腺病毒重组人白细胞介素24对肾癌细胞株786-O 细胞生长和凋亡的影响

目的探讨腺病毒重组人白细胞介素24(IL-24)对肾癌细胞株786-O细胞的生长和凋亡的影响。方法将培养的肾癌细胞株786-O细胞随机分为空白对照组、阴性对照组(转染腺病毒重组人IL-24对照组)及实验组(转染腺病毒重组人IL-24组)。取对数生长期肾癌细胞株786-O,构建腺病毒重组人IL-24及对照并转染至肾癌细胞株786-O实验组细胞及阴性对照组细胞。使用四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测肾癌细胞株786-O生长能力;采用流式细胞术检测肾癌细胞株786-O凋亡情况;应用Western Blot检测肾癌细胞株786-O中MMP-9蛋白的表达水平。结果实验组肾癌细胞株786-O细胞增殖能力低于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组肾癌细胞株786-O细胞表面磷脂酰丝氨酸表达水平高于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组肾癌细胞株786-O细胞中MMP-9蛋白表达水平低于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。空白对照组与阴性对照组肾癌细胞株786-O细胞增殖能力、细胞膜表面磷脂酰丝氨酸表达水平、MMP-9蛋白表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论转染腺病毒重组人IL-24可抑制肾癌细胞株786-O细胞的生长并诱导细胞凋亡,腺病毒重组人IL-24可能通过下调MMP-9诱导肾癌细胞株786-O细胞的凋亡。     

CHIP对肾癌786-O细胞增殖的影响及机制研究

目的 研究CHIP对肾癌786-O细胞增殖能力的影响及其作用机制。方法 将肾癌786-O细胞分为control组(转染LV3-NC慢病毒)和CHIP组 (转染LV3-human CHIP慢病毒),通过RT-qPCR和Western blot法检测CHIP的表达。稳转细胞系构建成功后,通过CCK-8法、RTCA法检测细胞的增殖情况。体内外通过Western blot法和免疫组化检测沉默CHIP表达后AKT、p-AKT、p21的表达。构建control组和CHIP组裸鼠皮下瘤模型,记录皮下瘤体积变化、瘤重。结果 转染LV3-human CHIP慢病毒可显著降低肾癌786-O细胞中CHIP的表达水平。CCK-8法及RTCA法表明沉默CHIP的表达后,与control组比较,CHIP组细胞增殖能力显著提高,差异有统计学意义(P均<0.05)。体内外实验发现,与control组比较,CHIP组p-AKT表达增多,p21表达减少。CHIP组裸鼠皮下瘤组织体积及瘤重均显著大于control组,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论沉默CHIP的表达,可能通过AKT/p21通路,显著提高肾癌786-O细胞的增殖能力。     

姜黄素对肾癌786-O细胞增殖及凋亡的实验研究

目的观察姜黄素对肾癌786-O细胞缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP蛋白)表达水平以及细胞凋亡的影响,研究姜黄素对肾癌细胞的生长抑制作用并探讨其分子机制,进一步揭示姜黄素对肾癌的治疗作用。方法不同浓度姜黄素作用人肾癌786-O细胞24、48、72 h后,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测姜黄素对人肾癌786-O细胞的增殖抑制率;流式细胞术检测姜黄素诱导细胞的凋亡率;免疫细胞化学检测姜黄素对786-O细胞HIF-1α和XIAP表达的影响。结果姜黄素对人肾癌786-O细胞有明显的抑制作用,可引起细胞凋亡,并且存在剂量和时间依赖;不同浓度姜黄素作用细胞48 h后,HIF-1α和XIAP蛋白表达量下降。结论姜黄素通过下调HIF-1α和XIAP的表达抑制人肾癌786-O细胞的增殖,诱导人肾癌786-O细胞的凋亡。     

