约氏疟原虫卵囊、唾液腺子孢子差异表达蛋白的二维电泳-质谱分析

目的分离和鉴定约氏疟原虫卵囊、唾液腺子孢子差异表达蛋白,找出疟原虫子孢子侵入相关蛋白。方法采用二维蛋白电泳技术分离感染和未感染约氏疟原虫的斯氏按蚊中肠和唾液腺差异表达蛋白,考马斯亮蓝染色,BIORAD凝胶扫描仪和PDQUest图象软件分析,差异蛋白点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定其肽质指纹图谱,用Mascot在相应的查询条件下搜索NCBInr数据库。结果获得了分辨率和重复性均较好的一维和二维蛋白图谱。凝胶扫描结果发现未感染蚊中肠有135个蛋白点,感染蚊中肠有158个蛋白点,相同有107个,pI偏酸性。未感染蚊唾液腺有178个蛋白点,感染蚊唾液腺有201个蛋白点,相同有167个,pI分布较均匀。选择7个差异蛋白点进行分析,得到了6个蛋白肽质指纹图谱,查询数据库初步鉴定疟原虫来源的蛋白质有5个,另1个来源于蚊组织。疟原虫来源蛋白为一些表面蛋白、代谢和运动相关的蛋白等。结论建立了一种较好的疟原虫子孢子蛋白分离和鉴定方法,并证明约氏疟原虫唾液腺子孢子表达大量差异表达蛋白,部分可能与其识别、侵入宿主细胞有关。     

约氏疟原虫卵囊、唾液腺子孢子差异表达蛋白的二维电泳—质谱分析

目的分离和鉴定约氏疟原虫卵囊、唾液腺子孢子差异表达蛋白，找出疟原虫子孢子侵入相关蛋白。方法采用二维蛋白电泳技术分离感染和未感染约氏疟原虫的斯氏按蚊中肠和唾液腺差异表达蛋白，考马斯亮蓝染色，BIOIRAD凝胶扫描仪和PDQUest图象软件分析，差异蛋白点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定其肽质指纹图谱，用Mascot在相应的查询条件下搜索NCBInr数据库。结果获得了分辨率和重复性均较好的一维和二维蛋白图谱。凝胶扫描结果发现未感染蚊中肠有135个蛋白点，感染蚊中肠有158个蛋白点，相同有107个，pI偏酸性。未感染蚊唾液腺有178个蛋白点，感染蚊唾液腺有201个蛋白点，相同有167个，pI分布较均匀。选择7个差异蛋白点进行分析，得到了6个蛋白肽质指纹图谱，查询数据库初步鉴定疟原虫来源的蛋白质有5个，另1个来源于蚊组织。疟原虫来源蛋白为一些表面蛋白、代谢和运动相关的蛋白等。结论建立了一种较好的疟原虫子孢子蛋白分离和鉴定方法，并证明约氏疟原虫唾液腺子孢子表达大量差异表达蛋白，部分可能与其识别、侵入宿主细胞有关。     

由约氏疟原虫、夏氏疟原虫和恶性疟原虫血液期裂殖体合成的高分子量蛋白质的血清交叉反应

业已发现,鼠类、猿猴和人类疟原虫的血液期裂殖体所合成的高分子量蛋白,能使宿主产生保护性免疫应答。自约氏疟原虫提取的230,000MW蛋白质,可使免疫小鼠产生抵抗攻击感染的能力。抗夏氏疟原虫250,000MW蛋白质的单克隆抗体(MAbs)输给小鼠后,能抑制感染小鼠的原虫血症。恶性疟原虫合成的195,000MW蛋白质,能与免疫血清呈强反应。本文在于鉴定上述3种高分子量蛋白质的血清学关系。     

