Expression of Endothelial Nitric Oxide Synthase Traffic Inducer in the Placenta of Pregnancy Induced Hypertension

Endothelial nitric oxide synthase traffic induc-er(NOSTRIN),a58kD(1kD=0.9921ku)pro-tein with complete unknown function that was i-dentified using the yeast two-hybrid system byZi mmermannet al[1],and Zi mmermann demon-strated that NOSTRIN over-expression induced aprofound redistribution of eNOS fromthe plasmamembrane to vesicle-like structures matching theNOSTRIN pattern and at the same ti me led to asignificant inhibition of NO release[1].WhetherNOSTRIN do involve in the mechani…     

非诺贝特对LPC诱导脐静脉内皮细胞增殖、凋亡及eNOS基因表达的影响

目的：探讨非诺贝特对LPC诱导的脐静脉内皮细胞增殖、凋亡及内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因表达的影响。方法：体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs），根据非诺贝特不同浓度分为正常对照组、LPC组、低浓度非诺贝特（10μmol／L）组、中浓度非诺贝特（50μmol／L）组、高浓度非诺贝特（100μmol／L）组，根据非诺贝特不同干预时间分为正常对照组、LPC组、非诺贝特（50μmol／L）干预6h组、12h组、24h组、48h组进行实验。分别观测不同浓度及不同时间非诺贝特内皮细胞增殖、凋亡、NO浓度及eNOS mRNA表达的变化。结果：与正常对照组比较，LPC抑制内皮细胞增殖，促进细胞凋亡，并使HUVECs eNOS mRNA表达降低，NO合成减少。非诺贝特可干预LPC对内皮细胞的作用，使内皮细胞增殖增强，细胞凋亡减少，eNOS mRNA表达升高，NO合成增加，且其作用呈时间-效应、浓度-效应依赖关系。结论：非诺贝特可改善LPC对HUVECs的影响，使内皮细胞增殖增强，凋亡减少，eNOS mRNA表达升高，NO合成增加，从而起到抗动脉硬化作用。     

牙龈卟啉单胞菌促进人脐静脉内皮细胞一氧化氮的生成

目的:观察牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelialcells,HUVEC)一氧化氮(NO)生成的影响,探讨Pg对内皮细胞功能损伤的途径,以期为牙周病在动脉粥样硬化发病机制中的作用提供依据.方法:用感染复数(multiplicity of infection,MOI)1∶10、1∶100Pg干预HUVEC,未受Pg干预的HUVEC作为阴性对照组,分别于4、8、12、24 h时收集细胞上清液,利用硝酸还原酶法测定细胞上清液中NO的浓度:Western.blot检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达水平;透射电镜观察Pg对HUVEC的黏附和入侵方式.结果:在24 h内,PgMOI 1∶10、1∶100能促进HUVEC NO的生成,与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),PgMOII∶10,MOII∶100可以诱导HUVEC iNOS的蛋白表达,抑制eNOS的蛋白表达,与阴性对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05),透射电镜观察Pg能够利用其菌毛黏附于HUVEC细胞表面并入侵到HUVEC细胞胞质内,定植于细胞内.结论:Pg能够黏附于HUVEC并入侵到细胞胞质内,诱导iNOS蛋白表达,抑制eNOS的蛋白表达,最终促进HUVEC NO的生成.过量的NO可能发挥细胞毒性作用,导致内皮功能失调.     

低糖诱导人脐静脉内皮细胞一氧化氮与活性氧变化的研究

目的观察低浓度葡萄糖对人脐静脉内皮细胞一氧化氮(NO)与活性氧(ROS)变化的影响。方法以体外培养人脐静脉内皮细胞株HUVEC-12为研究对象,将实验分为正常对照组(5.5mmol/L葡萄糖)、低糖组(2.8mmol/L葡萄糖)、无糖组(0mmol/L葡萄糖)。分别用2.8、0mmol/L葡萄糖干预HUVEC-12细胞,经过1、2、4、12h后,硝酸还原酶法测定NO产量,化学比色法测定一氧化氮合成酶(NOS)活性,Dihydroethidium荧光探针法测定细胞内ROS水平。结果与正常对照组相比,低糖组与无糖组NO水平降低(P<0.01),NOS活性下降(P<0.01),细胞内ROS水平升高(P<0.01),均呈剂量依赖关系。同一浓度组内随着时间的延长,内皮细胞NO水平、NOS活性进一步降低(P<0.01),ROS水平进一步升高(P<0.05),各指标都具有浓度和时间依赖性。结论低糖可导致内皮细胞功能障碍,NO水平降低,NOS活性下降,其机制可能与低糖导致内皮细胞氧化应激损伤有关。     

