黄芪注射液减轻缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡的机制

目的探讨黄芪注射液减轻缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡的作用机制。方法取体外无血清原代培养8 d的大鼠海马神经元,采用随机数表法分为A组:正常对照组、B组:模型组(缺氧缺糖/复氧复糖组)、C组:黄芪注射液溶剂对照组、D组:黄芪注射液组、E组:二甲基亚砜(DMSO)组、F组:Bax抑制剂组、G组:Bax激动剂组、H组:Bax抑制剂+黄芪注射液组、I组:Bax激动剂+黄芪注射液组。各组除A组均经0.5 h缺氧缺糖,分别采用免疫组化法和RT-PCR法对复氧复糖后0、0.5、2、6、24、72、120 h的Bcl-2、Bax及Caspase-3 mRNA的表达进行检测和比较。结果各组海马神经元除0 h外,其他时间点的Bcl-2水平均高于A组,且各组Bcl-2水平均随时间延长而增高,2 h达到顶峰。除0 h外,其他各时间点H组大鼠海马神经元的Bcl-2水平均显著高于其他组(P<0.05),其次为F组、D组、I组、G组、E组、B/C组、A组,且B组与C组无显著差异(P>0.05)。各组大鼠海马神经元除0 h外,其他各时间点的Bax水平均低于A、B组,且各组均随时间延长而增高,6 h达到顶峰,各组大鼠海马神经元除0 h外,其他各时间点的Caspase-3 mRNA阳性神经元百分率均高于A组,且各组均随时间延长而增高,24 h达到顶峰。除0 h外,其他各时间点B组Bcl-2水平和Caspase-3 mRNA阳性神经元百分率均显著高于其他组(P<0.05),其次为E组、G组、I组、D组、F组、H组,且B组与C组各时间点比较无显著差异(P>0.05)。结论黄芪注射液能够抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元Bax蛋白的表达,提高Bcl-2蛋白表达,抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡;且Bax激动剂能够加速缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡,Bax抑制剂能够减轻缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡。     

黄芪注射液抑制缺氧缺糖后复氧复糖大鼠海马神经细胞凋亡的研究

目的 观察黄芪注射液对缺氧缺糖后复氧复糖大鼠海马神经细胞凋亡的抑制作用.方法 取体外原代培养8 d的正常乳鼠海马神经细胞,缺氧缺糖0.5 h后正常培养,并用黄芪注射液进行干预. MTT法测定细胞活性,光学显微镜下观察细胞形态,Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测凋亡细胞百分率.结果 与正常对照组比较,缺氧缺糖后复氧复糖组(模型组)在复氧复糖后各个时间点海马神经细胞的活性明显下降(P＜0.05),其中复氧复糖后6 h海马神经元活性最低,与其他时间点比较差异显著(P＜0.05). 各时间点黄芪注射液低浓度组和高浓度组的细胞活性与同时间点模型组相比无显著性差异(P＞0.05)黄芪注射液中浓度组各时间点的细胞活性明显增高(P＜0.05).模型组各时间点细胞凋亡率较正常对照组明显升高(P＜0.05),黄芪注射液组各时间点细胞凋亡率较模型组组明显下降 (P＜0.05).光镜下观察模型组可见大量凋亡细胞,细胞核皱缩、碎裂,核深染并可见凋亡小体;坏死细胞肿胀,细胞膜连续性破坏;黄芪注射液组凋亡细胞明显减少且以细胞核皱缩为主,细胞坏死程度较模型组明显减轻.结论 黄芪注射液可以抑制缺氧缺糖后复氧复糖大鼠海马神经细胞的凋亡,提高细胞的活性,对缺氧缺糖后复氧复糖大鼠海马神经细胞有保护作用.     