慢病毒介导的Clusterin基因沉默抑制肾癌786-O细胞增殖并促进细胞凋亡

【目的】 应用慢病毒介导的RNA干扰技术,检测clusterin(CLU)基因沉默在人肾癌786-O细胞的干扰效果及其对人肾癌786-O细胞增殖?迁移和凋亡的影响?【方法】 构建靶向CLU基因的慢病毒干扰载体,利用包装细胞293T获得重组慢病毒,感染人肾癌786-O细胞株?实验分5组:CLU-RNAi-LV1(KD1)?CLU-RNAi-LV2(KD2)?CLU-RNAi-LV3(KD3)为加入靶向CLU基因的慢病毒感染的肾癌细胞组,未处理的慢病毒感染的肾癌细胞组(NC组),肾癌786-O细胞为空白对照组(CON组)?应用Real time-PCR及Western blot检测不同组别干扰前后CLU mRNA及蛋白表达的变化?用细胞划痕实验?MST-1?流式细胞仪等方法检测CLU沉默后肾癌786-O细胞在增殖?迁移?凋亡等生物学行为的改变?【结果】 成功构建CLU shRNA慢病毒载体clu-RNAi-LV并获得相应慢病毒?Real time-PCR显示不同感染复数CLU-RNAi-LV处理的KD1?KD2?KD3组CLU mRNA表达水平与对照组相比分别下调69.4%~96.5%和0?Western blot结果显示KD1?KD2?KD3组CLU蛋白表达水平与CON组相比分别下降35.24%?46.26%和58.91%,KD3能显著抑制786-O细胞中CLU基因的表达?划痕实验显示24 h时 KD3(si-CLU)组细胞迁移相对距离(408.43 ± 25.92)小于NC组(101.35 ± 6.05)和CON组(68.13 ± 6.64,P < 0.05)?WST-1法检测转染后72 h KD3(si-CLU)组细胞生长速度较NC组及CON组明显下降(P < 0.05),各组间差异(P < 0.05),均有统计学意义?流式细胞仪检测KD3(si-CLU)组与NC组?CON组细胞凋亡率分别为(6.23 ± 2.51)%?(1.05 ± 0.30)%和(1.17 ± 0.29)%,KD3(si-CLU)组与NC组?CON组相比凋亡率增加(P < 0.05),差异有统计学意义?肾癌786-O细胞的增殖?迁移受到抑制,而凋亡率增加?【结论】 筛选出能稳定干扰CLU基因表达的siRNA序列和肾癌786-O细胞株?CLU慢病毒干扰载体可有效沉默肾癌786-O细胞的内源性CLU基因,抑制肾癌786-O细胞的增殖?迁移并促进细胞凋亡?     

索拉非尼对肾癌786-O细胞株体外培养的增殖抑制作用

目的探讨索拉非尼对体外培养的肾癌786-O细胞株细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。方法体外培养人肾癌786-O细胞株,给予不同浓度（10．0、50、25、1．0、0．5μmol／L）的索拉非尼混合处理,采用MTT法检测细胞增殖的变化,并采用流式细胞仪检测索拉非尼对786-O细胞凋亡和细胞周期变化的作用。结果经索拉非尼处理后,镜下可见786—O细胞株细胞结构消失,各孔内可见大量紫黑色针状结晶物,但随着药物浓度的升高,针状结晶物逐渐减少。与对照组比较,10．0、5．0和2．5μmol／L组吸光度值均显著下降（均P〈0．01）、细胞抑制率均显著升高（均P〈001）,100和5．0umol／L组细胞存活率均显著下降（均P〈0．01）。与对照组比较,5．0、2．5、1．0μmol／L组G0／G1期细胞所占比例均显著升高（均P〈0．01）、S期细胞所占比例均显著下降（均P〈0．01）;而GJM期细胞所占比例仅5．0μmol／L组显著升高（P〈0．01）。结论索拉非尼可以抑制人肾癌786-O细胞株的增殖,诱导肾癌细胞凋亡。     