他汀类药物对培养的血管内皮细胞VEGF和bFGF等因子表达的影响

目的观察Pitavastatin对血管内皮细胞VEGF、bFGF等因子表达的影响,探讨他汀类药物可能具有的独立于血脂调节作用以外的促血管新生作用.方法体外培养HUVEC,加入不同浓度的Pitavastatin后用蛋白印迹杂交法检测VEGF,bFGF,p-Akt及p-eNOS蛋白表达水平;镉还原Griess测定培养基中NO含量.结果在培养的HUVEC中加入Pitavastatin后,VEGF,bFGF,p-Akt及p-eNOS蛋白呈现高表达,培养基中NO含量明显增高.结论 Pitavastatin能诱导内皮细胞VEGF,bFGF,p-Akt及p-eNOS蛋白的表达及增加NO含量,推测其可能通过VEGF-p-Akt-eNOS(NO)径路而发挥非调脂的作用.     

人脐静脉内皮细胞的原代培养

目的建立一种能大量分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC)且操作方便的体外培养方法。方法采用不同浓度的Ⅱ型胶原酶(0.05%,0.1%和0.2%)对HUVEC进行灌注,并分别孵育不同的时间(10min,13min,15min和18min)进行消化,观察细胞的形态、数量以及生长融合情况。结果采用0.1%的胶原酶消化10-13min为最佳条件,经光学显微镜观察培养的细胞数量较多,生长、繁殖状态良好,培养3d左右细胞可达到融合状态。结论本实验建立的胶原酶法消化HUVEC培养方法简便,细胞获得量较多且生长状态良好。     

异丙酚对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞内皮源型一氧化氮合酶基因启动子转录活性的影响

目的 探讨异丙酚对脂多糖(LPS)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)内皮源型一氧化氮合酶(heNOS)基因启动子转录活性的影响.方法 以基因重组技术构建heNOS基因启动子区(-1～-1600 bp)驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL2-Basic,得到质粒peNOS-Luc.采用脂质体介导的细胞基因共转染技术将peNOS-Luc、空载体pGL2-Basic和?-半乳糖苷酶表达质粒pCMV-?共转染HUVEC,用LPS、LPS 异丙酚和LPS 转移生长因子?1(TGFb1)分别刺激转染后的HUVEC,检测并比较荧光素酶/?-半乳糖苷酶活性,以确定LPS、异丙酚和TGF?1对heNOS基因启动子转录活性的影响.结果 (1)酶切和测序结果均证实重组载体peNOS-Luc构建正确;(2)重组载体peNOS-Luc在HUVEC中有效表达;(3)与未加刺激组比较,LPS刺激组heNOS启动子的转录活性降低.与LPS刺激组比较,LPS 异丙酚和LPS TGF?1组heNOS启动子的转录活性增强.结论 异丙酚能明显增强heNOS基因启动子的转录活性,可初步证实异丙酚在转录水平通过上调heNOS基因启动子的转录活性而影响NO的生成和释放,这可能是异丙酚防治LPS诱导引起炎症反应的机制之一.     

金黄色葡萄球菌诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的观察

目的观察人脐静脉内皮细胞株ECV．304对金黄色葡萄球菌（S．aureus）感染的反应。方法常规方法制备金黄色葡萄球菌悬液,以1：1、1：10和1：100的感染复数感染ECV．304细胞1、3、6、12h和24h后,估算细胞吞噬细菌数,采用Hoechst33258染色,DNAladder及细胞凋亡相关因子RT．PCR检测细菌感染后细胞凋亡情况。结果金黄色葡萄球菌感染复数越高,细胞内吞噬的活细菌数越多。金黄色葡萄球菌感染导致ECV-304细胞发生凋亡,凋亡具有时间依赖性,随着感染时间的延长,凋亡小体增多,DNA片段也随之增多。抗凋亡细胞因子Bcl2mRNA表达量随着感染时间的延长下降,而促凋亡细胞因子Bax和Caspase．3表达量增多。结论金黄色葡萄球菌感染ECV-304细胞后,通过下调抗凋亡细胞因子Bcl2、上调促凋亡细胞因子Bax和Caspase-3诱导细胞凋亡。金黄色葡萄球菌感染内皮细胞的可能致病机制为临床治疗提供了实验依据。     

