鸡尾酒疗法对大鼠肝星状细胞的增殖及Ⅰ型胶原、TIMP-1mRNA表达的影响

目的:研究不同类型的抗肝纤维化药物联合应用即鸡尾酒疗法对大鼠肝星状细胞(HSC)的干扰效果.方法:将体外培养的大鼠肝星状细胞株HSC-T6分为牛磺酸组、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)组、4,5,7-三羟基异黄酮组、鸡尾酒组和对照组;各组药物作用HSC-T6 24h后,用噻唑兰比色法(MTT)测定活细胞数,采用半定量RT-PCR法检测细胞中Ⅰ型胶原及基质金属蛋白酶组织抑制因子-1的mRNA表达水平.结果:MTT实验观察到牛磺酸、EGcG、三羟基异黄酮、鸡尾酒组HSC-T6的活细胞数目减少,与对照组的A值比较有显著性差异(0.237±0.007,0.216±0.009,0.242±0.008,0.130±0.004 vs 0.452±0.011,均P<0.05),其中鸡尾酒组与单一用药各组相比也有显著性差异(P<0.05).与对照组相比,各组的Col-Ⅰ、TIMP-1的mRNA表达降低,并且鸡尾酒组与单一用药各组相比有统计学意义(P<0.05).结论:鸡尾酒疗法可抑制大鼠HSC-T6的增殖,与单一用药相比更能有效降低Col-Ⅰ、TIMP-1的mRNA表达,可能具有更高的纤维化效果.     

PDGF-BB对肝星状细胞表达MMP-2及TIMP-1的影响

目的：探讨血小板衍生生长因子－BB（PDGF－BB）对体外培养大鼠肝星状细胞（HSC）表达基质金属蛋白酶－2（MM－2）及金属蛋白酶组织抑制因子－1（TIMP－1）的影响。方法：原位灌流分离HSC，体外培养激活，用PDGF－BB干预，采用半定RT－PCR方法检测各组MMP－2、TIMP－1 mRNA的表达情况。结果：PDGF－BB干预组TIMP－1 mRNA的表达较对照组明显增强（P＜0．01），且随着干预时间的延长其表达逐渐增强（P＜0．01）；而PDGF－BB干预组MMP－2表达与对照组无明显差异（P＞0．05）。结论：PDGF－BB促进肝纤维化与其引起HSC表达TIMP－1增强有关。     

4,5,6-三羟基异黄酮对大鼠肝星状细胞细胞周期的影响

4,5,6-三羟基异黄酮(genistein)是一种特异性的酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase,TPK)抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI),现以血小板衍生生长因子(PDGF)作为刺激因素观察genistein对肝星状细胞(HSC)增殖的抑制作用,以探讨其抗纤维化的细胞学机制。     

脂联素对原代大鼠肝星状细胞表达MMP-2和MMP-13的影响

目的观察外源性脂联素对体外培养原代大鼠肝星状细胞（HSC）表达基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和基质金属蛋白酶-13（MMP-13）的影响,探讨脂联素对肝纤维化的影响。方法改良的肝脏二步原位灌注法分离肝星状细胞,外源性脂联素（125μg/L、250μg/L、500μg/L）处理体外培养的原代肝星状细胞。Real-time PCR方法分析其对原代HSCMMP-2和MMP-13 mRNA表达的影响,ELISA方法检测原代HSC分泌MMP-2和MMP-13蛋白水平,酶谱法检测细胞外MMP-2的酶活性。结果脂联素促进MMP-2和MMP-13 mRNA表达,随脂联素浓度增加,作用更加明显。脂联素可促进HSC分泌MMP-2及MMP-13蛋白,提高MMP-2酶活性,但均无剂量依赖性。结论脂联素调节MMP-2表达和活性,促进MMP-13表达,可能对肝纤维化产生影响。     