约氏疟原虫与伯氏疟原虫侵入期抗原的初步研究

目的　用针对鼠约氏疟原虫(Plasmodiumyoelii)侵入期的8种单克隆抗体,对约氏疟原虫和伯氏疟原虫(P.berghei)侵入期即动合子、裂殖子和子孢子棒状体和表面抗原检测分析。　方法　间接免疫荧光实验(IFA)对各侵入期抗原进行亚细胞结构定位,SDSPAGE及Western印迹对两种鼠疟原虫的不同侵入期进行抗原组分分析。　结果　经上述两种方法检测发现,顶端复合体抗原成分复杂,约氏疟原虫和伯氏疟原虫的棒状体有共同的抗原表位,约氏疟原虫的动合子与其自身的裂殖子有类似成分,也有各自独特的抗原。两种鼠疟原虫动合子抗原有类似成分。约氏疟原虫的子孢子具有与裂殖子、动合子不同的抗原成分。　结论　疟原虫侵入期棒状体和表面抗原在同一虫种的不同侵入期和不同虫种中有共同的抗原表位,也有各自的独特组分。     

大劣按蚊感染约氏疟原虫血淋巴相关蛋白的筛选和鉴定

目的 筛选并鉴定大劣按蚊感染约氏疟原虫后血淋巴的相关蛋白．为进一步的功能研究和蚊先天性免疫研究奠定基础。方法 以大劣按蚊一约氏疟原虫为实验模型，利用二维电泳技术分离和比较饱吸约氏疟原虫感染的鼠血和正常鼠血后24h的大劣按蚊血淋巴蛋白，获得差异蛋白．并对差异蛋白进行N端氨基酸测序和生物信息学分析,从而推测差异蛋白的功能。结果 获得清晰二维电泳图，并筛选获得37个差异蛋白点。对其中比较明显的差异蛋白1进行氨基酸测序后发现，该蛋白可能为一翻译延伸因子。结论 成功分离和筛选获得了大劣按蚊感染约氏疟原虫血淋巴相关蛋白。并进行了初步鉴定。     

抗环子孢子蛋白保守II~ 区单克隆抗体的制备及鉴定

目的　获得针对恶性疟原虫环子孢子蛋白 (CSP)保守II 区 (RegionII )的单克隆抗体。　方法　采用恶性疟原虫保守II 区十二肽 (EWSPCSVTCGNG)免疫BALB/c小鼠 ,经融合 ,ELISA 3次筛选 ,获得 3株分泌针对保守II 区单克隆抗体的杂交瘤细胞株。　结果　ELISA检测结果显示单抗能与重组表达的恶性疟原虫CSP片段及天然CSP特异性反应。间接荧光抗体检测显示 ,单抗不仅能识别恶性疟原虫子孢子 ,也能识别约氏疟原虫子孢子。　结论　成功地获得了针对恶性疟原虫CSP保守II 区的单克隆抗体     

用单克隆抗体分析约氏疟原虫抗原的研究 Ⅰ.约氏疟原虫红内期与人疟原虫的共同抗原

用粗提的约氏疟裂殖子免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp 2/0瘤细胞融合,获得13株分泌抗约氏疟红内期单克隆抗体的杂交瘤。这些McAb分别属于小鼠:IgG_1,IgG_(2a),IgG_(2b)及IgG_3亚类。据免疫荧光观察,13株McAb可分为4类:1.与红内期各发育阶段的原虫能出现荧光反应;2.针对晚期滋养体及裂殖体;3.抗裂殖体及裂殖子;4.单纯抗裂殖子。有5株McAb与人疟原虫发生荧光反应,其中4株只与恶性疟原虫交叉,M_(26-32)则不仅与恶性疟原虫且与间日疟原虫均有强的交叉反应,,表明约氏疟与人的两种疟原虫间有共同抗原,并提示恶性疟原虫与间日疟原虫间也有共同抗原。共同抗原在不同种间的分布和含量不尽相同。用未经固定的感染红细胞加McAb作间接荧光试验,在感染红细胞表面未观察到荧光反应。     

感染红细胞内的疟原虫外抗原

用伯氏疟原虫单克隆抗体已能证实在感染红细胞内、疟原虫外的3种寄生虫抗原。用免疫荧光试验检测,许多疟疾抗原展示同样类型。本报告进一步对感染红细胞伯氏疟原虫释出的抗原进行鉴定以及对其种、株分布阶     