尼古丁对人脐静脉内皮细胞凋亡及坏死的影响

目的不同浓度尼古丁对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡及坏死的影响。方法用CD34以免疫组织化学法鉴定HUVECs。通过3种不同浓度的尼古丁(3、30、300 ng/ml)刺激HUVECs 24 h后,用流式细胞仪检测其凋亡及坏死率。结果低浓度尼古丁促进细胞凋亡最强,而随着尼古丁浓度的增加,细胞凋亡率反而逐渐降低,各组差异具有统计学意义(P<0.05);此外,随着尼古丁浓度增加,细胞坏死率也日益增多,各组差异具有统计学意义(P<0.05)。细胞坏死率与尼古丁浓度呈正相关(r=0.675)。结论尼古丁对HUVECs凋亡的影响具有浓度依赖性,细胞坏死率与尼古丁浓度呈正相关。     

一种改进的人脐静脉内皮细胞的培养方法

目的:建立稳定的人脐静脉内皮细胞分离和培养的方法. 方法:采用胰蛋白酶/胶原酶(1∶1)混合酶液消化法培养人脐静脉内皮细胞,简化完全培养液组分(不添加血管内皮细胞生长因子、肝素等辅助因子),当原代培养细胞80%以上汇合后用胰蛋白酶消化传代;用形态学、免疫细胞化学法进行鉴定. 结果:种植在培养瓶中的内皮细胞4h贴壁生长,48～96 h生长最快,7～10 d汇合. 内皮细胞呈单层铺路石样外观,Ⅷ因子相关抗原(Ⅷ:Ag)和内皮细胞生长因子受体2(KDR)鉴定内皮细胞纯度达95%以上. 结论:用混合酶液灌注脐静脉消化内皮细胞是获取内皮细胞的一种好方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型.     

高糖对人脐静脉内皮细胞GSH-PX活力、NOS及ICAM-1表达的影响

目的:探讨体外培养条件下高糖状态对血管内皮细胞的影响。方法:培养人脐静脉内皮细胞株ECV3 0 4,分为对照组和高糖组,用分光光度比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH PX)活力,RT- PCR法检测细胞间粘附分子1(ICAM- 1)mRNA水平,免疫细胞化学法观察内皮细胞型一氧化氮合酶(eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的蛋白表达。结果:高糖组GSH- PX活力明显下降,eNOS、iNOS蛋白表达明显增高,ICAM- 1mRNA水平也显著上升。结论:在较短时间内糖浓度升高可引起血管内皮细胞GSH PX活力下降,ICAM -1mRNA、eNOS和iNOS蛋白表达增高,对糖尿病血管病变早期进展起一定的作用。     

法舒地尔对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的影响

目的:观察法舒地尔对脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤的影响,探讨其作用机制.方法:用0.1%的Ⅰ型胶原酶消化分离HUVECs,加入内皮细胞完全培养基中培养,采用胰蛋白酶进行消化传代培养,倒置显微镜下观察细胞形态并进行免疫组织化学鉴定.将HUVECs随机分为对照组(内皮细胞培养基培养)、LPS组(内皮细胞培养基+0.1 μg/mL LPS)和法舒地尔组(内皮细胞培养基+0.1 μg/mL LPS+3.275 μg/mL法舒地尔),Western blot法检测RhoA、ROCK2、p-ERM蛋白表达水平,实时荧光定量PCR检测RhoA、ROCK2和p-ERM mRNA表达量.结果:原代培养的内皮细胞在接种后24 h后完全贴壁生长,第3天融合呈铺路石样镶嵌排列,免疫组织化学检测可见第Ⅷ因子相关抗原阳性反应,证实为内皮细胞.LPS组RhoA、ROCK2和p-ERM蛋白及基因表达水平均显著高于对照组(P<0.01);而法舒地尔组ROCK2和p-ERM蛋白及基因表达均低于LPS组(P<0.05~P<0.01),但2组RhoA蛋白和基因表达水平差异均无统计学意义(P>0.05).结论:Rho/ROCK/ERM通路在LPS诱导的HUVECs细胞骨架改变中起重要作用,法舒地尔可拮抗LPS诱导的骨架蛋白重排等HUVECs损伤,其机制可能与抑制Rho/ROCK信号通路活化有关.     

