05）.HIF-1αshRNA-4转染后MCF-7细胞SMO mRNA的相对表达量为0.56 ±0.06,低于转染前的1.07 ±0.16（P ＜0.05）.结论 HIF-1α表达可促进乳腺癌细胞增殖,可能与其参与调控SMO的表达有关.