microRNA定量检测方法的研究进展

随着对microRNA(miRNA)种类、结构和生物学功能研究的不断深入,其在生物发育、代谢调控、疾病发生与治疗干预等方面的重要性受到了广泛关注。由于miRNA稳定性差、表达量低和序列差异小等特征,建立快速简便、灵敏度高、特异性强的miRNA定量检测方法对研究这类生物活性分子的功能至关重要。本文对miRNA的定量检测方法进行分析和比较,为选择合适的miRNA检测方法开展生物学功能研究提供参考和借鉴。     

实时荧光定量PCR方法检测石蜡包埋组织microRNA表达的方法探讨

目的:探讨从石蜡包埋组织中运用实时荧光定量PCR(RQ-PCR)方法检测microRNA表达的可靠性和敏感性。方法:选取2005年至2010年从石河子大学医学院第一附属医院、新疆伊犁哈萨克族自治州友谊医院收集的97例福尔马林固定、石蜡包埋食管癌组织样本,提取组织总RNA,RT-PCR逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR法检测microRNA表达。结果:97例食管癌组织样本中,RNA提取成功90例,7例失败,运用实时荧光定量PCR成功检测了83例microRNA表达,7例检测不准确。RNA提取成功率明显高于失败率,实时荧光定量PCR检出的定量准确例数高于定量不准确例数,P<0.05,差异具有统计学意义。结论:实时荧光定量PCR(RQ-PCR)方法是检测石蜡包埋组织中microRNA表达的一种有效方法。     

血清/血浆microrna检测方法探讨与建立

目的:观察实时荧光定量PCR技术检测血清/血浆microRNA表达水平的影响因素。方法:从样本来源、抗凝剂选择、样本储存时间等方面探讨实时荧光定量PCR技术检测血清/血浆miRNA表达的影响因素。结果:miRNA表达在血清和血浆中没有明显差异,样本储存时间对miRNA的表达没有明显影响,但使用肝素抗凝会明显抑制miRNA的表达。结论:成功建立了一套标准化的血清/血浆miRNA表达检测方法。     

荧光实时定量PCR的研究进展

生物机体的生长、发育、衰老和病变通常由基因在不同阶段和部位的差异表达来决定。基因表达差异最终表现为蛋白质合成量上的差异,并在一定程度上决定细胞的激活、增殖、分化、病变和凋亡。定量mRNA表达是了解机体生长发育调控和病理病变机理的一个重要方面,因此准确定量mRNA表达成为了生物医学研究中的一个重要内容。     

实时荧光定量RT-PCR鉴定溶血对血清microRNA测定的影响

目的监测miR-16基因受溶血的影响程度,确定miR-16作为可靠内参用于分析的溶血范围。方法建立红细胞体积比为0、0.040%、0.012%、0.037%和0.110%的溶血标本体系;运用全波长光谱分析确定关于溶血的特征性吸收波长;建立定量测定miR-16的标准曲线;运用实时荧光定量RT-PCR法测定溶血体系中miR-16的表达量。结果与溶血相关的特征性吸收峰位于414 nm;miR-16测定的标准曲线公式为:y=-1.21x+34.635,决定系数R2为0.9988。在溶解红细胞体积小于0.012%的血清标本中,miR-16作为血清micro RNA(miRNA)的内参是可靠的。此时,血清的A414测定值为0.19。结论建立了监测血清标本中miR-16可作为可靠内参基因的溶血范围,确保了标本的可靠性和实验结果的准确性。     

实时荧光定量PCR与酶联定量PCR技术在 HBV-DNA载量检测中的比较研究

目的:比较实时荧光定量PCR(RQ-PCR)与酶联定量PCR(ELQ-PCR)技术在检测HBV感染血清HBV-DNA载量的灵敏度,精确性.为乙型肝炎临床抗病毒治疗和评价药物疗效提供可靠的依据.方法:应用RQ-PCR方法检测212例(4组)HBV感染者血清,ELQ-PCR方法检测228例(4组)HBV感染者血清.结果:RQ-PCR和ELQ-PCR方法检测HBV-DNA,其阳性检出率分别为HBsAg,HBeAg,HBcAb-IgG( )组100%和82.61%;HBsAg,HBeAb,HBcAb-IgG( )组90.63%和73.21%;HBsAg,HBcIgG,HBcAb-IgM( )组80.00%和57.58%;HBsAg,HB-cAb-IgG( )组70.15%和51.43%.HBV-DNA载量的阳性检出率,经统计学处理有显著性差异(P＜0.05).结论:RQ-CPR方法检测HBV-DNA载量在实时监测,节时快速,高灵敏,高精确度等方面都更优于ELQ-PCR.     