结肠癌细胞上调脐静脉内皮细胞EMMPRIN的表达

目的：探讨结肠癌细胞对脐静脉内皮细胞中细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（EMMPRIN）表达的影响,以及EMM-PRIN与肿瘤新生血管生成的关系.方法：建立结肠癌LoVo细胞与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）共培养模型,并设HUVEC单独培养对照组,培养36 h后进行形态学观察,并应用免疫细胞化学方法检测内皮细胞EMMPRIN的表达.结果：共培养组HUVEC形成大量管样结构,且EMMPRIN的表达明显强于HUVEC单独培养对照组强.结论：结肠癌细胞上调HUVEC EMMPRIN的表达,并诱导HUVEC管样结构的的形成,EMMPRIN的表达可能与肿瘤新生血管生成具有一定的相关性.     

TNF-α对人脐静脉内皮细胞中NO和eNOS的影响

目的 讨论肿瘤坏死因子-α（TNF—α）对内皮细胞一氧化氮（NO）产生及内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性的影响。方法 以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）为实验材料，检测与不同浓度TNF—α作用不同时间后．细胞培养上清液和细胞中NO水平的变化，以及细胞eNOS活性的改变。结果 （1）随着TNF—α浓度的升高，eNOS的活性减弱，而细胞和上清液中NO的含量增加；（2）随着干预时间的延长，eNOS的活性减弱；而细胞和上清液中NO的含量在作用24h后升高，且明显高于对照组；（3）L一单甲基精氨酸（L—NMMA）和地塞米松（DXM）均能阻断TNF-α引起的细胞和细胞上清中NO的表达增加。结论 TNF-α降低eNOS活性，却在高浓度和长时间作用后增加NO的合成，可能与激活诱导型一氧化氮合酶有关，因为NO的变化可以被L—NMMA和DXM阻断。     

一氧化氮合酶基因转染小鼠内皮祖细胞的实验研究

目的 探讨利用脂质体介导内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因体外转染小鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPC)的可行性.方法 密度梯度离心法分离ICR小鼠骨髓来源单个核细胞培养制备小鼠EPC并鉴定;构建、扩增、提取并纯化pcDNA3.0/eNOS基因质粒;用EPC培养基配成2×105·mL-1细胞悬液,按0.6 mL/孔重新铺6孔板,待细胞生长至80％左右融合时,用脂质体LipofectamineTM 2000体外转染eNOS基因至EPC.转染48 h后,采用RT-PCR检测EPC中eNOS的表达,硝酸还原酶法检测EPC中一氧化氮(NO)的含量,荧光探针DCFH-DA活性氧检测氧自由基(ROS)的含量.结果 成功培养EPC,成功构建pcDNA3.0/eNOS基因载体.转染48 h后,EPC中eNOS表达量明增加(P＜0.01),NO含量明显升高(P＜0.01),ROS含量明显降低.结论 脂质体介导eNOS基因能够有效转染小鼠EPC,并能在EPC中有效表达.     

人脐静脉内皮细胞体外培养方法的改进

目的 建立一种能大量分离人脐静脉内皮细胞(HUVECS)的体外培养方法,为血管内皮细胞的大规模体外实验研究奠定基础.方法 比较0.25%胰酶、0.1%Ⅰ型胶原酶、0.25%胰酶与0.1%Ⅰ型胶原酶(1∶1)3种消化方法分离HUVECs的细胞数量和活细胞率的差异.观察血管内皮细胞生长因子(VEGF)对细胞生长的影响.细胞鉴定采用形态学观察和免疫荧光法检测.结果 0.1%Ⅰ型胶原酶单独或混合0.25%胰酶消化分离细胞数量较多、活细胞率较高(P＜0.05).VEGF能明显促进细胞增殖能力,延长细胞自然生长时间.细胞呈单层"铺路石"样排列,免疫荧光细胞化学法染色,激光买聚焦检测可见胞质中绿色荧光颗粒.结论 Ⅰ型胶原酶与胰酶混合消化HUVECs是获取血管内皮细胞的一种经济且效果较好的方法,添加VEGF能明显促进细胞增殖,可用于构建体外研究血管内皮细胞的模型.     