SCAP重组腺病毒对ATDC5细胞增殖和凋亡的影响

目的 构建固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SRREBP cleavage activating protein,SCAP)基因干扰(small interfering RNA,siRNA)和过表达重组腺病毒,观察其对ATDC5软骨干细胞增殖及凋亡的影响.方法 应用pAdEasyTM腺病毒载体系统构建重组腺病毒质粒pAd-SCAPsiRNA和pAdSCAP,在HEK293细胞中分别包装和扩增.RT-PCR和Western blot检测ATDC5细胞中SCAP的表达,流式细胞仪检测SCAP腺病毒对ATDC5细胞周期和凋亡的影响,Western blot检测凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3、p-JNK的表达.结果 成功获腺病毒siSCAP(滴度为2.5 × 1010PFU/mL)和Ad-SCAP(滴度为3.0×10n PFU/mL).RT-PCR和Western blot结果表明:siSCAP和Ad-SCAP能分别有效抑制和增强ATDC5细胞中SCAP的表达.流式细胞仪检测结果表明:与正常组和空病毒组比较,siSCAP腺病毒处理组S期细胞比例升高15.45％和16.07％ (P ＜0.05),Ad-SCAP组比例降低14.27％和13.45％(P＜0.05);siSCAP组细胞凋亡率降低13.10％和11.50％ (P ＜0.05),Ad-SCAP组升高10.51％和10.17％ (P ＜0.05).Western blot检测结果与流式细胞仪检测结果一致.结论 成功构建SCAP腺病毒;敲低SCAP能促进ATDC5细胞增殖并抑制凋亡;过表达SCAP则抑制增殖、促进凋亡.     

PTEN cDNA重组腺病毒载体的构建

目的:应用同源重组法构建含野生型抑癌基因PTEN cDNA的腺病毒载体pAdPTEN cDNA,产生重组腺病毒AdPTEN.方法:将PTEN cDNA自载体pcDNA3-PTEN cDNA中切出,亚克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV中,然后与腺病毒质粒pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,产生重组PTEN cDNA的腺病毒载体pAdPTEN cDNA,通过脂质体介导将pAdPTEN cDNA转染至HEK293细胞,产生有感染能力的腺病毒AdPTEN,并测定其滴度.结果:产生具有感染能力的重组腺病毒AdPTEN,滴度约为5×109pfu/ml.结论:成功构建出含有PTEN cDNA的具有感染能力的腺病毒,并可获得较高的病毒滴度,为进一步研究PTEN基因的功能和相关肿瘤的基因治疗提供有效的基因转移载体.     

shRNA干扰肾癌细胞株786-O和OS-RC-2中HIF-2α的表达对VEGF的影响

目的构建在哺乳动物细胞中表达的低氧诱导因子-2(HIF-2α)的短发夹RNA(shRNA)的表达质粒,在体外模拟肿瘤常氧和低氧环境下研究对血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。探讨HIF-2α、VEGF两者之间及其与肾透明细胞癌(CCRCC)的关系,HIF-2α可能为CCRCC潜在的新效靶。方法构建HIF-2α shRNA真核表达载体质粒, shRNA测序鉴定。150 umol/L氯化钴(Co Cl2)模拟细胞低氧环境。设对照组(空白、阴性)和实验组。空白对照组不做转染,阴性对照组转染空质粒,实验组转染HIF-2α shRNA重组质粒,每组均设置常氧和低氧环境组。采用Real time-PCR技术检测786-O和OS-RC-2细胞中HIF-2α基因表达情况,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western Blot检测VEGF蛋白表达情况。结果 DNA测序证实重组质粒构建成功, shRNA转染786-O和OS-RC-2细胞,实验组中HIF-2α mRNA表达明显受到抑制,且常氧较低氧环境下HIF-2α mRNA表达降低,低氧环境下凋亡显著;常氧和低氧环境下,实验组VEGF蛋白表达量均下降,且常氧环境下蛋白表达下降明显。结论低氧环境下,HIF-2α mRNA表达量升高,促进VEGF蛋白表达。干扰HIF-2α基因后,细胞凋亡率升高,抑制VEGF蛋白表达。该基因可能为治疗CCRCC提供了新的效靶,为下一步实验鉴定奠定基础。     

