不同诱导条件下大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的比较研究

目的探讨不同诱导条件对大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）向心肌样细胞分化的影响。方法分离培养大鼠MSCs,将第4代经鉴定证实的MSCs随机分成4组：血管紧张素II（AngiotensinII,AngII）诱导组（含不同浓度3个亚组）、心肌细胞裂解液诱导组、AngII＋心肌细胞裂解液共同诱导组及空白对照组,并进行定向诱导,观察细胞形态学变化,采用免疫细胞化学法对分化细胞进行鉴定并计算阳性细胞转化率。结果除对照组外,其余各组经诱导培养4周后的细胞形态均有改变,且都表达心肌特异性肌钙蛋白I（Cardiac-specific troponin I,cTnI）及间隙连接蛋白43（Connexin-43）,但表达率不同,共同诱导组较其余各组形成的克隆、肌管结构多,细胞转化率较高（P〈0.05）,AngII单独诱导时以0.2 mol/L组诱导效果最佳（P〈0.05）。结论 AngII和心肌细胞裂解液均可将MSCs定向诱导分化为心肌样细胞,二者联合应用转化率更高。在一定浓度范围内,单独应用AngII诱导,诱导剂浓度越高,转化率越高。     

兔骨髓间充质干细胞向神经元的诱导分化

目的 :探讨兔骨髓间充质干细胞 (bonemarrowmesenchymalstemcells ,BM -MSCs)向神经元定向诱导分化及分化前后体外培养的条件。方法 :无菌条件下收集兔股骨骨髓 ,用相对密度为 1 0 77的淋巴细胞分离液分离出白膜层细胞群 ,贴壁法筛检其中的MSCs ,用DMEM H条件培养基进行原代及传代培养。分别取 5和 10代的MSCs向神经元定向诱导。诱导后更换为神经培养基继续培养 ,并在 1～ 2 0d用免疫细胞化学方法检测分化细胞的特异性表面标志。结果 :兔骨髓MSCs在DMEM H条件培养基中建立高纯度的细胞培养 ,能够稳定地连续传代达 10代以上。不同代数的MSCs诱导后均表达巢蛋白 (nestin)和神经特异性烯醇化酶 (neuron specificenolase ,NSE)。诱导后NSCs在神经培养基中继续存活 2 0d以上 ,但未见扩增。结论 :兔骨髓MSCs能够诱导表达神经元特异性标志 ,且诱导前后的MSCs均可在体外培养条件下存活。     

银杏内酯B对骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的影响

目的 探讨银杏内酯B对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化的影响.方法 从成年Wistar大鼠骨髓中分离MSCs,并接种于6孔培养板中传代培养.在第5代培养的MSCs中分别加入20,40,80 mg/L银杏内酯B到含10%胎牛血清的L-DMEM培养基中进行分化诱导,并设空白对照组.诱导7 d后光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志.结果 不同浓度银杏内酯B组分化为NSE阳性神经元样细胞的百分率都比对照组高,但不同浓度之间差异无显著性.而不同浓度银杏内酯B组分化为GFAP阳性星形胶质样细胞的比率不仅比对照组高,并随其浓度的增加而增高.相反,不同浓度的银杏内酯B对Oligo4阳性少突胶质样细胞的分化影响不大.结论 不同浓度的银杏内酯B可促进MSCs向神经样细胞分化.     

大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性及分化潜能研究

目的建立一种体外分离、培养和扩增大鼠骨髓间充质干细胞的方法.探讨体外培养骨髓间充质干细胞的一些生物学特性,为利用MSCs进行多种疾病的细胞治疗提供实验基础. 方法分离6～8周龄的大鼠胫骨、股骨,用DMEM/F12培养基冲出骨髓,采用Percoll淋巴细胞分离液获得骨髓中的单个核细胞,并结合MSCs的贴壁特性,获得大鼠MSCs,体外扩增.体外进行多向诱导分化鉴定分离的细胞,并测定传代细胞的生长曲线、观察其接种贴壁率、检测细胞周期和超微结构.结果体外培养的MSCs生长状况良好,并能迅速扩增,具有分化形成成骨和成脂肪细胞的能力;MSCs倍增时间约为28.8h;传代后10h贴壁达95.5% 以上;细胞周期显示有92%细胞处于G0/G1期;电镜显示的结果进一步证实MSCs具备了干细胞的结构特点.结论在本实验条件下,体外培养的MSCs具有多向分化潜能,体外生长稳定,传代后的细胞适应性强,增殖较快,超微结构和细胞周期表现出较早期细胞特点.使干细胞用于移植治疗、基因治疗成为可能.     