黄芪注射液与缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元caspase-3表达的关系

目的探讨黄芪注射液与缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡相关基因caspase-3表达的关系。方法取原代培养8 d的大鼠海马神经元,随机分为正常对照组、缺氧缺糖/复氧复糖组、黄芪注射液溶剂对照组和黄芪注射液组。除正常对照组外均进行缺氧缺糖0.5h再复氧复糖。各组于复氧复糖后0、0.5、2、6、24、48、72 h和120 h采用Western印迹检测caspase-3蛋白的表达,采用RT-PCR方法检测caspase-3 mRNA的表达。结果除0 h和0.5 h外,各时间点缺氧缺糖/复氧复糖组海马神经元caspase-3蛋白的平均灰度值均较正常对照组明显增加(P0.05),复氧复糖24h平均灰度值最高;与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,黄芪注射液溶剂对照组各时间点caspase-3蛋白的平均灰度值无明显变化(P0.05),而黄芪注射液组除0h和0.5h外,在各个时间点caspase-3蛋白的平均灰度值明显降低(P0.05)。RT-PCR结果显示:除0h和0.5h外,各时间点缺氧缺糖/复氧复糖组海马神经元caspase-3 mRNA的平均光密度值均较正常对照组明显增加(P0.05),24h平均光密度值最高;与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,黄芪注射液溶剂对照组各时间点caspase-3 mRNA的平均光密度值无明显变化(P0.05),而黄芪注射液组在除0 h和0.5 h外的各个时间点caspase-3 mRNA的平均光密度值均明显降低(P0.05)。结论黄芪注射液抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元的凋亡作用,是通过抑制海马神经元凋亡相关基因caspase-3的表达来实现的。     

黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元bcl-2、bax及cyt-c蛋白形态学表达的影响

目的 观察黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元bcl-2、bax及cyt-c蛋白表达的影响,探讨黄芪注射液防治海马神经元凋亡的作用机制.方法 取原代培养8 d的大鼠海马神经元,随机分为4组:正常对照组、模型组(缺氧缺糖/复氧复糖组)、黄芪注射液溶剂对照组和黄芪注射液组.除正常对照组外,各组均进行缺糖缺氧0.5 h,再分别于复氧复糖后0、0.5、2、6、24、72和120 h采用细胞免疫化学法检测海马神经元bcl-2、bax、cyt-c蛋白的表达.结果 与正常对照组比,模型组bcl-2、bax、cyt-c蛋白表达明显升高,而bcl-2/bax比值下调(P＜0.05).与模型组相比,黄芪注射液组bcl-2蛋白表达及bcl-2/bax比值升高,cyt-c、bax蛋白表达明显降低(P＜0.05);而黄芪注射液溶剂对照组bcl-2、bax、cyt-c蛋白表达及bcl-2/bax比值则无显著变化(P＞0.05).结论 黄芪注射液可提高缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元bcl-2蛋白表达及bcl-2/bax比值,抑制bax、cyt-c蛋白表达,从而抑制缺氧缺糖/复氧复糖引起的海马神经元凋亡.     

大鼠皮质及海马神经元体外缺氧缺糖模型建立

目的建立体外培养大鼠皮质及海马神经元缺氧缺糖模型。方法取培养10—12d的皮质及海马神经元，用古连二亚硫酸钠1mmol／L的无糖Earle液取代正常含血清培养基，分别培养2、4、8、12、24及36h后，MTr法检测细胞活力，并测定培养液中LDH活力。结果连二亚硫酸钠1mmol／L合并基质缺糖2—36h，大鼠皮质及海马神经元细胞活力均显著降低（P〈0．01），并呈时间依赖性下降，至培养36h时细胞存活率分别仅为25．4％和24．2％；培养液LDH活力则均显著升高（P〈0．01）。并呈时间依赖性上升；且皮质及海马神经元培养液LDH活力变化与其细胞活力变化均呈高度负相关（r=-0．983，-0．992，P〈0.01）。结论连二亚硫酸钠合并基质缺糖可建立体外培养大鼠皮质及海马神经元缺氧缺糖模型。     

