现有乙型肝炎多表位疫苗在中国人群中的理论免疫效果评价

目的预测现有乙型肝炎（HBV）多表位疫苗在中国的理论免疫应答率,并做出评价。方法利用“中国多表位疫苗设计的HLA Ⅰ积累表型频率空间预测系统”计算现有的HBV表位DNA疫苗所涉及的HLA A、B限制性表位组合在中国人群中的累积表型频率（CPF）,得出理论免疫应答率,并绘制CPF预测等值线图,给出评价。结果现有各HBV多表位疫苗对中国人群的理论免疫应答率偏低,仅较多表位组合的疫苗理论免疫应答率高。现有HBV多表位疫苗存在不同方面的问题：大部分此类疫苗对中国人群的理论免疫应答率低;少数此类疫苗理论免疫应答率高,但为较多表位的组合,不符合多表位疫苗设计的原则,并没有用最少的表位组合达到最高的免疫应答率。结论现有的几种主要的HBV多表位疫苗并不能较好地符合中国人群的特点,效果不佳。     

恶性疟细胞毒性T淋巴细胞单表位疫苗抗原递呈细胞模型的建立

目的 构建恶性疟细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）单表位疫苗及建立抗原递呈细胞模型。方法 采用中国人群常见的HLAⅠ类分子A11限制的恶性疟（CTL）抗原表位(VTCGNGIQVR),合成其DNA序列并克隆于真核表达载体,构建CTL单表位DNA疫苗。将上述克隆在HLA－A11表型细胞株中进行表达,流式细胞仪检测细胞表面HLAⅠ类分子表达水平。结果 上述CTL单表位DNA疫苗编码的短肽在细胞内的表达明显促进HLA－A11分子在细胞表面的表达,用流式细胞仪测定平均荧光强度可量化表达水平（P＜0.05）。结论 成功构建CTL单表位短肽表达载体,模拟体内环境建立了抗原递呈细胞模型,提示CTL表位在该细胞模型内被内源性加工和递呈,以该表位为基础的疫苗可以为HLA－A11遗传背景的人群提供免疫防护。     

肿瘤抗原MAGE-n HLA-A2限制性细胞毒性T细胞表位的预测及合成鉴定

目的　采用表位重建技术 ,对预测MAGE n抗原HLA A2限制性CTL表位结合活性进行研究。方法　用SYFPEITHI超基序法远程预测系统和量化基序多项式法结合的预测方法 ,筛选新的MAGE n抗原HLA A2限制性CTL表位作为候选表位。对预测的抗原表位进行多肽合成 ,并用HPLC进行纯化 ,质谱法 (MS)鉴定。候选表位与HLA A2位点的亲和力及结合稳定性用竞争结合抑制实验、T2结合稳定性实验及MHC 肽复合体稳定性实验测定。结果　用表位预测法筛选MAGE n抗原 5个HLA A2限制性CTL表位为候选表位。QLVFGIEVV(15 9 16 7)、IMPKTGFLI(195 2 0 3)和FLIIVLVMI(2 0 1 2 0 9) 3个表位具有较高的HLA A2结合力 (IC50 <15 μM)和结合稳定性 (DT5 0 >6h) ,可作为MAGE n抗原HLA A2限制性CTL候选表位进行进一步研究。结论　表位预测结合表位重建方法可提高肿瘤抗原CTL表位研究的效率。MAGE n抗原HLA A2限制性CTL表位经免疫学鉴定后 ,可望用于新型肝癌治疗性多肽疫苗的设计研究 ,为临床肝癌特异性治疗奠定基础。     

多表位HBV重组DNA疫苗的构建与免疫效果评价

目的探讨多表位乙型肝炎DNA疫苗诱导特异性细胞免疫应答及其治疗慢性乙型肝炎的潜能。方法筛选一组HBV的表位,并进行优化组合,辅以一定的旁侧序列,并合成目的基因片段HS。将它插入可人用的真核表达载体pVAX1中,构建出重组质粒PVAX-HS。通过重组质粒免疫小鼠,观察免疫动物体内CTL。结果酶切结果显示成功构建了PVAX-HSDNA疫苗,ELISPOT测定证实其可以在小鼠体内诱导产生特异性T细胞,51Cr释放实验证实,所诱导的T细胞中具有很强的CTL活性。结论PVAX-HSDNA疫苗免疫可诱导特异性细胞免疫应答,具有慢性病毒性乙型肝炎治疗性疫苗的潜能。     