兔骨髓间充质干细胞体外软骨向诱导的实验研究

目的:体外分离培养兔骨髓间充质干细胞(MSCs),并定向诱导其向软骨细胞表型分化。方法:抽取兔股骨骨髓,经密度梯度离心与贴壁培养分离得到MSCs。用含有TGF-β、b-FGF、胰岛素、维生素C、转铁蛋白等的DMEM/Ham′s-F12培养基进行软骨向诱导。通过形态学观察,阿辛蓝-PAS特染及Ⅱ型胶原免疫组化染色,鉴定经过诱导后细胞的软骨细胞的表型。结果:兔MSCs原代细胞呈梭形,克隆样生长,经过诱导培养7d后,细胞形态由梭形、多角形变为椭圆形,胞浆丰富,细胞核和核仁清晰可见。阿辛蓝-PAS和Ⅱ型胶原染色阳性。结论:密度梯度离心与贴壁培养两种方法相结合可获得相对高纯度的MSCs,该细胞经诱导后可向软骨细胞分化。     

5-氮杂胞苷对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖及成肌分化的影响

[目的]观察5-氮杂胞苷(5-Aza)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外增殖和成肌分化的影响.[方法]无菌条件下取SD大鼠骨髓组织,采用密度梯度离心法分离大鼠MSCs,传3代后的MSCs采用双标免疫组化法鉴定后,随机分为4组:浓度为5、10、15μmol/L的5-Aza组和空白对照组,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度5-Aza对MSCs生长增殖的影响;以含5、10、20μmol/L5-Aza的培养基诱导培养MSCs 24 h后,改用完全培养基继续培养,采用免疫组织染色法鉴定5-Aza诱导分化3、7、14d后细胞肌分化相关蛋白肌凝蛋白(myosin)和结蛋白(desmin)的表达情况.[结果]双标免疫组化染色结果显示:所培养细胞同时表达Brdu和CD44、CD54,表达率达96%,鉴定结果表明所培养细胞为MSCs;5、10μmol/L5-Aza对MSCs增殖无显著影响(P>0.05),15μmol/L5-Aza可显著抑制MSCs生长(P<0.05);不同浓度5-Aza诱导培养MSCs后第3天,部分细胞出现desmin阳性表达,诱导后14 d,部分细胞表达myosin,以10μmol/L5-Aza组作用为佳.[结论]高浓度5-Aza可抑制MSCs体外增殖;适宜浓度的5-Aza可诱导MSCs向成肌细胞定向分化.     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与多向分化鉴定

目的:建立体外分离、培养及纯化大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的方法,并对细胞进行形态学观察、表面标志物鉴定及分化潜能检测,为大鼠MSCs进行细胞移植治疗脑损伤的研究奠定基础。方法:用全骨髓贴壁培养法分离、培养、纯化大鼠MSCs,倒置相差显微镜进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞表面标记物,定向诱导向成脂、成骨方向分化。结果:72小时首次全量换液7天后观察可见呈放射状排列的细胞集落,以梭形细胞为主,细胞规则、生长旺盛,可连续传代10代以上;取3代MSCs流式细胞仪检测,CD90呈阳性表达,CD34、CD45均呈阴性表达;细胞传代后加入成脂、成骨诱导剂定向诱导分化,油红O染色及茜素红染色均呈阳性。结论:全骨髓贴壁筛选培养法可大量分离、纯化、扩增大鼠MSCs。经诱导鉴定MSCs具有多项分化潜能。     

人骨髓间充质干细胞分离培养及多向分化的实验研究

目的:探索体外分离子与培养人骨髓间充质干细胞的方法,同时研究其细胞生物学特性,分析其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法:分离人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stemcells,hBMSCs),通过常规培养,在体外观察其生长特性、抗原表达等特征;然后通过条件培养基定向诱导,观察其分化潜能。结果:人骨髓间充质干细胞在体外可以大量增殖,常规培养条件下,原代培养需要2～3周,转代后生长速度加快;应用流式细胞仪检测MSCs的表面抗原,CD44、CD29、CD105阳性,CD45、CD06、CD34以及HLA-DR阴性;在相应条件培养基的诱导作用下,MSCs可以分化为成骨细胞、软骨细胞以及神经细胞。结论:人骨髓间充质干细胞可以从骨髓中分离并在体外培养增殖,同时在体外具有多向分化潜能,可以分化成为骨细胞,符合骨组织工程种子细胞的要求。     