特异性单克隆IgM抗体是鼠疟疫苗的有效佐剂

用鼠疟模型实验表明,母体抗疟原虫的IgG类抗体可被动转移给子代,对初次感染有一定程度的保护性,但这种抗体可抑制疫苗产生获得性免疫力。本文报道用IgM类特异性单克隆抗体增强鼠疟血液期疫苗的免疫应答。以感染约氏疟原虫的BALB/c小鼠脾细胞与P3-X63-Ag8.653骨髓瘤细胞加聚乙二醇融合,获得对约氏疟原虫特异的IgM类单克隆抗体。对正常BALB/c×C57BL/6小鼠的子一代进行单次静脉注射5×10~7福尔马林固定的约氏疟原虫(FFPY)加百日咳杆菌产生一过性的原虫血症后出现完全无虫的免疫。     

按蚊中肠前酚氧化酶原与约氏疟原虫卵囊黑化的关系

目的　分析约氏疟原虫卵囊黑化期间按蚊中肠内前酚氧化酶原 (Prophenoloxidase ,PPO)的变化 ,探讨中肠PPO与疟原虫卵囊黑化的关系。　方法　解剖分离约氏疟原虫感染前和感染后 3、5、7、11和 15d斯氏与大劣按蚊中肠 ,匀浆后经SDS PAGE和转膜 ,以抗烟草天蛾PPO的抗体进行免疫印迹分析 ,并于感染后第 5d开始在镜下观察约氏疟原虫卵囊黑化情况 ,直至第 15d止。　结果　斯氏与大劣按蚊中肠在约氏疟原虫感染前和感染后的不同时期经免疫印迹均可检测到 1条分子质量约为 67ku的PPO阳性蛋白带 ,但感染后的PPO蛋白带比感染前明显增强 ,而且同时间点大劣按蚊中肠PPO蛋白带比斯氏按蚊明显 ,尤其在感染的后期大劣按蚊中肠PPO蛋白带明显比斯氏按蚊增强 ;在感染后 7d可见大劣按蚊中肠内发育的约氏疟原虫卵囊部分黑化 ,在 15d时可见疟原虫卵囊完全黑化。　结论　按蚊中肠PPO含量增加 ,尤其是长时间内维持在较高水平与约氏疟原虫卵囊黑化密切相关。     

以单克隆抗体鉴定三日疟环子孢子蛋白质及检测巴氏疟原虫子孢子共有的抗原决定簇

本文报道以抗三日疟原虫子孢子单克隆抗体鉴定同种疟原虫的环子孢子蛋白质和研究三日疟原虫与猴巴氏疟原虫两者间的关系。以弗氏按蚊叮咬感染了三日疟的夜猴,吸血后15～21天解剖唾腺获得子孢子,经多次静脉接种免疫BALB/c小鼠,取小鼠的脾细胞与浆细胞瘤细胞融合得杂交瘤细胞,从接种杂交瘤小鼠腹水提纯单克隆抗体(MoAB 6BlO)。环子孢子蛋白质鉴定,以低温贮存的IFAT滴度1:≥50,000、活的三日疟子孢子直接放入于含2%SDS、10%甘油、     

按蚊中肠前酚氧化酶原与约氏疟原虫卵囊黑化的关系

目的 分析约氏疟原虫卵囊黑化期间按蚊中肠内前酚氧化酶原(Prophenoloxidase，PPC))的变化，探讨中肠PPO与疟原虫卵囊黑化的关系。方法 解剖分离约氏疟原虫感染前和感染后3、5、7、11和15d斯氏与大劣按蚊中肠，匀浆后经SDS-PAGE和转膜，以抗烟草天蛾PPO的抗体进行免疫印迹分析，并于感染后第5d开始在镜下观察约氏疟原虫卵囊黑化情况，直至第15d止。结果 斯氏与大劣按蚊中肠在约氏疟原虫感染前和感染后的不同时期经免疫印迹均可检测到1条分子质量约为67ku的PPO阳性蛋白带，但感染后的PPO蛋白带比感染前明显增强，而且同时间点大劣按蚊中肠PPO蛋白带比斯氏按蚊明显，尤其在感染的后期大劣按蚊中肠PPO蛋白带明显比斯氏按蚊增强；在感染后7d可见大劣按蚊中肠内发育的约氏疟原虫卵囊部分黑化，在15d时可见疟原虫卵囊完全黑化。结论 按蚊中肠PPO含量增加，尤其是长时间内维持在较高水平与约氏疟原虫卵囊黑化密切相关。     