奥曲肽对肝星状细胞胶原合成及TIMP-1、MMP-2表达的影响

目的研究奥曲肽(OCT)对体外培养的大鼠肝星状细胞(HSC)胶原分泌及TIMP-1mRNA、MMP-2mRNA表达的影响。方法体外培养大鼠HSC,HSC随机分为4组,分别加入不同浓度的OCT,用ELISA法检测细胞上清液中的Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量,半定量RT-PCR法检测OCT对HSC中MMP-2、TIMP-1 mRNA表达的影响。结果应用OCT干预后,HSC合成Ⅰ、Ⅲ型胶原减少,TIMP-1 mRNA的表达较少,而MMP-2 mRNA表达明显增加,差异有显著性(P<0.05)。结论OCT可以抑制HSC的Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成,增强MMP-2mRNA的表达,抑制TIMP-1mRNA的表达,这可能是OCT发挥抗肝纤维化作用的途径之一。     

4,5,6-三羟基异黄酮对大鼠肝星状细胞骨架及胞浆内游离钙的作用

研究显示4,5,6-三羟基异黄酮(genistein)对肝星状细胞(HSC)的生长、激活有抑制作用。拟通过体外培养的激活HSC细胞模型来进一步研究genistein对HSC抑制作用的机制,     

丹芍化纤胶囊对肝纤维化大鼠肝星状细胞增殖、活化及凋亡的影响

肝纤维化的发生机制主要是肝内细胞外基质（ECM）合成与降解失衡，表现为ECM大量沉积，肝星状细胞（HSC）在此过程中起关键作用。在肝纤维化恢复期，HSC的减少不是由于其表型从活化状态向静息状态转变，而是由于细胞凋亡的结果。本研究采用猪血清腹腔注射诱导免疫性肝纤维化大鼠模型，通过对结蛋白和α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）染色及TUNEL法来观察丹芍化纤胶囊对HSC增殖、活化和细胞凋亡的影响。     

转化生长因子β1对大鼠肝星状细胞表达β-连环蛋白的影响

目的研究转化生长因子β1（TGF—β1）对大鼠肝星状细胞（HSC）表达β-连环蛋白（β-catenin）的影响。方法采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）比较经不同浓度的TGF-β1刺激不同时间后HSC表达β-catenin、smad3和α-SMA mRNA的变化,并比较三者之间的关系。结果1ng／ml TGF—β1刺激2h后,HSC表达β—catenin mRNA、smad3 mRNA和α—SMA mRNA量最大,β—catenin mRNA表达与两者均具有明显的相关关系（r=0．947,P〈0．01;r=0．950,P〈0．01）。结论β—catenin在TGF—β1活化HSC的过程中发挥重要作用。     

柔肝冲剂对大鼠肝星状细胞表达转化生长因子β1和胶原的影响

[目的]观察柔肝冲剂对大鼠肝星状细胞(HSC)表达转化生长因子β1(TGF-β1)和胶原的影响.[方法]采用血清药理学方法处理HSC,以貂肺上皮细胞(Mv1Lu)生长抑制MTT法检测培养上清液中TGF-β1活性,免疫细胞化学染色检测HSC TGF-β1和胶原的表达.[结果]经柔肝冲剂处理的HSC培养上清液中TGF-β1的生物活性和细胞内TGF-β1的表达受到显著抑制,其中对纤维肝HSC的作用更明显,抑制作用优于秋水仙碱.柔肝冲剂能显著抑制纤维肝HSC表达胶原,对Ⅳ型和Ⅰ型胶原具有较高的抑制率.[结论]柔肝冲剂能抑制HSC产生TGF-β1和胶原,阻断肝纤维化时HSC合成胶原等细胞外基质的自分泌放大过程.     

