福建省2005-2010年志贺菌分离株的毒力基因分析

目的 通过检测福建省志贺菌的毒力基因,了解我省不同志贺菌菌群及血清型的毒力基因分布情况以及流行模式,评估不同菌型的危害性,为菌痢防控工作提供科学的实验依据。方法 运用PCR扩增技术,对2005-2010年福建省腹泻病人中分离的104株志贺菌进行ipaH、set1（set1A和set1B）、sen、ial 四种毒力基因的检测,分析各毒力基因的阳检率以及毒力基因的分布模式。结果 ipaH、set1（set1A和set1B）、sen 、ial毒力基因的阳检率分别为100%、36.54%、 66.35%、64.42%,其中set1基因在B群（福氏志贺菌）和D群（宋内志贺菌）的阳检率分别为85%和6.25%;104株志贺分为8种毒力基因分布模式命名为I-VIII, IV型是B群志贺菌的优势基因携带模式（67.5%）,VI型是D群志贺菌优势基因携带模式（39.06%）,同时D群中I型、VII型和V型基因模式分布也较高。结论 ipaH可作为志贺菌属的鉴定基因,set1毒力基因主要存在于福氏志贺菌（B群）中;B群志贺菌有一个集中优势的基因流行模式IV型,D群有较多的相对优势基因流行模式;说明在志贺菌进化过程中存在复杂分化形式,同时毒力基因的插入和缺失在菌型的变异和分化中有一定的相关性。     

福氏2a志贺菌肠毒素ShET1/ ShET2基因分型在同源克隆鉴定系统中的应用

目的　对福氏 2a志贺菌肠毒素ShET1和肠毒素ShET2进行基因分型 ,提高福氏 2a志贺菌同源克隆鉴定系统的分析水平。方法　综合运用质粒DNA分析、16srRNA基因探针分析及随机PCR分析方法对 93株分离自不同地区 ,不同时间的福氏 2a志贺菌进行多生物学标志分型 ,同时引入志贺菌肠毒素ShET1/ShET2基因PCR分析法检测福氏 2a志贺菌。结果　质粒DNA分析、RAPD分析、16srRNA基因探针分析三种方法联合运用 ,可将 93株S flexneri 2a分成 19个克隆群 ,克隆分辨率为 2 0 4 3% (19/ 93) ,引入毒素ShET1/ShET2基因PCR分析 ,可新增加 8个克隆群 ,克隆分辨率为 2 9 0 3% (2 7/ 93) ,克隆分辨率提高 8 6 0 % (8/ 93)。 93株福氏 2a志贺菌按志贺菌肠毒素分为 4种基因型 ,即 12株ShET1(- ) /ShET2 ( ) ,14株ShET1( ) /ShET2 (- ) ,5 9株ShET1( ) /ShET2 ( ) ,8株ShET1(- ) /ShET2 (- )。结论　在应用多生物学标志进行福氏 2a志贺菌同源克隆鉴定系统研究时 ,肠毒素ShET1/ShET2基因PCR分析是不可或缺的分析指标。     

志贺菌属肠毒素ShET1/ShET2的基因型PCR分析

目的 对福氏2a志贺菌肠毒素ShET1和肠毒素ShET2进行基因分型，提高福氏2a志贺菌同源克隆鉴定系统的分析水平。方法 对93株分离自不同地区、不同时间的福氏2a志贺菌用PCR法检测志贺菌肠毒素ShET1／ShET2基因并进行基因分型。结果 93株福氏2a志贺菌按志贺菌肠毒素ShET1／ShET2基因分为4种基因型，即12株ShET1(-)／ShET2( )，14株ShET1( )／ShET2(-)，59株ShET1( )／ShET2( )，8株ShET1(-)／ShET2(-)。结论 福氏2a志贺菌肠毒素ShET1／ShET2基因PCR检测可用于福氏2a志贺菌的初步筛检。     