恶性疟原虫成对体蛋白的分离

作者用同位素标记、分子杂交、免疫沉淀和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫电子显微镜技术等多种实验手段,研究了存在于Wellcomo(Lagos)株的恶性疟原虫裂殖子的成对体中一个分子量为140,000的蛋白质,描述了该蛋白质的制备,纯化,鉴定及部分特性。作者从被寄生的红细胞的抽提物中通过单克隆抗体亲和层析方法提纯了该蛋白质。发现该蛋白质是在裂殖子的裂殖生殖阶段被合成的,抗恶性疟原虫的单克隆抗体61.3识     

来自不同种疟原虫子孢子保护抗原之间的类似结构

子孢子外周(CS)蛋白是一些疟原虫种的保护性抗原。抗CS蛋白的单克隆抗体能与另外二条细胞内多肽(IS_1和IS_2)发生免疫活性沉淀,这二条多肽得自[~(35)S]甲硫氨酸代谢标记的原虫抽提液中。本文作者通过双相电泳和反相高压液相层析,比较了来自伯氏疟原虫,诺氏猴疟原虫,食蟹猴疟原虫和人恶性疟原虫的CS和IS。在还原和非还原的情况下,这些疟原虫种的CS,IS_1和IS_2的分子量在42,000～67,000之间。它们的等电点值范围为4.7到6.0。由每一种疟原虫所分离出来的CS和IS蛋白能与各自的单克隆抗体反应,产生非常类似的肽段图谱。这些结果证明IS是CS的细胞内前体,而且因CS     

大鼠感染约氏疟原虫后的保护性免疫

前已报道,约氏疟原虫子孢子入侵大鼠肝细胞与枯氏细胞的吞噬活性水平呈正相关,而与其异化代谢水平呈负相关。体外试验证明,伯氏疟原虫子孢子可主动侵入小鼠腹腔巨噬细胞 在正常情况下,巨噬细胞很快死亡而子孢子则完好无损,但在免疫血清条件下,巨噬细胞中子孢子迅即退化。大鼠感染伯氏疟原虫急性期,其血清在体外有抑制腹腔巨噬细胞的吞噬作用。以往研究提示红内期感染条件下有可能通过抑制或刺激单核巨噬细胞系统而影响子孢子的入侵。现用对约氏疟原虫子孢子敏感的Wistar大鼠,观察其在感染约氏疟原虫急     

瘦素蛋白转基因约氏疟原虫对小鼠体质量的影响

目的探讨含瘦素(leptin)蛋白转基因约氏疟原虫(Plasmodium yoelli)对感染小鼠体质量的影响。方法设计并构建含小鼠瘦素基因的疟原虫CRISPR/Cas9重组质粒,该质粒两端带有约氏疟原虫17XNL株巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)的5′和3′同源序列,将外源的小鼠瘦素基因经同源重组插入至MIF基因编码区下游,构建重组质粒PYC-MIF-Leptin。将该重组质粒电转入体外培养的约氏疟原虫成熟裂殖体内,通过尾静脉注射该裂殖体感染雌性昆明小鼠1只,经乙胺嘧啶筛选和PCR鉴定获得转基因约氏疟原虫克隆。将转基因疟原虫和野生型疟原虫感染C57BL/6小鼠各1只,取眼球血和尾静脉血,通过RTPCR和免疫荧光检测瘦素在疟原虫内是否成功表达。将含转基因疟原虫和野生型疟原虫(1×104接种量)的200μl PBS尾静脉注射感染C57BL/6小鼠各5只,阴性对照组注射等量PBS。每两天记录并统计小鼠原虫血症及体质量变化。采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。结果构建了含瘦素基因和疟原虫MIF同源重组序列的重组质粒PYC-MIF-Leptin。转基因疟原虫DNA测序结果证实,瘦素基因整合入MIF基因下游,并在疟原虫中成功转录。免疫荧光实验结果表明,转基因疟原虫能够表达小鼠瘦素蛋白。转基因疟原虫组17 d体质量下降尤其明显,为(17.26±1.40)g。野生型疟原虫组和阴性对照组小鼠体质量无明显变化,而转基因疟原虫组体质量下降达10.7%(P0.05)。两种疟原虫都在原虫血症达到10%左右时开始下降,但是转基因疟原虫增殖速度较快,最终在23 d左右均消失。结论表达瘦素基因的转基因约氏疟原虫可降低感染小鼠的体质量。     