肾母细胞瘤过度表达基因对大鼠肝星状细胞MMP-1和TIMP-1表达的作用研究

目的 构建能表达靶向肾母细胞瘤过度表达基因（NOV）的小干扰RNA（siRNA）的重组质粒，研究NOV对大鼠肝星状细胞（HSC）增殖、基质金属蛋白酶-1（MMP-1）和金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）表达的影响。方法 以NOV为目的基因，以质粒psiRNA-hH1 neo为载体，构建能在真核细胞中表达的靶向NOV的siRNA的重组质粒psiRNA（psiRNA1、2、3）和阴性对照重组质粒pconsiRNA。限制性酶切和测序鉴定构建成功后，脂质体介导重组质粒转染HSC，依据转染质粒的不同将HSC分为psiRNA1组、psiRNA2组、psiRNA3组、阴性对照pconsiRNA组，并以未转染重组质粒的HSC为空白对照组。半定量RT-PCR检测HSC的NOV、MMP-1、TIMP-1 mRNA表达情况，MTT法检测细胞增殖。结果限制性酶切和测序鉴定表明成功构建了NOV siRNA表达质粒；与阴性对照组相比，转染外源重组质粒psiRNA2的HSC内NOV的mRNA表达水平下降（P〈0．05），MMP-1mRNA表达水平下降不明显（P〉0．05），而TIMP-1 mRNA表达水平明显下降（P〈0．05）。与空白对照组相比，转染外源重组质粒psiRNA2的HSC增殖活性显著降低（P〈0．05）。psiRNA1组、psiRNA3组的HSC内NOV、MMP-1和TIMP-1 mRNA的表达及HSC增殖活性均无明显下降（P均〉0．05）。结论NOV可促进HSC增殖及表达TIMP-1增加，而对MMP-1表达影响不大，提示NOV可以作为肝纤维化基因治疗的一个新的靶位点。     

筛选转化生长因子β1刺激肝星状细胞差异表达基因的研究

目的 筛选转化生长因子β 1(TGF β 1)刺激大鼠肝星状细胞(Hsc)的差异表达基因,以揭示TGF β1介导肝纤维化的分子发病机制. 方法分别用Trizol法抽提TGF β1刺激的HSC及磷酸盐缓冲液刺激为对照的HSC总RNA,逆转录合成双链cDNA,制备掺入生物素标记的cDNA探针,与人基因表达谱芯片杂交,用Agilent扫描仪对芯片结果进行扫描,利用软件对差异表达基因进行生物信息学分析. 结果 从13824条目的 基因中筛选出177条差异表达基因,其中123条基因表达上调,其中包括:结缔组织生长因子,微管蛋白ε 1,V型胶原α2,连环蛋白6 2,钙粘蛋白6,2型,Smad3,丝裂源活化蛋白激酶4,生长因子受体结合蛋白7,丝裂原活化蛋白激酶相互作用/丝氨酸/苏氨酸激酶1等;54条基因表达下调,包括:肿瘤坏死因子受体相关因子4,干扰素调节因子7,干扰素诱生蛋白p78,骨形态发生蛋白7,基质gLa蛋白,人类丝氨酸蛋白酶抑制剂进化支B成员8,干扰素刺激基因2.0×104,死亡相关蛋白6,金属硫蛋白1H,超氧化物歧化酶2等;同时筛选到8个未知功能蛋白. 结论 应用基因表达谱芯片技术成功筛选了TGF β 1刺激HSC的差异表达基因,初步揭示了TGF β1致肝纤维化的分子机制是诸多因素共同作用的结果,为进一步寻找新的基因治疗靶点奠定了基础.     