蛇葡萄素对肾癌786-O细胞增殖和凋亡的作用

目的 探讨蛇葡萄素(AMP)对人肾癌786-O细胞株增殖与凋亡的作用.方法 将不同浓度的AMP作用于体外培养的肾癌786-O细胞株,采用MTT法检测不同浓度的AMP对肾癌786-O细胞增殖的作用的影响;采用Annexin V/PI双染法检测不同浓度的AMP对肾癌786-O细胞凋亡的作用.结果 MTT结果显示AMP能显著抑制肾癌786-O细胞增殖,半数抑制浓度(IC50)为17.23 μg/mL;经不同浓度的AMP作用7h后,肾癌786-O细胞凋亡率明显增加,AMP浓度为10 μg/mL和20 μg/mL作用于肾癌786-O细胞后,细胞凋亡率升高(P＜0.05);而AMP浓度为40μg/mL和80 μg/mL作用细胞后,细胞凋亡率显著升高(P＜0.01).结论 AMP在体外能显著抑制肾癌786-O细胞增殖,且能促进肾癌786-O细胞凋亡.     

shRNA 沉默YAP基因对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨慢病毒干扰载体沉默Yes-相关蛋白（Yes-associated protein,YAP）对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响。方法：用细胞免疫荧光法检测肾癌786-O细胞中YAP蛋白表达情况;构建针对YAP基因的shRNA慢病毒干扰载体转染786-O细胞。RT-PCR和Western blot分别检测干扰786-O细胞前后 YAP mRNA及蛋白的表达情况;CCK-8（cell counting kit-8）法检测沉默YAP后细胞增殖的改变;流式细胞仪（flow cytometry,FCM）检测细胞凋亡和周期的变化。结果：786-O细胞中YAP蛋白表达于细胞浆和细胞核;shRNA-YAP慢病毒干扰载体转染4 d后,可明显下调786-O细胞YAP mRNA及蛋白表达水平（P=0.000）,并且明显抑制细胞增殖和促进细胞凋亡（P=0.000）;细胞周期紊乱,G1 期细胞明显增加,S期细胞明显降低（P=0.000）。结论：YAP-shRNA慢病毒干扰载体能有效抑制YAP基因在786-O细胞中表达,进而抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。     

以Ad-Easy载体系统快速构建PTEN重组腺病毒表达载体

目的 应用Ad-Easy腺病毒载体系统构建携带抑癌基因PTEN的重组腺病毒表达载体.方法 用插入有抑癌基因PTEN和绿色荧光蛋白的穿梭载体pAdTrack-CMV转化已经含有腺病毒骨架载体pAdEasyl的E.coliBJ5183(Ad-1 cells)进行同源重组,获得重组腺病毒质粒,经Pac Ⅰ线性化后,转染293细胞.结果 得到重组腺病毒,转染重组腺病毒DNA的293细胞出现细胞病变,经PCR对传代的Ad-PTEN分析证实得到目的基因,荧光显微镜能观察到293细胞内有绿色荧光.结论 腺病毒Ad-Easy系统是一种较为简便、快速的构建重组腺病毒的好方法,且生成的病毒滴度高、转导效率好,为进一步研究PTEN基因应用于癌症基因治疗提供实验基础.     

Survivin在肾透明细胞癌786-O细胞株中表达的实验研究

目的:检测抗凋亡基因survivin在肾透明细胞癌786-O细胞株中的表达并探讨其临床意义.方法:运用MTT(四唑盐比色)法检测细胞生长状态并绘制生长曲线,运用RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)法和免疫组化法检测786-O细胞株中survivinmRNA及survivin蛋白的表达情况.结果:检测出786-O细胞株中有survivin mRNA的表达,survivin蛋白的表达亦呈阳性,而正常肾细胞无阳性表达.结论:survivin mRNA及survivin蛋白在肾透明细胞癌中均有明显的表达,利用这一表达特异性,为以survivin基因为靶点的肾癌基因治疗研究提供了实验依据.     