大鼠骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的初步研究

目的体外分离培养骨髓间充质干细胞,并探索表皮细胞生长因子诱导MSCs分化的潜能及条件.方法采用直接贴壁法,分离培养大鼠股骨和胫骨骨髓间充质干细胞,应用免疫细胞化学法检测细胞CD44、CD106、CD29、CD90、CD34等,对分离的细胞进行鉴定.以10～40 ng/ml的表皮生长因子处理第3代MSCs,观察细胞角蛋白的表达.用Western blot方法摸索integrin β1的表达与MSCs分化状态的关系.结果原代培养的骨髓间充质细胞CD44、CD106、CD29、CD90免疫细胞化学染色为阳性,CD34为阴性,符合骨髓间充质干细胞特征.MSCs经不同浓度的EGF体外诱导7 d后,免疫细胞化学结果显示,EGF浓度为30 ng/ml和40 ng/ml时,细胞角蛋白出现阳性表达;体外诱导14 d,呈角蛋白染色阳性的细胞比例进一步增加,同时integrin β1表达量下降.结论体外培养的MSCs在EGF诱导下,具有分化为表皮细胞的倾向,同时integrin β1可能在MSCs分化中具有一定的作用.     

骨髓间充质干细胞分离方法的实验研究

目的 以不同方法分离骨髓间充质干细胞(MSCs),探讨原代培养MSCs的分离方法间的优劣.方法 用Percoll、Ficoll分离液分离法及直接种植法分离骨髓中的单个核细胞,在含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液中培养,观察原代培养MSCs形态学间的差异.结果 采用Percoll分离液分离MSCs,可以获得形态均一性较好的同源细胞群.Ficoll分离液分离法和直接种植法获得的细胞均一性较差,含有较多杂细胞.结论 采用Percoll分离液分离骨髓成分,可以获得同源性良好的MSCs.     

体外诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化及凋亡的研究

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞体外向神经细胞诱导分化的潜能,及分化后的凋亡情况?方法:体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,用含有表皮生长因子(EGF),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的诱导培养基对第三代MSCs进行诱导分化,诱导分化的细胞按分化时间3?7?14 d分成A?B?C三组?三组诱导分化细胞分别进行NSE免疫组织化学,MAP2免疫荧光化学以及TUNEL凋亡细胞检测?结果:A?B?C三组细胞在细胞形态上与神经细胞相似,并且表达神经细胞特异性标记抗原NSE?MAP2,但是C组细胞表达强度弱于B组,并且阳性细胞比例少于B组(P < 0.05)?A?B?C三组TUNEL凋亡阳性细胞比例呈逐渐增多趋势(P < 0.05)?结论:含有表皮生长因子(EGF),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的诱导培养基可以诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化,随着诱导时间的推移,分化细胞状态下降,凋亡比例增多?     

增龄对大鼠骨髓基质细胞分化的影响

目的 对比研究3、6、9、12个月龄大鼠的骨髓基质细胞(marrow stromal cells,MSCs)成骨与成脂肪能力的变化。方法 培养液中分别加入成骨、成脂肪诱导剂,在不同时间行细胞化学染色观察3和12个月龄两组大鼠MSCs的成骨与成脂肪能力的变化;采用RT-PCR法分别检测3、6、9、12个月龄大鼠的MSCs的I型胶原mRNA和脂蛋白脂酶mRNA水平的变化。结果成骨诱导1周后,12个月龄大鼠的MSCs对照与诱导组碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)表达阳性率均低于3个月龄大鼠的同组细胞。成骨诱导12d后,3个月龄大鼠组的MSCs先于12个月龄大鼠组形成钙化。成脂肪诱导第2天,12个月龄大鼠组的MSCs先于3个月龄大鼠组MSCs生成脂滴。RT-PCR检测显示I型胶原mRNA水平随月龄增长表达降低,且随诱导时间延长降低幅度变大;脂蛋白脂酶的mRNA水平随月龄增长表达增加,随诱导时间延长增加幅度变大。结论 大鼠的MSCs随月龄增长成骨能力降低,成脂肪能力增强。     

骨髓间充质干细胞在梗死心肌移植再生后nesprin蛋白表达的实验研究

目的:研究骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植到急性心肌梗死区心肌样细胞再生后nesprin蛋白的表达情况.方法:大鼠16只,随机分为实验组和对照组,每组8只.利用密度梯度分离法和贴壁培养MSCs,流式细胞仪检测MSCs表面相关抗原、DAPI标记MSCs备用;SD大鼠开胸手术结扎心脏冠脉左前降支建立心肌梗死模型,并在实验组梗死区注射MSCs,对照组注射DMEM;术后3周取梗死区心肌,利用免疫细胞学化学方法鉴定肌节肌动蛋白和肌钙蛋白的表达,免疫荧光技术和蛋白质印迹鉴定nesprin蛋白在MSCs移植后的表达.结果:MSCs移植到梗死缺血区3周后可以用DAPI示踪、并有心肌细胞特异蛋白呈阳性表达;免疫荧光和蛋白质印迹鉴定在MSCs移植前后有nesprin蛋白的表达,移植后出现nesprin蛋白表达量的增加.结论:MSCs在梗死心肌内移植具有分化再生的能力,nesprin蛋白在MSCs移植后出现表达量的增加,可能在MSCs分化为心肌细胞样过程中起到一定的作用.     