4,5,7-三羟基异黄酮对肝纤维化大鼠肝窦内皮细胞窗孔、增殖及合成一氧化氮的影响

目的 探讨酪氨酸蛋白激酶抑制剂4、5、7-三羟基异黄酮(genistein)对肝窦内皮细胞(sinusoidalendothelial cell, SEC)窗孔、增殖及合成一氧化氮(nitric oxide, NO)的影响。方法 用胶原酶原位灌注,Percoll不连续密度梯度离心法分离正常及CCl_4实验性肝纤维化大鼠的SEC并进行体外培养。采用扫描电镜技术,MTT法及硝酸还原酶法,分别观察genistein对SEC细胞窗孔、增殖及合成NO的影响。结果 Genistein对肝纤维化各级 SEC的窗孔数目及大小均无明显的影响。经不同浓度的genistein作用24h后,肝纤维化各级大鼠SEC的生长均受抑制,以100 μmol/L浓度的genistein对肝纤维化Ⅰ级大鼠SEC的作用最为明显[细胞增殖率为-(15.38±6.26)% vs(4.91±2.16)%,t=13.7. P＜0.05]。100 μmol/L浓度的genistein作用24h,可明显促进肝纤维化Ⅰ级大鼠SEC NO的合成[NO合成为(25.4±3.8)μmol/L vs(16.6±3.3)μmol/L,t=6.79,P＜0.05];但对肝纤维化Ⅱ级、Ⅲ级大鼠SEC的NO合成的影响却不明显。结论 体外实验中genistein可以抑制肝纤维化Ⅰ级SEC增殖,促进SEC细胞NO的合成;对肝纤维化SEC细胞的功能有一定的调节作用。     

白花丹对大鼠肝星状细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

目的: 观察白花丹含药血清对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)增殖、凋亡细胞周期的影响,探讨白花丹抗肝纤维化的作用及其机制.方法: SD大鼠用白花丹水煎液灌胃(大、中、小剂量),取得含药血清.含药血清按不同浓度(50、100、200 mL/L)分组与大鼠HSC-T6孵育.设立空白对照组,并以秋水仙碱和复方鳖甲软肝片含药血清为阳性对照组.孵育后各组采用MTT比色法检测各组HSC-T6的增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡及各细胞周期DNA含量的百分比.结果: HSC-T6白花丹含药血清各组与空白组比较,增殖抑制率和细胞凋亡率明显增高,有显著性差异( P＜0.01);并且含药血清浓度增高时,HSC-T6的抑制率、凋亡率也逐渐增强;血清高浓度组的增殖抑制率和细胞凋亡率明显高于秋水仙碱组( P＜0.01),与复方鳖甲软肝片组相当;各组的G2/M期细胞百分比无明显变化.HSC-T6白花丹含药血清各组与空白组比较,G0/G1期的细胞百分比明显增高(55.23%±2.83%,52.60%±2.26%,48.75%±1.37%vs 44.08%±1.41%,均P＜0.01)、S期细胞百分比明显降低(31.47%±1.26%,34.14%±1.17%,40.28%±1.62% vs 47.36%±1.35%,均P＜0.01).并且含药血清浓度下降时,G0/G1期的细胞百分比逐渐下降,S期细胞百分比逐渐增高.同一血清浓度下,与秋水仙碱组比较,白花丹组的G0/G1期细胞百分比明显较高( P＜0.01),S期细胞百分比明显较低;而与复方鳖甲软肝片组无显著性差异.结论: 白花丹含药血清可以抑制HSC-T6增殖,诱导其凋亡,且作用具有剂量依赖性.白花丹含药血清抑制HSC-T6增殖的机制可能是使HSC-T6细胞周期停滞于G0/G1期,阻止其通过G1/S关卡.     

TIMP-2、MMP-2和MT1-MMP在活化肝星状细胞中的表达及对细胞外基质合成分泌的影响

目的 研究金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和膜型基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)在活化肝星状细胞(HSCs)中的表达,观察其对细胞外基质(ECM)合成分泌的影响.方法 原代分离培养大鼠HSCs活化后,分别给予40～160 pmol化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA进行干预,检测培养细胞上清液透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)和羟脯氨酸(Hyp)的含量,采用荧光实时定量PCR法检测TIMP-2、MMP-2、MT1-MMP、MMP-13、COL Ⅰ和COL Ⅲ mRNA的表达,western印迹检测TIMP-2、MT1-MMP和MMP-13蛋白表达及明胶酶谱法检测MMP-2蛋白表达.结果 应用化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA后,TIMP-2、MMP-2、MT1-MMP、COL Ⅰ和COL Ⅲ的表达明显降低,而MMP-13的表达则明显增加,培养细胞上清液中HA、PCⅢ和Hyp的含量也明显减少.结论 TIMP-2通过MT1-MMP介导MMP-2的活化,抑制TIMP-2的表达,MT1-MMP和MMP-2的表达随之降低,而HSCs合成分泌ECM也相应减少.     