欧前胡素抑制人肾癌786-O细胞增殖并促进其凋亡

目的 探究欧前胡素(imperatorin)对人肾癌细胞786-O增殖及凋亡的影响,初步研究其作用机制。方法 分别使用0,20,40,60,80,100,120,140,160,180,200μmol/L的欧前胡素处理786-O细胞24,48,72 h后,CCK-8法检测786-O细胞增殖,并计算IC₅₀,筛选最佳干预浓度进行后续实验。生物显微镜观察细胞形态变化;CCK-8实验和克隆形成实验检测各组细胞增殖能力的变化;流式细胞术检测各组细胞凋亡的情况;RT-qPCR和Western blot方法检测各组Fas、Caspase-8、Caspase-3、Bcl-2的表达情况。从TCMSP和HERB数据库收集欧前胡素作用靶点。由GeneCards数据库获取肾癌疾病靶点,使用STRING数据库构建蛋白互作网络,并筛选欧前胡素治疗肾癌的核心靶点。结果 欧前胡素作用786-O细胞24 h和48 h的IC₅₀分别为94.36μmol/和65.66μmol/L。与0μmol/L组相比,40μmol/L组786-O细胞体积减小,细胞密度略减少,增殖能力受到抑制...     

KIF21B在肾细胞癌中的表达及其对肾癌细胞786-O凋亡的调控作用研究

目的 分析肌动蛋白家族成员21B(KIF21B)在肾细胞癌中的表达水平及意义,探讨KIF21B对肾癌细胞凋亡的影响及机制。方法 采用免疫组织化学、蛋白印迹法(Western blot)检测KIF21B在人肾细胞癌组织和癌旁组织中的表达差异,分析KIF21B改变与患者临床病理特征的相关性。采用Western blot检测KIF21B在人胚肾细胞和肾癌细胞株中的表达差异。以特异性慢病毒下调肾癌细胞786-O中KIF21B表达后,采用流式细胞术和Tunel检测KIF21B对786-O细胞凋亡的影响。采用Western blot检测低表达的KIF21B对PI3K/AKT通路蛋白的调控作用。结果 肾细胞癌组织中KIF21B阳性表达率明显高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05),且阳性表达水平与患者Fuhrman分级、T分期、肿瘤转移存在相关关系。沉默慢病毒及空载体慢病毒作用786-O细胞72 h后,沉默组786-O细胞中KIF21B表达水平下调且细胞凋亡增加,差异有统计学意义(P<0.05)。沉默KIF21B后,786-O细胞中PI3K/AKT关键蛋白表达水平被抑制。结论 KI...     

重组腺病毒对小鼠肝脏能量代谢的影响

目的:探讨重组腺病毒感染小鼠肝脏后,对肝脏的能量代谢和氧化应激水平的影响?方法:将Balb/c小鼠随机分为正常组及重组腺病毒感染组,通过小鼠尾静脉注射含编码绿色荧光蛋白(GFP)外源基因的重组腺病毒,利用荧光显微镜观察GFP在肝脏的表达水平;检测血浆中丙氨酸氨基转移酶(ALT)?天门冬氨酸氨基转移酶(AST)?葡萄糖?胆固醇?甘油三酯?β-羟丁酸(β-HB)?成纤维细胞生长因子(FGF-21)?丙二醛(MDA)等水平;测定肝脏糖原含量;检测肝脏组织中参与糖异生?脂质合成?脂肪酸氧化等基因的表达水平?结果:重组腺病毒主要在小鼠肝脏表达,并于注射后第5天表达最高?与对照组小鼠比较,重组腺病毒感染小鼠的血浆中ALT?AST明显升高,β-HB和FGF-21呈升高趋势?Real-time PCR检测发现,重组腺病毒感染小鼠的肝脏组织中,参与糖异生及脂质合成的基因mRNA水平明显降低,而脂肪酸氧化相关基因的mRNA水平明显升高?此外,重组腺病毒感染后,小鼠血浆MDA及肝脏中氧自由基产生基因的表达水平明显增高?结论:小鼠肝脏在感染重组腺病毒后,糖异生及脂质合成能力下降,而脂肪酸氧化增强?这种能量代谢的改变可能与重组腺病毒感染引起的氧化应激有关?     