福氏志贺菌临床分离株毒力基因的研究

目的研究在一种快速、特异的mPCR方法在检出福氏志贺菌的同时对其毒力进行监测。方法选取福氏志贺菌三种毒力基因ipaH,ial,set1B作为扩增目标,在同一mPCR体系中对86株福氏志贺菌临床分离株进行了检测,并选取12株进行了噬斑形成试验,观察了扩增产物不同的福氏志贺菌对Hela细胞的毒力作用。结果86株福氏志贺菌临床分离株均检测到ipaH基因,阳性率为100%;45株检测到ial基因,阳性率为52%;69株检测到set1B基因,阳性率为80%。噬斑形成试验证明,mPCR结果不同的菌株对Hela细胞的感染能力存在明显差异。结论应用上述mPCR体系在检出福氏志贺菌的同时能够对菌株的毒力进行初步判别,对于临床诊断及治疗具有重要意义。     

福氏2a志贺菌肠毒素ShET1/ShET2基因分型在菌痢快速诊断中的应用

目的对福氏2a志贺菌肠毒素ShET1(Shigellaenterotoxin1)和肠毒素ShET2(Shigellaenterotoxin2)进行基因分型,提高菌痢爆发流行时同源克隆的鉴定分析水平。方法对93株分离自不同地区,不同时间的福氏2a志贺菌用PCR法检测志贺菌肠毒素ShET1/ShET2基因,进行基因分型和同源克隆鉴定。结果93株福氏2a志贺菌按志贺菌肠毒素ShET1/ShET2基因可分为4种基因型,即12株ShET1(-)/ShET2(+),14株ShET1(+)/ShET2(-),59株ShET1(+)/ShET2(+),8株ShET1(-)/ShET2(-)。93株福氏2a志贺菌ShET1检出率为89.24%(83/93),ShET2为65.59%(61/93)。二者至少有一种基因被检出的检出率为91.39%(85/93)。结论福氏2a志贺菌的快速诊断可应用ShET1、ShET2双基因PCR检测,具有较高的敏感性与特异性。在应用多生物学标志进行福氏2a志贺菌同源克隆鉴定系统研究时,肠毒素ShET1/ShET2基因PCR分析是不可或缺的分析指标。     

2007年中国四省福氏志贺菌分离菌株的毒力基因检测和PFGE分析

目的分析中国河南等四省的福氏志贺菌分离菌株毒力基因和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型。方法应用PCR方法检测2007年从河南、青海、甘肃和山西分离的262株福氏志贺菌的侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)、志贺肠毒素2基因(sen)、志贺肠毒素1基因(set1A)以及侵袭性蛋白基因(ipaBCD)。参考美国CDC的PulseNet实验方法 ,用限制性内切酶NotI对细菌染色体进行酶切,对这些分离菌株进行PFGE分析,使用BioNumerics软件进行聚类分析,并按照PulseNet命名原则对带型进行命名。结果 262株福氏志贺菌分离菌株ipaH、sen、set1A和ipaBCD基因的携带率分别为100%、93.89%、96.18%和92.75%。具有7种毒力基因携带模式,其中89.31%的菌株为Ⅰ型毒力基因携带模式(ipaH+sen+set1A+ipaB-CD+),有99.24%菌株同时携带两种或以上毒力基因。262株福氏志贺菌共分为83个PFGE型别,其中CNJZXN11.0002、CNJZXN11.0003、CNJZXN11.0060、CNJZXN11.0081、CNJZXN11.0137、CNJZXN11.0169、CNJZXN11.0190、CNJZXN11.0195、CNJZXN11.0196、CNJZXN11.0199、CNJZXN11.0217、CNJZXN11.0325和CNJZXN11.0327为13种主要带型。CNJZXN11.0003型菌株在4省均有分布,CNJZXN11.0199为河南菌株的优势带型,CNJZXN11.0137、CNJZXN11.0325和CNJZXN11.0327为山西特有的PFGE带型,与CNJZXN11.0003等主要带型聚类相似性较小。结论四省分离的福氏志贺菌株中ipaH、sen、set1A和iPaBCD毒力基因的携带率较高,而且这些菌株的PFGE型别既具有地区性差异,又具有优势型别的交叉。     

福氏2a志贺菌痢暴发的RAPD分析

目的 探讨江门一起菌痢暴发的特异传染源。方法 对8株福氏2a志贺菌进行PAPD分析。结果 此次菌株暴发期间分离的8株福氏2a志贺菌具有两种不同的RAPD特征（RTI、RTⅡ型）,其中2株病例密切接触者分离株J98101(PTⅡ型）和J9826（RT I型）分离不同克隆。结论 本次暴发偶合有部分散发病例。相对于质粒分析而言,RAPD分析具有更高的分辨率,它提供的遗传学信息更为丰富、直接、精细。     