脑通汤含药血清对缺氧/复氧大鼠海马神经元抗氧化应激相关指标的影响

目的探讨脑通汤通过海马神经元抗氧化应激治疗血管性痴呆(VD)的机制。方法培养大鼠原代海马神经元及鉴定,取培养9 d的神经元,随机分为正常细胞组、缺氧/复氧模型组、正常血清组、脑通汤大、中、小剂量含药血清组。除正常细胞组以外,各组均置入(95%N2+5%CO2)混合气体的三气培养箱缺氧24 h再复氧2 h造模。采用MTT法检测缺氧24 h和复氧2 h时间点海马神经元活性并计算细胞存活率;实时荧光定量PCR法检测海马神经元核因子-E2-相关因子(Nrf)2、血红素氧合酶亚型(HO)-1、醌氧化还原酶(NQO)1 mRNA的表达。结果 MTT显示:缺氧24 h:模型组的海马神经元活性及存活率较正常细胞组明显下降(P0.05),与正常血清组及脑通汤不同剂量含药血清组比较无明显差异(P0.05)。复氧2 h:脑通汤不同剂量含药血清组均较模型组明显升高(P0.05),正常血清组较模型组无明显差异(P0.05)。实时荧光定量PCR结果显示:脑通汤含药血清能够促进缺氧/复氧海马神经元抗氧化应激相关基因Nrf2、HO-1、NQO1的表达(P0.05),并且脑通汤含药血清大剂量组与中剂量组的上述3个基因水平明显高于缺氧/复氧模型组(P0.01)。结论脑通汤可通过上调抗氧化相关基因Nrf2、HO-1、NQO1的表达,减轻海马神经元缺氧/复氧损伤的氧化应激反应,从而保护大鼠海马神经元缺氧/复氧损伤。     

脑神康胶囊对培养大鼠海马神经元缺氧复氧损伤的保护作用

目的 观察益气补肾中药脑神康胶囊对体外培养大鼠海马神经元缺氧复氧损伤的保护作用.方法 原代培养大鼠海马神经元,随机分为对照组,损伤组,脑神康胶囊高、中、低浓度组.对照组正常培养,损伤组及脑神康胶囊各浓度组建立缺氧复氧损伤模型,其中脑神康胶囊各浓度组于复氧时换以不同浓度(5%、10%、20%)含药血清的培养液,检测各组细胞超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)活力及丙二醛(MDA)含量,测定细胞存活率及凋亡率,RT-PCR法检测bcl-2 mRNA和bax mRNA的表达及两者比值.结果 与对照组比较,损伤组SOD活性及细胞存活率均明显下降(P＜0.01),MDA含量、LDH活力及细胞凋亡率均显著升高(P＜0.01),bcl-2 mRNA表达下降,bax mRNA表达升高,bcl-2/bax降低(均P＜0.01);脑神康胶囊各浓度组均较损伤组SOD活性及细胞存活率均升高(P＜0.01),MDA含量及细胞凋亡率均降低(P＜0.01),LDH活力及bax mRNA表达降低(P＜0.01,P＜0.05),bcl-2 mRNA表达升高,bcl-2/bax增加(均P＜0.01),且呈明显的剂量依赖性.结论 脑神康胶囊对海马神经元缺氧复氧损伤有明显的保护作用,其作用机制可能与其提高神经元抗氧化能力、调节凋亡相关蛋白、减少凋亡密切相关.     

17βE2对氧糖剥夺/复糖复氧诱导神经元损伤的保护作用

将培养8d的大鼠皮质神经元分为4组,A组为正常对照组、B组采用氧糖剥夺／复糖复氧（OGD／R）、C组采用17βE2预处理＋OGD／R、D组采用17βE2与PI3K抑制剂LY294002共同预处理＋OGD／R。发现OGD／R后神经元活性逐渐下降,P-Akt、凋亡诱导因子（AIF）表达较正常对照组增加;17βE2可明显提高OGD／R后神经元的存活率,使p-Akt的表达明显增加,AIF表达降低;LY294002与17βE2共同预处理,抑制了17βE2的作用。提示17βE2可减轻OGD／R诱导的皮质神经元损伤,这种保护作用可能与AIF及PI3K／Akt信号通路相关。     