连接蛋白Lnk在人脐静脉内皮细胞中的表达

目的：证实体外培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）存在Lnk分子的表达.方法：体外培养HUVEC系用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western印迹技术,检测HUVEC细胞中的LnkmRNA及蛋白表达.结果：连接蛋白Lnk mRNA及蛋白在HUVEC中均有表达.结论：HUVEC组成性地表达Lnk,可作为体外研究Lnk的细胞系.     

EA.HY926人脐静脉内皮细胞株与原代细胞生物特性的比较研究

目的比较培养EA．HY926人脐静脉内皮细胞株与原代脐静脉内皮细胞（HUVECs）的优缺点及生物学特性。方法通过倒置显微镜、透射电镜形态学鉴定、Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检查及生长曲线测定,比较2种脐静脉内皮细胞的形态、生长喵线等差异。结果透射电镜观察到原代HUVECs中发现较多Webel—Palade小体,而EA．HY926细胞株较少见。免疫组织化学染色ImageProPlus6．0软件进行分析EA．HY926人脐静脉内皮细胞株与原代HUVECs平均光密度值分别为（2234．02±78．78）、（4138．80±594．01）。原代HUVECs的染色程度明显较EA．HY926细胞株高,差异有统计学意义（Pd0．01）。EA．HY926人脐静脉内皮细胞株生长曲线较原代HUVECs稳定。结论培养原代HUVECs耗时长,生长期较短,易出现杂细胞的污染,细胞的增殖能力有限,花费昂贵。EA．HY926细胞株虽生物特性较差,但其操作简便,具有一定程度的原代HUVECs所具有的生物特性,细胞均一以及增长旺盛,可用于较复杂、细胞创伤较大的体外内皮细胞的研究。     

能量可控陡脉冲对人脐静脉血管内皮细胞的体外作用

目的研究不同剂量的能量可控陡脉冲对体外培养的人脐静脉血管内皮细胞生物学性状的影响.方法对人脐静脉血管内皮细胞施以不同剂量的陡脉冲,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法及细胞增殖曲线观察细胞的损伤效应,流式细胞技术分析作用前后细胞周期的情况.结果①MTT试验证明能量可控陡脉冲对人脐静脉内皮细胞的作用存在剂量-效应关系,其杀伤率随剂量的增加而增加,揭示高剂量的能量可控陡脉冲可导致血管内皮细胞急性损伤效应;②细胞增殖曲线表明随能量可控陡脉冲剂量的增加,对细胞增殖能力抑制越明显;③流式细胞分析结果表明,能量可控陡脉冲处理前后,细胞周期变化不明显.结论能量可控陡脉冲对血管内皮细胞有明显的杀伤和抑制作用.     

p38 MAPK在脂多糖诱导的人内皮细胞表达诱导型一氧化氮合酶中的作用

目的研究p38丝裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)在脂多糖(LPS)诱导的人内皮细胞－ECV304诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达和一氧化氮(NO)产生中的作用。方法用Griess法检测人内皮细胞培养液中NO水平,分别用免疫荧光法和 RT－PCR检测细胞 iNOS蛋白和mRNA的表达,采用免疫沉淀法检测细胞 p38 MAPK的活性。结果 与对照组相比,LPS刺激后的BCV304细胞iNOS蛋白和mRNA的表达显著增加,用p38特异性抑制剂SB203580预处理后,可以显著抑制细胞 iNOS的表达和NO的产生。LPS刺激内皮细胞后15 min,p38 MAPK的活性达到高峰,维持45 min后逐渐下降。结论p38MAPK参与了LPS诱导的内皮细胞iNOS的表达和NO的产生;可通过阻断信号转导通路来减少iNOS及其他细胞因子的产生,为败血症休克的防治提供一条新的思路。