姜黄素抑制人肾癌786-O细胞增殖及对细胞周期影响的研究

目的研究姜黄素对人肾癌786-O细胞体外生长及细胞周期的影响,为肾癌治疗提供理论依据。方法应用MTT比色法和流式细胞仪检测人肾癌786-O细胞增殖抑制率及细胞周期各时相的变化和凋亡率。结果姜黄素对人肾癌786-O细胞有抑制作用,存在剂量依赖（F=6207．813,P〈0．01）与时间依赖（F=1210．386,P〈0．01）;流式细胞仪分析,G1期细胞增多,S期细胞减少,C2／M期细胞相对增多。结论姜黄素可以抑制人肾癌786-O细胞增殖,阻止G1期细胞向S期的进程,促进人肾癌786-O细胞凋亡。     

重组bcl-xL腺病毒对心肌细胞凋亡的影响

[目的]探讨转染人类抗凋亡基因bcl-xL能否提高心肌细胞对缺氧的耐受性,评价它对心肌细胞的抗凋亡作用.[方法]体外培养SD大鼠乳鼠心肌细胞,建立模拟心肌缺氧模型;将携带人类bcl-xL基因的重组腺病毒感染心肌细胞;免疫细胞化学染色法分析bcl-xL蛋白的表达;TUNEL法检测凋亡指数;荧光显微镜下观察心肌细胞表达绿色荧光蛋白,用Hoechst33342染色观察细胞核的形态变化.[结果]转染rAd-bcl-xL/s的心肌细胞表达bcl-xL蛋白阳性单位(PU)(17.84±3.42)明显高于正常对照组(11.02±2.56)与rAd-bcl-xL/as转染组(8.53±2.25)(P＜0.01);缺氧诱导后心肌细胞凋亡指数为(45.67±8.47)%,而转染rAd-bcl-xL/s后的细胞凋亡指数减少至(9.42±2.48)%,有显著性差异(P＜0.01),未见典型的凋亡小体.[结论]腺病毒介导的bcl-xL基因能高效转染心肌细胞,并表达目的基因;外源性bcl-xL基因对体外培养的心肌细胞具有抗凋亡作用,能够提高心肌细胞对缺氧的耐受性,促进损伤心肌的恢复.     

HBx和mIL-12双基因重组腺病毒的构建

目的 构建携带双基因HBx和mIL-12的重组腺病毒Ad-HBx-mIL-12.方法 采用酶切、连接的方法分别将基因HBx和mIL-12连接到穿梭质粒载体pAdenoVator-CMV5.将构建正确的穿梭质粒pAdV-HBx-mIL-12经EcoR Ⅰ酶切线性化后,转化于含腺病毒骨架质粒pAdenoVatorΔE1/E3的BJ5183感受态细菌,实现细菌内同源重组.将鉴定正确的重组腺病毒质粒pAd-HBx-mIL-12经Pac Ⅰ酶切线性化后,以脂质体法转染至293细胞,包装并扩增获得携带双基因HBx和mIL-12的重组腺病毒Ad-HBx-mIL-12.结果 经鉴定携带HBx和mIL-12双基因的重组腺病毒构建成功,并可在293细胞中有效表达.结论 成功构建了携带双基因HBx和mIL-12的重组腺病毒Ad-HBx-mIL-12,为探讨其联合抗肿瘤机制及后续基因治疗奠定了基础.