淋巴瘤Bcl-2/IgH融合基因实时定量PCR检测方法的研究

目的 建Bcl-2/IgH融合基因实时定量PCR检测方法.方法 以淋巴瘤患者Bcl-2/IgH融合基因的纯化DNA作为标准品,淋巴瘤患者骨髓和外周血为样本,建立SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量PCR(Real-time Quantitative PCR,RQ-PCR),并对方法的灵敏性、稳定性、重复性进行测定.结果 构建的RQ-PCR方法检测Bcl-2/IgH融合基因的敏感性迭10-7 水平;标准曲线的斜率和相关系数分别为-3.13,0.99;管间变异和批问变异分别为6.54%,6.73%,1.90%和3.59%,6.30%,5.49%.结论 建立的SYBR Green Ⅰ荧光染料RQ-PCR方法灵敏,标准曲线的相关性好,方法的稳定性和重复性较好.     

肺炎衣原体实时定量PCR检测方法的建立

目的:探讨实时定量PCR检测肺炎衣原体(chlamydia pneumonia,Cpn)的方法.方法:根据GenBank提供的肺炎衣原体基因序列,选取高特异性和保守型的区域进行引物设计,并建立实时定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)的检测方法.同时用肺炎支原体、肺炎双球菌、流感病毒、副流感病毒以及腺病毒对Cpn引物的特异性进行分析.对呼吸道感染患者200个咽拭子样本和68个肺泡冲洗液样本进行检测,以荧光抗体检测法作对照,评价实时定量PCR检测Cpn的准确性.结果:Cpn PCR引物对肺炎支原体、肺炎双球菌、流感病毒、副流感病毒以及腺病毒均显示阴性,对Cpn显示为阳性,特异性良好;荧光实时定量PCR技术检测的准确性优于荧光抗体检测法.结论:荧光实时定量PCR技术检测Cpn体灵敏度高、周期短,可作为临床诊断Cpn的手段.     

利用荧光定量PCR技术对人肠道乳酸杆菌进行定量检测

目的应用荧光定量PCR技术对人粪便内乳酸杆菌进行定量检测,建立乳酸杆菌的荧光定量PCR检测体系。方法依据人肠道乳酸杆菌16S rDNA序列设计属特异性引物,应用荧光定量PCR技术检测乳酸杆菌的16S rDNA,对粪便中的乳酸杆菌进行定量检测和分析,并与用传统方法所获得的结果进行比较。结果荧光定量PCR检测乳酸杆菌和传统方法检测乳酸杆菌获得的结果接近,差异无统计学意义(P>0.05)。结论荧光定量PCR技术比传统方法省时、省力,且敏感性和特异性更高。     

实时RT-PCR定量检测NGF mRNA表达水平方法的建立

目的:建立一种用SYBR GreenⅠ实时定量逆转录(SYBR GreenⅠQ-RT-PCR)检测大鼠脑组织中神经生长因子(NGF)mRNA基因表达的方法。方法:以Trizol一步法提取大鼠脑组织总RNA,以Oligo(dt)18为引物逆转录产生cDNA,利用SYBRGreenⅠ荧光染料法实时检测NGF mRNA的表达水平。通过熔解曲线分析NGF mRNA检测的特异性,以管家基因β-actin为内参照对NGF进行定量分析。结果:建立的大鼠NGF mRNA SYBR GreenⅠ实时检测方法具有良好的特异性和敏感性。结论:成功建立实时RT-PCR检测NGF mRNA基因表达的方法。     

3种mRNA检测方法比较

目的:比较3种检测mRNA表达的方法.方法:采用Nothern blot,RT-PCR,原位杂交法检测基因mRNA的表达.结果及结论:在使用Nothern blot杂交进行定量分析时,关键因素有:①RNA的质量;②探针标记效率;③洗膜的控制.RT-PCR检测很难用于定量分析.原位杂交法可进行细胞内mRNA的定位分析但不能确定mRNA的绝对含量.将这些方法结合使用,可全面了解基因mRNA的表达.     

实时荧光定量PCR技术诊断肺结核的meta分析

目的系统评价实时荧光定量PCR技术对肺结核的诊断价值并作meta分析。方法检索Pubmed,EMBASE,BIOSIS,Web of Science以及维普、万方、中国知网、中国医学生物文献数据库。按照Cochrane协作网推荐的诊断试验纳入标准筛选文献,纳入的文献采用QUADAS进行质量评价,用MetaDisc 1.4进行meta分析。结果符合标准的共有21个研究,各研究间存在异质性,但不存在阈值效应。合并后的诊断优势比为105.32,敏感度为0.64,特异度为0.96,阳性似然比为19.79,阴性似然比为0.31。SROC曲线的AUC面积为0.9816,Q＊指数为0.9402。结论荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌有着较高的敏感性和很强的特异性,可作为临床肺结核诊断的重要辅助手段,但并不能完全取代痰涂片检查。     