一个新的TonB依赖的基因岛的分布特征研究

目的 为揭示首次在尿道致病性大肠杆菌CFT073菌株中发现的TonB依赖的基因岛在其他菌属中是否存在及分布特点。方法 根据组成该基因岛的全部基因设计引物，利用PCR方法进行检测分析，并以Southern blot和Dot blot方法予以证实。结果 该基因岛主要存在于多种大肠杆菌和志贺氏菌中，在41株被检测的沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、克雷伯氏菌、构橼酸杆菌等其他菌属的标准菌株中均没有完整的该基因岛结构。在33株从腹泻病患者粪便标本分离的包括6种血清型的福氏志贺氏菌株中有30株携带该基因岛。17株ETEC临床分离菌株中仅有1株菌阳性；19株EPEC临床分离株中仅有1株阳性；7株EAEC菌中均为阴性。在183株从腹泻病患者粪便标本分离的不属于已知的五类致泻性大肠杆菌中发现有123株携带该基因岛，阳性率为67．2％，其中130株携带HPI毒力岛的大肠杆菌中有95株携带该基因岛(阳性率为73％)，53株非携带HPI大肠杆菌有28株携带该岛(阳性率为52、8％)。结论 该基因岛的结构比较保守，五个组成基因协同存在，主要分布在亲缘关系较近的大肠杆菌和志贺氏菌属，在大肠杆菌中与HPI毒力岛无明显的协同存在规律。     

北京市西城区2005-2007年志贺菌毒力相关基因的检测与分析

目的对西城区2005-2007年来收集的志贺菌进行毒力相关基因检测并分析其分布情况,同时建立多重PCR方法检测志贺菌。方法利用志贺菌中四个主要毒力相关基因ipaH、ial、set1A、set1B的引物分别对所收集的志贺菌进行PCR方法检测与分析,并且建立了毒力相关基因多重PCR方法的反应条件。结果ipaH基因存在于所有志贺菌中,set1A、set1B基因仅存在福氏志贺菌中,ial基因在反复复苏的菌株中检出率有所下降,尤其以宋内缺失率高(49%);多重PCR方法检测志贺菌方便快捷,而且可以初步分型。结论志贺菌菌型分布发生了变化,毒力相关基因的分布也相应地有所不同;多重PCR具有志贺菌的快速诊断价值。     

福建省福氏志贺菌4c亚型的分子特征分析

目的 分析福建省福氏志贺菌4c血清亚型的毒力基因分布,菌株间的遗传相似度以及基因组的多态性。方法 运用PCR扩增技术对17株F4c菌进行ipaH、set1（set1A和set1B）、sen、ial 四种毒力基因的检测,同时运用脉冲肠凝胶电泳（PFGE）技术进行分子分型。 结果 ipaH、set1（set1A和set1B）、sen 、ial基因阳性的菌株分别占100%、94.12%、 82.35%、88.23%; 17株F4c菌分为I-IV型不同的毒力基因分布模式, I型是优势模式占76.47%;按100%的相似度,PFGE有12种型别（P1-P12）,不存在集中优势的PFGE型别;根据TENOVER原则,分为3个PFGE群(G1-G3),G1是优势群,占64.71%。结论 我省分离的F4c血清亚型的志贺菌大部分菌株具有较强的毒力特征;绝大多数感染患者之间无明显的传播关系,不同克隆群在传播中存在着集中趋势,提示某一克隆群的F4c菌有可能逐步演变成为我省主要且稳定的福氏志贺菌流行菌株。     

兰州市不同毒力基因型志贺菌致病力研究

目的检测2007年兰州市分离的不同毒力基因型志贺菌株致病力情况,探讨毒力基因型与致病力的关系。方法选用不同毒力基因型的志贺菌,以腹腔注射为感染途径,测定其对昆明种小鼠的半数致死量(LD50)。结果7株不同毒力基因型(分别为virA+ipaH+setlA、virA+ial+ipaH+setlA+setlB+sen、virA+setlA、virA+ial+ipaH+setlA+sen、virA+ipaH+setlA+sen、virA+ipaH+setlA+setlB、virA+ial+ipaH+setlA+setlB)志贺菌LD50分别为:1.422×109cfu/mL、6.653×107cfu/mL、6.653×108cfu/mL、1.422×109cfu/mL、1.422×109cfu/mL、6.653×108cfu/mL、3.062×109cfu/mL;结果表明,不同毒力基因型的志贺菌之间存在致病力差异,其中以基因组合为virA+ial+ipaH+setlA+setlB+sen的福氏志贺菌Ⅳ菌株的LD50最小,致病力最强。结论志贺菌的毒力基因型与致病力密切相关。     