bFGF促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经元转化及机制

目的探讨碱性成纤维生长因子对大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元的作用及信号通路.方法利用bFGF与不同生长因子和化学诱导剂组合诱导间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向神经元转化,观察分化过程中细胞形态、数目的变化,观察免疫细胞化学检测分化后细胞神经细胞标志蛋白和部分神经功能相关蛋白以及FGFR的表达情况,并计算转化率.结果①3组不同条件诱导后,MSCs均能分化为具有典型神经元形态的细胞,并明显表达NSE、MAP2和5-HT1D,但不表达GFAP;②bFGF预诱导组的转化率明显高于未预诱导组;③诱导后的神经元样细胞FGFR3表达明显增强.结论以DMSO和BHA为基础诱导剂,bFGF预处理可明显提高MSCs跨胚层分化为神经元样细胞的转化率,浓度为10 ng/ml的bFGF主要是通过FGFR3作用于MSCs.     

体外条件下蜕皮甾酮对大鼠脐带间充质干细胞增殖的实验研究

目的:研究体外条件下蜕皮甾酮(ecdysterone,EDS)对于大鼠脐带间充质干细胞增值活性的影响。方法：采用胶原酶消化法分离培养大鼠脐带间充质干细胞,并通过动态观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面抗原加以鉴定;取第3代脐带间充质干细胞分别在基础培养基(DMEM-LG培养基、10%的胎牛血清、100U/ml青/链霉素、2mmol/L L-谷氨酰胺)中加入不同浓度（0、25、50、100、150、200μg/ml）EDS予以干预,分别于第1、3、5、7天MTT法检测细胞增殖活性;另外,设置相同分组EDS干预培养大鼠脐带间充质干细胞7天,绘制细胞生长曲线。结果：采用酶消化法能有效分离纯化大鼠脐带间充质干细胞。细胞细胞流式仪鉴定显示,第3代细胞阳性表达CD44、CD90,阴性表达CD34、CD45。实验采用MTT法检测大鼠脐带间充质干细胞活力,结果显示经EDS干预培养的大鼠脐带间充质干细胞生长状态良好,在细胞活力方面较空白对照组有明显差异(P<0.05),EDS 100μg/ml、150μg/ml及200μg/ml三组细胞活性比较无显著差异(P>0.05),其他实验组之间无统计学意义(P>0.05)。细胞生长曲线同样显示EDS实验组可有效促进干细胞的增殖,缩短细胞倍增时间,此作用在EDS浓度为100μg/ml时达到最佳。结论：体外条件下,EDS对大鼠脐带间充质干细胞具有促增殖作用,该作用在EDS浓度为100μg/ml时较为显著,不再随浓度的增加而增强。这有望成为促进脐带间充质干细胞增殖的新方法。     

缺血性脑损伤的骨髓间质干细胞移植治疗研究

目的:研究骨髓间质干细胞(MSCs)移植对大鼠缺血性脑损伤的治疗作用及机制。方法:采用线拴法制作成年雄性Sprague-Dawleye大鼠脑缺血再灌注模型40例,随机分成磷酸盐缓冲液(PBS)对照组和MSCs移植治疗组。在1w后分别经颈外动脉将标记5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu)的2×106MSCs悬液和等体积PBS液植入脑缺血大鼠体内。术后每天采用神经功能缺损评分检测大鼠神经系统功能,大鼠脑缺血再灌注后1w、2w、3w、4w分别取受损伤脑组织,HE染色,并在不同时间点行体感诱发电位与组织病理学检测。结果:MSCs移植治疗组在移植后各时间点神经功能缺损评分(1W:9.77±2.54;2W:7.31±1.88;3W:6.97±2.46;4W:4.89±1.14)均明显低于PBS对照组(1W:15.78±2.65;2W:14.42±3.23;3W:11.42±3.30;4W:9.82±2.19)(P<0.05);与PBS对照组相比,大鼠脑组织病理学检查显示,MSCs治疗组神经细胞变性坏死的数量减少,水肿明显减轻,体感诱发电位在各时间点恢复显著(P<0.05);MSCs治疗组各时间点在梗塞半球有大量Brdu阳性细胞,对侧半球仅可见少量Brdu阳性细胞,主要存在于大脑皮质、皮质下和海马等处,在血管内皮细胞处也可见到Brdu阳性细胞;MSCs治疗组脑源性神经营养因子(BDNF)的表达水平在2W、3W、4W明显高于PBS对照组(P<0.05)。结论:经颈动脉移植MSCs可在大鼠脑内存活、迁移,分泌BDNF等神经保护性因子,减轻缺血性脑损伤,促进神经功能的恢复,对治疗缺血性脑损伤有一定效果。     