脂类分子内佐剂Th/CTL多表位肽体内诱导HLA-A2转基因鼠HBV特异性CTL应答的研究

目的 探索如何在体内启动对外源性合成肽抗原的HLA Ⅰ类分子限制性CD8 T细胞应答.方法 应用分子设计方法设计、合成基于免疫优势性HBcAg CTL表位、PreS2 B细胞表位和破伤风类毒素通用T表位的多肽,并在氨基端导入脂类分子内佐剂,分别与以完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)乳化的多肽抗原相比较,在HLA-A2转基因小鼠体内对其诱导T细胞Th1型极化、CD8 CTL扩增及CD8 CTL介导的HBV特异性细胞毒活性的功能进行研究.结果 含脂质分子内佐剂的Th/CTL多表位肽可在HLA-A2转基因小鼠体内诱导强而有效的Th1型极化和CD8 CTL扩增及HBV特异性CD8 CTL介导的细胞毒活性,其免疫原性显著高于CFA和IFA乳化的多肽(P＜0.05);而后二者其免疫原性未见显著差异.结论 Th/CTL多表位肽设计并引入脂质分子内佐剂是在体内有效诱导抗原特异性CTL应答并降低抗原制剂毒副作用的有效途径.     

QLFATINSTL（93-102aa）是隐球菌抗原MP98CTL优势表位

目的鉴定隐球菌抗原MP98中的HLA—A＊0201限制性CD8^＋CTL表位。方法应用数据库SYFPEITHI预测隐球菌MP98中可能存在的HLA—A＊0201限制性CD8^＋CTL表位,经流式细胞术分析各抗原肽与HLA-A＊0201的亲合力,经时间分辨荧光法检测外周血单个核细胞（PBMC5）对各抗原肽产生的增殖反应,经细胞毒性实验研究各抗原肽诱导的特异性T细胞的细胞毒杀伤活性,逐步鉴定MP98的HLA—A＊0201限制性CD8^＋CTL表位。结果位于MP98氨基酸序列肽3（93—102aa）与HLA—A＊0201分子具有较高的亲合力,并都能刺激HLA—A＊0201阳性个体PBMC增殖,并诱导产生具有特异性杀伤活性的CTL。结论肽3QLFATINSTL（93—102aa）是抗原MP98上HLA—A＊0201限制性CD8^＋CTL的优势表位,可作为隐球菌疫苗设计的候选表位。     

60例食管癌中特异性细胞免疫应答状态与生存率的关系分析

目的 分析食管癌中NY-ESO-1抗原基因的表达分布、NY-ESO-1157-165表位引发的特异性细胞免疫应答的状态与生存率的关系,为食管癌特异性多肽疫苗治疗提供依据.方法 利用RT-PCR方法,检测60例食管癌患者肿瘤标本中NY-ESO-1抗原基因的表达,应用多色流式分析结合HLA-A·0201限制性表位肽/五聚体复合物技术对食管癌患者外周血NY-ESO-1157-165表位特异性细胞毒性T细胞(CTL)进行精确定量,回顾分析12例NY-ESO-1+/HLA-A2+患者,均随访3年,比较不同免疫应答状态对生存率的影响.结果 食管癌患者中NY-ESO-1mRNA表达频率为38.3%.在14例检测到的NY-ESO-1+HLA-A2+患者中检测到不同程度的NY-ESO-1157-165表位特异性CTL反应11例,强反应者(CD8+、Pentamer+细胞频率大于或等于0.5%)生存率明显高于弱反应者(CD8+、Pentamer+细胞频率小于0.5%)(P＜0.01%).结论 食管癌患者不同程度表达NY-ESO-1,其特异性免疫应答被检测到并与生存率有关,为肿瘤CTL多肽疫苗的设计和应用提供了依据.     