蚊期和红内期持续表达绿色荧光蛋白的重组约氏疟原虫

目的 构建蚊期、红内期持续表达绿色荧光蛋白（GFP）的约氏疟原虫BY265株。 方法 用SacⅡ酶酶切含有伯氏疟原虫ssu-rrna基因和GFP基因的重组质粒pl0017使之线性化,用电转化的方法将该重组质粒转化入红内期约氏疟原虫BY265株,获BY265-EGFP重组疟原虫,尾静脉注射感染昆明小鼠,24～30 h后用乙胺嘧啶饲喂小鼠5～6 d,鼠尾静脉采血涂片观察原虫感染率。以疟原虫基因组DNA为模板,PCR鉴定转染重组质粒pl0017的约氏疟原虫。斯氏按蚊叮咬感染BY265-EGFP重组疟原虫的小鼠,按蚊血餐后第7天和第16天解剖蚊胃和唾液腺,观察疟原虫能否在蚊体内正常发育。 结果 荧光显微镜观察到呈绿色荧光的红内期各期形态正常的约氏疟原虫。PCR检测结果表明,GFP和ssu-rrna基因已成功整合到约氏疟原虫基因组中。按蚊感染实验证实重组BY265株能在蚊体内正常发育。 结论 构建了蚊期、红内期持续表达绿色荧光蛋白的约氏疟原虫。     

间日疟原虫与异种疟原虫之间的红内期交叉反应抗原分析

本文用1％NP－40分别提取间日疟原虫、恶性疟原虫、食蟹猴疟原虫、伯氏疟原虫及约氏疟原虫红内期可溶性抗原，用间日疟病人血清及两株抗间日疟红内期原虫单克隆抗体6H7和2C3对上述抗原进行免疫印迹分析。结果表明，间日疟原虫与异种疟原虫之间有一系列交叉反应抗原，其中食蟹猴疟原虫有14条蛋白带可被间日疟病人血清识别，多于另外三种疟原虫。五种疟原虫共有的79kD蛋白均可被间日疫病人血清识别。此外，间日疟病人血清还识别正常人红细胞膜抗原中的160kD、67kD蛋白带。McAb6H7识别不同疟原虫中相应的交叉反应抗原区带分别为：恶性疟原虫186kD、175kD；食蟹猴疟原虫133kD；伯氏疟原虫186kD、175kD及约氏疟原虫164kD，另外，McAb6H7还识别正常人红细胞膜中的184kD、170kD蛋白。McAb2C3识别四种疟原虫共有的60kD蛋白，该蛋白可能为疟原虫的种间共同抗原。     

约氏疟原虫动合子的体外纯培养

目的 探讨提纯的约氏疟原虫合子培养形成动合子的方法。方法 经黄尿酸刺激体外诱导感染鼠血中的约氏疟原虫雌雄配子形成、受精，采用梯度离心法分离得到纯净的合子，并在MEM培养基中培养。结果 从10～15只感染小鼠血液可分离到10^6数量级的约氏疟原虫合子；在22℃条件下，经22h～24h培养有动合子形成。结论 可以直接从感染鼠血诱导形成并分离到约氏疟原虫合子，所得合子经培养可发育为动合子。     

伯氏疟原虫裂殖子入侵红细胞的电镜观察

用透射电镜研究了伯氏疟原虫入侵红细胞的过程,并与约氏疟原虫进行了比较。结果表明,入侵开始时,裂殖子多以顶端对着红细胞,并显示出调整方向的能力;红细胞也有部分突出等主动性反应。裂殖子接触后,红细胞即形成凹陷,逐渐将其包围。在此过程中,裂殖子通过顶端和表被两种不同的附着方式与凹陷壁保持联系。包围完成后,凹陷口融合封闭,变成一个包着入侵裂殖子的游离囊泡。与此同时,某些细胞成分也发生一定的变化。 约氏疟原虫多感染幼龄红细胞,且虫体被凹陷口勒出缢痕。伯氏疟原虫则多入侵成熟红细胞,无缢痕现象。