体外培养大鼠骨髓间充质干细胞成骨基因表达谱的检测

目的:探讨体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)成骨相关基因的表达谱,明确体外培养大鼠骨髓MSC的成骨潜能。方法:体外培养SD大鼠骨髓MSC,取第3代细胞提取总核糖核酸(RNA),制备杂交探针,并运用SuperArray公司提供的大鼠Oligo GEArray骨再生基因芯片(每张芯片可测113种基因)进行杂交,化学发光检测,通过X线胶片或台式扫描获得化学发光的芯片图像,使用网上提供的综合型GEArry表达分析配套软件(GEArryExpression Analysis Suite)进行完整的芯片数据分析。结果:检测体外培养大鼠骨髓MSC的113种成骨相关的基因,其中有31种基因表达强度较低,45种基因呈中等强度表达,37种基因表达强度较高。结论:体外培养大鼠骨髓MSC具有部分成骨细胞基因表型特征,但成熟成骨细胞的特征基因表达量较低,提示大鼠MSC是具有较强成骨细胞分化潜能的成纤维样细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导条件下的成骨特性

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在诱导条件下的成骨特性.方法:使用密度梯度法分离成年大鼠骨髓MSCs,以地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C为成骨诱导剂.结果:形态学表明,MSCs贴壁细胞呈集落生长,有成纤维细胞外观.地塞米松低剂量组诱导7 d后碱性磷酸酶(alkalian phosphatase,ALP)表达明显升高,阳性细胞数为(15.1±2.6)个,而对照组ALP表达较弱,阳性细胞数为(12.0±3.5)个,两组比较P 《0.01.地塞米松成骨诱导剂低剂量组促进MSC成骨,在诱导7d时即出现钙化结节,而对照组未出现;地塞米松低剂量组诱导21 d钙化结节为(9.0±1.7)个,而对照组为(2.0±1.8)个,两组比较P《0.01.结论:低剂量地塞米松成骨诱导剂能诱导MSC向成骨细胞分化,可以为体内骨组织工程提供种子细胞.     

间充质干细胞海马移植对糖尿病大鼠PSA-NCAM的影响

目的:探讨间充质干细胞在糖尿病大鼠海马的移植对多唾液酸-神经细胞粘附分子(Polysialylated acid-nural cell adhesion molecule,PSA-NCAM)的影响.方法:将30只SD大鼠随机分为正常对照组、糖尿病组、干细胞移植组.建立STZ糖尿病大鼠模型.原代培养大鼠骨髓间质干细胞,分离纯化鉴定后移植入糖尿病大鼠海马部位,杀鼠取海马,用PSA-NCAM单克隆抗体及采用RT-PCR的方法检测海马中PSA-NCAM的水平,并与糖尿病对照组及正常组加以比较.结果:移植组与糖尿病组比较,PSA-NCAM蛋白和mRNA(P=0.0137)表达均增加,但显著低于正常组(P＝0.15).结论:间充质干细胞海马移植增加海马中PSA-NCAM的表达.     

心肌细胞对骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的影响

目的：观察大鼠成体心肌细胞对骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）定向分化的诱导作用。方法：应用Percoll’s密度梯度离心法分离培养大鼠MSCs，传2代后用流式细胞术检测其表面CD34,CD71和CD90的表达，然后用Lipofectamine2000介导pEGFP-N3转染标记MSCs。将GFP标记的MSCs与新鲜分离的成体大鼠心肌细胞分别按接触、非接触（MILLICELLTM-HA半透膜分层培养）及心肌细胞条件培养液培养。1周后应用免疫荧光检测MSCs α-actin，desmin和cTnT的表达。结果：接触培养组中可见表达GFP的MSCs细胞同时表达α-actin,desmin和cTnT，而分层培养组及条件培养组中均未见α-actin，desmin和cTnT的表达。结论：大鼠成体心肌细胞与MSCs接触培养，可能诱导MSCs分化为心肌细胞。