结核杆菌抗原Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位的预测及鉴定

目的：预测及鉴定结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）抗原Ag85C的HLA-A＊0201限制性CD8^＋CTL表位，为基于表位的结核疫苗研究提供依据。方法：应用SYFPEITHI数据库预测结核杆菌抗原Ag85C序列中可能存在的HLA-A＊0201限制性T细胞表位，利用T2细胞株分析各预测的抗原肽与HL-A＊0201分子的亲合力，选取高亲合力肽诱导特异性CTL细胞，检测各高亲合力肽刺激其特异性CTL细胞分泌的IFN-γ水平、在体外的CTL增殖反应以及细胞杀伤毒性，逐步鉴定出Ag85C的HLA-A＊0201限制性CD8^＋CTL表位。结果：SYFPEITHI数据库从Ag85C序列中预测到14条能够结合HLA—A＊0201分子的抗原肽，其中3个抗原肽（170～178aa、317～325aa和144～153aa）显示与T2细胞上HLA-A＊0201分子有高结合力，而抗原肽FLTREMPAWL（144～153aa）能够诱导大多数HLA—A＊0201阳性结核患者及PPD（＋）健康志愿者产生特异性CTL细胞，并分泌大量的IFN-γ，能够诱导CTL体外发生增殖，能够产生特异性杀伤活性。结论：成功鉴定出抗原肽FLTREMPAWL（144～153aa）结核杆菌抗原Ag85C的HLA-A＊0201限制性CD8^＋CTL表位，可作为结核疫苗设计的候选表位，为进一步研发新型有效的抗结核疫苗奠定了基础。     

基于HBV核心抗原CTL表位的治疗性多肽在体诱导抗原特异性细胞免疫应答的研究

目的：探讨基于表位的治疗性多肽抗原组分、结构与诱导免疫应答之间的关系。方法：用分子设计的理论和方法，设计基于HBV抗原免疫优势性CTL、Th及B细胞表位的3种治疗性多肽候选疫苗分子，经Merrifield固相多肽合成技术合成，并经HPLC纯化、鉴定。以BALB/c(H-2^d)纯系小鼠为实验对象，进行体内免疫学功能研究。结果：所设计治疗性多肽分子可在体诱导较强的抗原特异性CTL应答和适度的抗体反应。Th、B细胞表位的引入可增强CTL表位肽的效应。结论：提示在治疗性表位多肽疫苗的分子设计中，引入B-、Th表位可显著提高CTL表位肽的免疫原性。     

丙型肝炎病毒CTL-Th表位嵌合DNA疫苗的构建

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)CTL-Th表位嵌合DNA疫苗并探讨其体内免疫学效应。方法:基于我们前期从HCV中鉴定的4条HLA-A*0201限制性CTL(细胞毒性T细胞)表位(NS4b78-86、NS5a367-375、C181-189和NS2172-180),2条HLA-A*1101限制性CTL表位(NS3609-617和NS5b251-259),1条HLA-A*2402限制性CTL表位(NS5b382-390)和2条Th(辅助性T细胞)表位(P73-15和NS5A276-288),合成编码串联CTL表位和Th表位的基因并克隆入真核表达质粒pc DNATM3.1/myc-His(-)A;阳性重组质粒分别免疫HLA-A*0201、HLA-A*1101和HLA-A*2402转基因小鼠,采用ELISPOT实验和CTL杀伤实验检测小鼠脾细胞内单个CTL表位特异性T细胞的水平及其杀伤靶细胞的效应。结果:合成了含有Kozak序列和编码Igκ信号链序列、7条CTL表位、2条Th表位的基因序列并顺利克隆入了真核表达质粒。阳性重组质粒免疫三种转基因小鼠后,采用ELISPOT实验检测到小鼠脾细胞内存在单个CTL表位特异性分泌IFN-γ的CTL,后者可杀伤负载单个CTL表位的脾细胞。结论:成功构建了可诱导CTL反应的HCV的CTL-Th表位嵌合DNA疫苗。     

复合T辅助细胞表位基因质粒的构建及测序

目的制备复合T辅助细胞表位基因。方法复合T辅助细胞表位由5个T辅助细胞表位组成(结核杆菌热休克蛋白65p120、风疹蛋白E2-4p5465、人工合成T辅助细胞表位PADRE、沙眼衣原体热休克蛋白60p3548、破伤风类毒素p830843),其基因序列由219个核苷酸组成。人工合成4条69bp的DAN片段,各片段首尾之间有19bp的互补序列,应用DNA互补延伸拼接技术将4条DNA片段拼接成复合T辅助细胞表位,通过克隆、测序进行筛选。结果通过人工合成基因片段,应用DNA互补延伸拼接技术,成功制备了219个碱基的复合T辅助细胞表位基因,构建了复合T辅助细胞表位基因质粒。结论复合T辅助细胞表位基因的成功制备为研究复合T辅助细胞表位高效疫苗奠定了基础。     