大鼠海马神经元原代培养方法及缺糖缺氧再灌注损伤模型的建立

目的 探讨大鼠海马神经元原代培养方法,并建立缺糖缺氧再灌注损伤模型.方法 取新生48h内的大鼠海马组织进行体外原代培养,并进行神经元鉴定.神经元培养第8天,分为对照组、缺糖缺氧组及再灌注损伤组.对照组换Earle＇s液正常培养;缺糖缺氧组换无糖Earle＇s平衡盐缓冲液培养并放入缺氧盒内,持续3h缓慢通入95％的N2.再灌注损伤组经过与缺糖缺氧组相同处理后,换以完全培养基置入CO2培养箱孵育,模拟体内缺血再灌注的过程.倒置相差显微镜进行一般形态学的动态观察,采用MTT法测定神经元存活率.结果 经过分类计数,神经元约占97.35％,可认为是较纯的神经细胞培养.对照组神经元存活率为100％,缺糖缺氧组为75.25％士3.12％,再灌注损伤组再灌注12、24 h的神经元存活率分别为63.64％±2.25％、55.37％±1.04％;再灌注损伤组再灌注12、24 h的神经元存活率与对照组和缺糖缺氧组比较,P均＜0.05.结论 成功体外培养海马神经元,并建立大鼠缺糖缺氧再灌注损伤模型.     

黄芪多糖对小鼠益智和低氧/复氧损伤的保护作用

目的探讨黄芪多糖益智和低氧/复氧损伤的保护作用及其机制。方法复制苯异丙腺苷(PIA)致小鼠学习记忆障碍模型,益智采用跳台实验;复制低氧/复氧损伤模型,测定小鼠血中活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量,测定超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性。结果黄芪多糖能显著提高小鼠学习记忆能力;显著降低ROS和MDA含量并提高SOD和CAT活性。结论黄芪多糖对小鼠具有益智和低氧/复氧损伤的保护作用。     

Cytoprotective mechanism of heat shock protein 70 against hypoxia/reoxygenation injury

The role of heat shock protein 70 (HSP70) in the cytoprotection against hypoxia/reoxygenation injury was examined. Adult rat cardiomyocytes were isolated, subjected to hyperthermia at 42 degrees C for 15 min (heat shock treatment), and then incubated at 37 degrees C for 3 to 24 h (HSP production process). Heat shock treatment increased HSP70 production (80-260% increase); the peak increase was seen after 9 h of HSP production process. Thereafter, the cells were subjected to 120-min hypoxia and 15-min reoxygenation. Heat shock treatment increased the survival of the cells subjected to hypoxia/reoxygenation (1.5-2.5-fold); the maximal cytoprotection was observed after 12 h of HSP production process. Heat shock treatment increased HSP70 content in the nucleus when cells were subjected to 12 h of HSP production process. To examine the role of HSP70 accumulation in the nuclear fraction, the activity of poly(ADP-ribose) synthetase (PARS), which functions in the nucleus and consumes high-energy phosphates excessively in the reoxygenated state, were measured in the cells with heat shock and 12 h of HSP production process. Heat shock treatment attenuated the hypoxia/reoxygenation-induced increase in the PARS activity (50% decrease). Treatment of the cells with 3-aminobenzamide, an inhibitor of PARS, exerted the effects similar to those of heat shock treatment. These results suggest that attenuation of the PARS activity in the nucleus may play an important role in the cytoprotective effect of HSP70 on hypoxia/reoxygenation injury.     

预吸氧对大鼠缺氧复氧性脑损伤影响的研究

目的 探讨预吸氧对大鼠缺氧复氧性脑损伤的影响及其机制.方法 49只雄性Wistar大鼠随机分为7组,应用Western印迹、免疫组化和黄嘌呤氧化酶法检测在50%和100%预吸氧30 min后缺氧(5%O2,30 min)复氧(100%O2,1或6 h)后大鼠脑皮质内NF-κB、iNOS和Mn-SOD的表达情况,同时用病理组织学方法观察脑组织损伤程度.结果 与对照组相比,NF-κB的表达在100%预吸氧缺氧复氧1 h组的表达显著增加(P＜0.05),而50%预吸氧缺氧复氧1 h组表达显著降低(P＜0.01),50%预吸氧缺氧复氧6 h组最低(P＜0.01);与缺氧复氧1 h组相比,NF-κB的表达在50%预吸氧缺氧复氧1 h组显著降低(P＜0.01);与缺氧复氧6 h组相比,NF-κB的表达在50%预吸氧缺氧复氧6 h组显著降低(P＜0.01).100%预吸氧缺氧复氧1 h(P＜0.05)和6 h(P＜0.01)两组的iNOS阳性细胞数显著高于对照组.与对照组相比,各组Mn-SOD的活力均显著增加(P＜0.05或P＜0.01).与缺氧复氧1 h组相比,50%预吸氧缺氧复氧1 h组Mn-SOD的活力显著增加(P＜0.05).病理表现为:50%预吸氧缺氧复氧组的损伤与缺氧复氧组无明显差别,而100%预吸氧缺氧复氧组病理改变加重.结论 50%预吸氧可能改善缺氧复氧性脑损伤程度,而100%浓度预吸氧可加重缺氧复氧性脑损伤程度.     