马鞍山市志贺菌福氏4c亚型毒力基因检测及分子分型研究

目的了解马鞍山市志贺菌福氏4 c(ShigellaF4c)分离株的毒力基因的流行模式及分子分型的特点,掌握Shi-gellaF4c在该市的流行状况。方法使用常规法进行菌株分离培养、使用全自动微生物鉴定系统进行生化鉴定,鉴定为志贺菌的阳性菌株使用PCR检测ShigellaF4c的ipa H、ial、set、sen四种毒力基因及应用PFGE进行分子分型。结果 ipa H、ial、set、sen四种毒力基因在76株ShigellaF4c的携带率分别为100%、97.4%、96.1%、90.8%,其中67株ShigellaF4c四种毒力基因全为阳性,占88.2%;本地区ShigellaF4c携带毒力基因模式分成五大类型,Ⅰ型是主要毒力基因模式。PFGE电泳条带图谱显示,ShigellaF4c中100%相同的菌株数较少;100%相同的都为同一年代,91%相同的菌株出现跨年度;不同年代分离株无完全相同基因型,地域方面没有明显联系。结论马鞍山地区S.F4c分离株携带ipa H、ial、set、sen四种毒力基因普遍存在,毒力强是本地区ShigellaF4c主要特征之一;ShigellaF4c在本地区无显著的流行迹象,属于散在发病。     

二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测志贺菌方法的建立及初步应用

目的 利用二聚体蝎型荧光探针法,建立一种可广泛应用且敏感、特异的检测志贺菌的荧光定量PCR技术。方法 根据编码志贺菌ipaH基因的核苷酸序列设计引物和荧光探针,采用基因重组技术构建用于志贺菌检测的定量标准品,通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索,建立了检测志贺菌的二聚体蝎型探针定量PCR方法。结果 成功构建了志贺菌重组质粒标准品和志贺菌实时荧光定量PCR方法;通过特异性、敏感性、稳定性和重复性验证,结果表明具有较好的特异性、敏感性、稳定性和重复性;对比分离培养标本,二者符合率为100％;对比TaqMan方法,本方法具有更敏感、省时、成本低的特点。结论 建立了一种以二聚体蝎型荧光探针技术为基础的志贺菌荧光定量PCR检测法,为研制新型的检测试剂盒奠定了基础,可应用于食品卫生监管以及传染病诊断等。     

PCR快速检测食品中志贺氏菌方法的建立

目的本研究根据福氏志贺菌(Shigella lexneri)侵袭性质粒抗原H基因(invasion plasmid antigen H,ipaH),设计了一对特异性引物,预计PCR扩增的目的基因片段为435bp。对PCR的特异性、敏感性分析以及建立L16(43)正交试验对PCR扩增条件如引物浓度、dNTP浓度和Tm值等的优化,建立了快速检测福氏志贺菌的稳定的PCR方法。该方法检测的灵敏度为可以检测到食品中7 ng/ml福氏志贺菌的基因组DNA。并且模拟检测食品中的细菌,结果很稳定。该方法操作简单、检验周期短、特异性和灵敏度高,能够快速地实现对食品中的志贺菌的诊检和监控。     

Distribution of Shigella enterotoxin genes and secreted autotransporter toxin gene among diverse species and serotypes of shigella isolated from Andaman Islands, India