鼠痘病毒荧光定量PCR检测方法的建立与应用

目的 建立鼠痘病毒的荧光定量PCR检测方法,以期能快速、准确、灵敏、特异的检出鼠痘病毒。方法 经过比对和筛选,本研究选取鼠痘病毒的ERPV_027基因480-800位序列段,作为引物设计位点设计引物和探针,并对该引物对和探针的特异性、灵敏性、稳定性和重复性进行检测。结果 本研究建立的方法,对鼠痘病毒的检测极限是68.8copies/μl;该方法特异性强,只对鼠痘病毒特定片段进行特异性扩增,而对小鼠肝炎病毒、仙台病毒、沙门氏菌等其它病毒、细菌无扩增;该方法稳定性和重复性均较好。结论 本研究成功建立了检测鼠痘病毒的荧光定量PCR方法,该方法特异性强、灵敏度高,且具有较好的稳定性和重复性,具有广阔的应用价值。     

小鼠诺如病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)实时荧光定量PCR检测方法,为建立MNV规范化检测方法提供依据。方法根据NCBI公布的60个MNV病毒株核酸序列设计特异性引物,构建标准阳性质控品,建立MNV实时荧光定量PCR方法,并进行特异性、灵敏度、重复性及稳定性评价。用该方法对766只送检小鼠的盲肠内容物样品进行检测,初步了解北京地区实验小鼠MNV感染状况。结果成功建立MNV实时荧光定量PCR检测方法,该方法特异性好,与同种属人类诺如病毒(Hu No Vs)、猫杯状病毒(FCV)均无交叉反应,检测灵敏度可达101copies/μL。批内及批间CT值变异系数均小于2%。应用该方法在766份小鼠盲肠内容物样品中检出301份MNV核酸阳性样品,阳性率39.3%。结论建立的MNV实时荧光定量PCR检测方法特异性好,灵敏度高,重复性好,可以用于MNV的快速定量检测。     

结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法的建立与应用

目的建立结核分枝杆菌的荧光定量PCR检测方法，探讨荧光PCR检测痰标本中结核分枝杆菌的应用价值。方法根据结核分枝杆菌基因保守序列设计引物和探针，并构建标准品。对102例培养涂阳的结核痰液标本和45例非结核感染者的痰标本，应用荧光定量PCR法、痰涂片抗酸染色法检测结核分枝杆菌。结果荧光定量PCR、抗酸染色法检测结核分枝杆菌的特异性分别为100％、30％。结论荧光定量PCR是一种快速、敏感性高、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法，具有重要的应用价值。     

荧光定量PCR检测结核分枝杆菌

目的比较荧光定量PCR与抗酸染色、结核抗体检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异性,评价荧光定量PCR检测临床标本中结核杆菌的应用价值。方法对48例临床确诊的结核病患者和21例非结核呼吸系统疾病患者的痰标本应用荧光定量PCR法和痰涂片抗酸染色法检测,并分离患者外周血血清检测结核抗体,对3种检测方法的结果进行分析比较。结果抗酸染色法检测结核杆菌阳性率为22.9%,特异性为100%;血清结核抗体检测阳性率为77.1%特异性为85.7%;荧光定量PCR检测阳性率为52.1%,特异性为100%。结论荧光定量PCR是一种快速、防污染、敏感性高、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法,在临床上有重要应用价值。     

荧光定量PCR法在结核杆菌检测中的价值

目的探讨荧光定量PCR法检测技术在结核病诊断中的价值。方法采用荧光定量PCR法和抗酸染色法同时检测231例结核患者体液标本(121例痰标本、67例胸腹水及43例尿液标本),对检测结果进行比较。结果荧光定量PCR法的检测灵敏度为102Copy/ml,是抗酸染色法方法检测灵敏度100倍,且对除结核杆菌外的其他呼吸道病原体检测结果均为阴性。本研究痰标本、胸腹水标本及尿液标本的荧光定量PCR法阳性率均要高于抗酸染色法阳性率,比较差异均有显著性(﹤0.01)。结论荧光定量PCR方法检测结核杆菌具有特异性强、灵敏度高、简便、快速的特点,明显优于抗酸染色法,可作为结核病诊断的常规方法。     

实时荧光定量PCR在念珠菌研究中的应用

念珠菌作为院内感染的常见机会性致病菌,实时荧光定量PCR技术已应用于念珠菌临床快速诊断、基因分型、耐药等研究。实时荧光定量PCR技术以灵敏、快速、安全、准确、高通量等特性,不仅在分子生物学领域作为常规的分析检测方法,而且在医院临床标本病原体的检测、遗传性疾病的诊断、检疫、法医学标本的鉴定等领域也逐步得到了广泛运用。