基于地理信息系统的中国人群HLA-A、B位点的空间遗传结构

目的分析中国人群HLA-A、B位点HLA的空间遗传结构, 为研究人口迁移、民族融合等群体遗传学和人类学问题、揭示HLA与疾病关联性以及合理设计多表位疫苗提供依据。方法应用主成分分析方法及地理信息系统中的空间插值技术，从基因频率矩阵中提取综合指标，用以反映中国人群HLA-A、B位点的空间遗传结构。结果中国人群HLA-A位点的第一主成分自北向南形成了明显的遗传地理梯度变异。在黄河流域以南，第一主成分梯度呈南北走向；在西北地区，呈西北东南走向；在华北及东北地区，呈东北西南走向。HLA-B位点第一主成分自北向南形成了明显的遗传地理梯度变异；HLA-B位点的空间遗传结构的异质性程度高，而 HLA-A位点空间遗传结构的异质性程度相对较低。结论中国群体HLA-A、B位点的空间遗传结构呈现明显的南北地理遗传梯度变异性；南方人群HLA-A、B位点空间遗传结构异质性程度高，群体之间差异较大；中国人群HLA B位点空间异质性程度高于HLA-A位点空间异质性程度     

最低限度免疫定义基因表达的HCV多表位DNA疫苗对小鼠细胞免疫的诱导作用

目的：探讨采用最低限度免疫定义基因表达法制备丙型肝炎病毒（HCV）多表位DNA疫苗的可行性,阐明该方法在疫苗领域可能的应用价值。方法：采用人工合成和PCR方法制备长度为1 346 bp的含有CMV启动子、HCV 1b亚型多表位和牛生长激素（BCG）多聚腺苷酸序列的最低限度免疫定义基因表达DNA疫苗,命名为M-HCV-epi;同时制备结构基因被非HCV同源的DNA序列替换的相同长度DNA片段作为对照,命名为V-pcDNA3.1。12只ICQ小鼠随机分为实验组（n=6）和对照组（n=6）,分别采用M-HCV-epi DNA和V-pcDNA3.1 DNA各20 μg皮下注射。QRT-PCR法检测免疫后小鼠脾细胞中干扰素γ（IFN-γ）mRNA的表达水平;人工合成3个HCV 1b亚型表位多肽和1条对照多肽。用上述合成的多肽刺激免疫后小鼠脾细胞,ELISA法检测脾细胞刺激上清中IFN-γ水平。结果：与对照组比较,实验组小鼠脾细胞中IFN-γ mRNA表达水平升高（1.50±0.18）倍（P<0.05）;加入aa35-44多肽的实验组小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ水平较对照组明显升高（P<0.05）。结论：最低限度免疫定义基因表达法制备HCV多表位DNA疫苗可诱导细胞免疫反应,该方法在DNA疫苗领域可能具有应用价值。     

抗HBe阳性慢性肝炎患者的HBV感染状态研究

本文结合肝内HBsAg与HBcAg的表达情况对15例抗-HBe阳性慢性肝炎患者进行了肝细胞内HBV DNA原位杂交分析。发现其HBV感染状态可分为3种类型;①HBV活动复制型(4例,26.7％),肝内HBV DNA、HBsAg、HBcAg三者或HBsAg、HBcAg阳性;②HBV不完全复制或表达型(8例,53.3％),肝内HBV DNA、HBsAg阳性;③HBV非复制型(3例,20.0％),肝内HBV DNA及HBV标志均阴性。提示:在血清HBeAg向抗-HBe转换的病例中,HBV感染状态不尽相同,部分患者仍存在HBV活动性复制,少数病例的HBV复制已停止,半数病例处于由活动性复制相向非复制相过渡阶段。     

80例恶性淋巴瘤患者合并乙型肝炎病毒感染的临床分析

目的探讨恶性淋巴瘤患者中乙型肝炎病毒（HBV）的感染率及其与化疗后肝功损害发生和严重程度关系。方法对80例初诊恶性淋巴瘤患者不同性别、年龄、分期、分型中HBV感染进行评价,比较HBV感染的患者与非感染患者在治疗过程中及治疗后肝功损害情况。结果 80例恶性淋巴瘤伴HBV感染者（HbsAg阳性）15例（占18.75%）,男性感染率较女性高,30~60岁组感染率最高,伴HBV感染患者几乎均为非霍奇金淋巴瘤（NHL）患者,分期间感染率差别不大,B细胞与T细胞来源患者间HBV感染无明显差异;伴有HBV感染的恶性淋巴瘤患者化疗过程中肝功损害常见,且程度较严重。结论 NHL伴HBV感染率高,化疗后肝功损害发生率高,提早给予抗HBV病毒治疗可控制HBV复制,同时减轻化疗后肝功损害,为淋巴瘤患者正规治疗提供保障。     