大鼠局灶性脑缺血再灌注后雌二醇的保护作用及其对caspase-3表达的影响

目的观察雌二醇对大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经细胞凋亡与caspase-3表达的影响。方法雄性Wistar大鼠72只随机分为假手术组（n=8）、手术对照组和雌二醇组。后两组又根据再灌注时间的不同各分为3、6、12、24h四个小组,每小组8只。线栓法制作脑缺血-再灌注（I/R）损伤模型。缺血2h分别再灌注3、6、12、24h后断头取脑,应用TUNEL染色及SP免疫组织化学方法观察并测定梗死灶体积、凋亡细胞数及caspase3的表达。结果假手术组未发现脑梗死灶和凋亡细胞及caspase-3阳性细胞。雌二醇组较手术对照组脑梗死体积显著缩小（P〈0.05）,凋亡细胞数减少（P〈0.05）;caspase-3表达减弱（P〈0.05）。结论雌二醇通过下调caspase-3的表达抑制脑细胞凋亡,具有脑保护作用。     

异丙酚对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤后凋亡的影响

目的探讨异丙酚对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤后凋亡的影响及其作用机制。方法把培养的18孔乳鼠心肌细胞随机分成3组:对照组、单纯缺氧/复氧组、异丙酚处理组。培养3 d的乳鼠心肌细胞给予1 h缺氧和3 h复氧处理（单纯缺氧/复氧组）。复氧期间给予异丙酚（25μmol/L）处理（异丙酚处理组）,复氧结束后采用DNA原位末端缺口标记技术（TUNEL）测定心肌细胞凋亡比例同时用免疫组化法测定心肌细胞内抗凋亡分子Akt、Bcl-2和促凋亡分子p38 MAPK的表达。结果与对照组相比,异丙酚显著降低了缺氧/复氧诱导的心肌凋亡（10.1%±3.2%vs25.3%±6.2%,P<0.01）,并改变了缺氧/复氧过程中凋亡介导因子的活性。免疫组化的结果显示,异丙酚增加了心肌细胞内抗凋亡蛋白pAkt和Bcl-2的形成,降低了促凋亡蛋白p38的活性。结论异丙酚对培养心肌细胞缺氧损伤后的凋亡有显著的保护作用,该作用与其对pAkt、Bcl-2和p38的影响密切相关。     

西洛他唑对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的:研究西洛他唑(Cilostazol,CIL)对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤的影响及机制。方法:①分离培养SD乳鼠心肌细胞,建立H/R模型。心肌细胞随机分4组:对照组;H/R组,缺氧2 h,复氧4 h;H/R CIL组,缺氧前1 h予以CIL(10μmol.L-1)随即缺氧2 h,复氧4 h;H/R CIL Wort mannin(H/R CIL W)组,CIL处理前30 min予磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase PI3K)特异性抑制剂——渥曼青霉素(Wort mannin 0.1μmol.L-1);②检测各组培养液中乳酸脱氢酶、肌酸激酶同工酶含量,流式细胞术检测心肌细胞凋亡率,Western blot检测丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)及磷酸化丝氨酸/Akt(p-Akt)的表达。结果:CIL明显抑制H/R损伤导致的心肌细胞凋亡,并使p-Akt/Akt比值明显增加;Wort mannin可使p-Akt/Akt比值明显减少,抑制CIL的抗凋亡作用。结论:H/R损伤可导致心肌细胞凋亡,CIL可能通过PI3K-Akt途径发挥抗凋亡作用。     

Protective mechanism of NALP3-siRNA on rat renal tubular epithelial cells from hypoxia/reoxygenation injury

Objective To explore the mechanism of protecting cells from hypoxia/reoxygenation(H/R) injury by constructing specific small interference RNA(siRNA) to inhibit NALP3 expression in rat renal tubular epithelial