We studied the prevalence and distribution of the newly described genes for Shigella enterotoxins (ShET1 and ShET2, encoded by set and sen genes) and secreted auto-transporter toxin (encoded by sat gene) in clinical isolates from the Andaman Islands, India. A total of 153 Shigella isolates obtained from hospitalized patients during 1994-2004 were analysed. These isolates included all the four species of Shigella (S. dyseteriae-29, S. flexneri-75, S. sonnei-38, S. boydii-5) that belonged to diverse serotypes (including serologically untypable-6) and each serotype included a wide variety of genotypes. Each isolate underwent polymerase chain reaction (PCR) for detection of set, sen and sat genes employing specific primers. We found the set gene in all S. flexneri 2a and 2b isolates (41 of 41, 100%) but not outside S. flexneri serotype 2. The sen gene was well distributed among all species and serotypes but its presence was apparently low at 49.1% (75 of 153), probably because of the loss of the large plasmid that harbours the gene in 76 of the 78 (97.4%) sen negative isolates. Also, all S. flexneri 2 isolates (including 2a and 2b serotypes) had the sat gene. It was present in 96% (72 of 75) of S. flexneri, in 6.9% (2 of 29) of S. dysenteriae, in 20% (1 of 5) of S. boydii, and in 33.3% (2 of 6) of untypable Shigella, but not in (0 of 38) S. sonnei. This study provides initial data on the prevalence and distribution of of the set, sen and sat genes in a wide variety of Shigella isolated over a 10-year period. Our results suggest a greater prevalence of the set and sat genes in S. flexneri 2 isolates than previously thought and might help in future pathochip designs.     

应用16S rDNA克隆文库筛查腹泻病暴发病原体及特异毒力基因验证

目的以16S rDNA克隆文库筛查某地腹泻病暴发的病原体,并验证筛查结果的可靠性。方法收集12份暴发期内腹泻患者的粪便标本,抽提粪便中总细菌基因组,随机抽取3例患者,应用中国传染病预防控制国家重点实验室建立的16S rDNA克隆文库方法筛查可能的致腹泻病原菌,根据筛查结果,设计致腹泻病原菌特异性毒力基因的引物进行PCR验证,同时对其它9份粪便标本进行该致病菌的PCR检测,根据致病菌的检出比例,确定可能导致本次腹泻病暴发的病原体。结果用16S rDNA克隆文库在3例患者标本中筛查到2例可能存在志贺菌或大肠杆菌,用针对志贺菌的特异性毒力基因ipaH对该2例患者标本进行PCR检测为阳性。在其它9例腹泻患者粪便标本中6例检测到志贺菌,志贺菌在腹泻病例中的总检出率为66.7%(8/12)。16S rDNA克隆文库筛查结果与志贺菌ipaH基因的验证结果均显示,3号病例的志贺细菌基因组在粪便总细菌基因组中所占的比例比2号病例高,两种检测结果具有一致性。结论志贺菌可能是导致某地本次腹泻病暴发的主要病原体。16S rDNA基因克隆文库法能快速筛查到可能的病原菌,其筛查结果比较可靠,因此,该方法对于不明原因疾病暴发流行的病原体筛查具有指导作用。     

PCR快速检测腹泻患者粪中痢疾杆菌致病基因ipaH和ial

目的: 建立一种快速、特异、敏感的分子生物学诊断方法对腹泻患者粪中痢疾杆菌致病基因ipaH及ial进行检测.方法:分别应用常规培养生化血清学鉴定方法、普通PCR、巢氏PCR(nested-PCR)方法, 对71例腹泻患者粪标本进行检测. 痢疾杆菌致病基因ipaH及ial的扩增产物经电泳分离.结果: 在71例腹泻患者粪标本中, 常规培养生化血清学鉴定方法分离出福氏痢疾杆菌24例, 宋内痢疾杆菌23例, 志贺痢疾杆菌1例, 沙门菌23例. 采用普通PCR法检测痢疾杆菌粪标本48例, ipaH基因均阳性(100%);ial基因阳性34例(70.8%), 余14例为阴性. 对该14例粪标本进而采用巢氏PCR法进行ial基因扩增, 其中12份标本阳性. 48例痢疾杆菌粪标本中46例ipaH和ial基因为双阳性(46/48). 沙门菌粪标本23例中ipaH及ial基因表达均为阴性. 以上两种方法的诊断一致性检验Kappa = 0.937, 差异有统计学意义(P<0.05). 71例腹泻患者粪标本采用PCR和巢氏PCR法扩增得到的ipaH和ial基因特异片段与基因库中发表的标准菌株序列比较, 一致性为100%.结论:建立了快速诊断腹泻患者粪中痢疾杆菌致病基因ipaH和ial的PCR检测方法, 具有简便、快速、特异和敏感的特点.