中国人群HBV感染与原发性肝癌关系病例对照研究的Meta分析

目的探讨中国人群乙型肝炎病毒(HBV)感染状态与原发性肝癌的关联程度，为预防决策提供依据。方法采用Meta分析法，对51篇关于HBV感染与原发性肝癌关系的病例对照研究进行定量综合分析。结果HBV感染与原发性肝癌呈高度关联(OR=11．34)，其中HBsAg、Anti．HBc-IgM与原发性肝癌的关联程度最高(OR分别为13．15和12．37)，其次为Anti—HBc(OR=8．50)，HBeAg与原发性肝癌的关联程度高于Anti—HBe(OR=4．36 vs 2．49)，Anti—HBs与原发性肝癌关系的合并OR值小于1(OR=0．24)。结论HBV感染是原发性肝癌的危险因素，HBV现正感染、病毒复制活跃者发生原发性肝癌的危险性较大。慢性HBV感染者出现Anti-HBc—IgM阳性要警惕原发性肝癌的发生，Anti-HBs是降低原发性肝癌发生风险的保护性因素。     

257例非霍奇金淋巴瘤患者乙型肝炎病毒感染分析

目的探讨恶性淋巴瘤患者中乙型肝炎病毒(HBV)的感染率及其与化疗后肝功能损害发生和严重程度的关系。方法对257例初诊恶性淋巴瘤患者不同性别、年龄、分型中HBV感染进行评价;随机抽取恶性肿瘤257例(肝癌除外)和健康志愿者100例,比较HBV感染与非感染患者在治疗过程中及治疗后肝功能损害的情况。结果非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者的HBV感染率远高于其他肿瘤患者及正常健康人群;而其他肿瘤患者与健康人群之间无明显差异(P<0.05)。B细胞NHL的HBV感染率均明显高于健康人群;T细胞NHL与健康人群无明显差异,B细胞性NHL患者的HBV感染率明显高于T细胞性NHL,HBsAg阳性者和HBcAb阳性者化疗后肝功能损伤发生率明显高于HBsAg阴性组(P<0.05)。结论化疗后肝功能损伤比较,HBsAg及HB-cAb阳性者化疗后肝功能损伤发生率明显高于阴性者,HBsAg阳性者应提前给予抗HBV病毒治疗,可减轻化疗后肝功能损害;HBcAb与NHL最为密切。     

Awareness and knowledge of hepatitis B infection and prevention and the use of hepatitis B vaccination in the Hong Kong adult Chinese population

Background  Hepatitis B virus (HBV) infection remains a global public health problem and it is an important cause of acute, chronic and fulminant hepatitis, liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The prevalence of HBV infection in Hong Kong over the past decade remained unchanged at 10%, despite the implementation of universal neonatal and availability of adult vaccination. We suspect that the current state of affairs is attributable to inadequate awareness and knowledge of HBV transmission and prevention in the general population, resulting in a low rate of uptake of HBV vaccination by the lay public. Therefore, we have embarked in this study to evaluate the awareness and knowledge on HBV infection in our local Chinese population, their attitude on the prevention of horizontal transmission of HBV, and the use of HBV vaccination, especially in those who were born before the era of universal neonatal vaccination.

Methods  The factors associated with HBV screening, vaccination uptake, and knowledge were examined in a face-to-face questionnaire survey on a group of adult Chinese in Hong Kong.

Results  Within this group, 14% was considered to have good knowledge for HBV infection, and 26% had HBV vaccination. Age, occupation, having children, and family monthly income, are independent factors associated with vaccination.

Conclusion  This study suggests insufficient public awareness of HBV infection in the Hong Kong Adult Chinese population.

     

白细胞介素2增强HBV基因疫苗的免疫效应

目的：构建乙型肝炎病毒基因疫苗ｐＣＲ３．１－Ｓ,观察重组人白细胞介素２（ｒｈＩＬ－２）作为佐剂对其诱导ＮＡＬＢ／ｃ小鼠产生免疫应答的影响．方法：以ＥＬＩＳＡ法检测免疫小鼠血清抗ＨＢｓ,另用＾３Ｈ－ＴｄＲ参入法测定淋巴细胞增殖活性,初步研究不同免疫组的体液和细胞免疫应答．结果：ｒｈＩＬ－２组免疫小鼠抗ＨＢｓ抗体和淋巴细胞增殖活性与对照组相比有显著差异（Ｐ〈０．０５）．结论：ＨＢＶ基因疫苗可诱发ＢＡＬ