α干扰素对肝星状细胞凋亡及其基因表达的影响

临床研究发现,α干扰素(IFN-α)有特异的抗肝纤维化作用而不依赖于其抗病毒作用,但其抗纤维化机制尚不清楚。目前IFN-α对活化的肝星状细胞(HSC)凋亡的影响未见报道。以体外培养的鼠HSC为研究对象,观察IFN-α对活化状态的HSC凋亡及其相关基因表达的影响     

高血糖对大鼠肝纤维化及肝星状细胞活化的影响

目的探讨高血糖对大鼠肝纤维化及肝星状细胞活化的影响。方法取大鼠66只,随机分为4组,A组和B组均采用STZ(链脲佐菌素)和CCl4(四氯化碳)诱导为肝纤维化并糖尿病模型。A组诱导成功不做处理。B组糖尿病诊断成立后,皮下注射门冬胰岛素,3次/d控制血糖。C组单纯利用CCl4(四氯化碳分析纯)诱导为肝纤维化模型。D组(空白对照组)常规喂养,不做处理。观察各组大鼠一般情况(包括鼠食消耗、毛发变化、活动指数),8周后处死,测量大鼠体质量、肝脏体积及重量,采集血液及肝脏标本,分析对比各组大鼠肝脏系数,HE染色后光镜下肝组织纤维化情况;免疫组化SP法检测肝组织内α-SMA表达。结果实验各组与对照组大鼠相比体质量明显减轻(P<0.05),肝脏系数明显增加(P<0.05),肝组织α-SMA表达均不同程度增强(P<0.05);其中A组的体质量减轻最明显,肝纤维化、肝脏系数增加最显著(P<0.05),肝组织α-SMA表达亦有显著性差异(P<0.05);B组与C组相比体质量无明显减轻(P>0.05),肝脏系数无明显增加(P>0.05),而肝组织α-SMA表达差异有统计学意义(P<0.05)。结论高血糖可促进大鼠肝纤维化形成及肝星状细胞的活化。     

IL-10对TGF-β1诱导的大鼠肝星状细胞CTGF表达的影响

目的:探讨IL-10对大鼠肝星状细胞(hepaticstellate cells,HSC)表达CTGF的影响及其抗纤维化的可能机制.方法:体外培养大鼠肝星状细胞系rHSC-99,分别用不同浓度的IL-10、TGF-β1干预和两者共同干预48 h后,采用半定量RT-PCR法检测各组肝星状细胞中CTGF mRNA表达水平.结果:TGF-β1单独干预HSC,CTGF mRNA表达水平与对照组比较均明显增强(P<0.05);不同浓度的IL-10单独干预HSC,各目的基因表达与对照组比较无明显统计学意义;不同浓度的IL-10与TGFβ1共同干预HSC,CTGFmRNA表达水平与TGF-β1组比较均明显降低(P<0.05).结论:IL-10可显著抑制由TGF-β1诱导的CTGF mRNA的表达,这可能是其抗纤维化的机制之一.     

外源性转化生长因子β1对大鼠原代肝星状细胞活化的影响

目的探讨大鼠原代肝星状细胞(HSC)体外培养过程中,不同时期外源性转化生长因子β1(TGF-β1)对其活化的影响及相关因素的变化.方法分离大鼠原代HSC,于无包被的塑料培养板上分别培养2,3,4,5,6,7 d时予TGF-β15 μg/L处理24 h,倒置显微镜下观察细胞的形态变化,应用Western blot法检测处理前后细胞α-肌动蛋白(α-SMA)的变化,及活化过程中TGF-β1Ⅱ型受体(TβR-Ⅱ)的表达.结果HSC在体外培养过程中,不同培养时间对TGF-β1的刺激活化作用反应不同.TGF-β1处理后,对培养2,3,4,5 d HSC的活化有促进作用,以对培养第3天的细胞作用最明显,其α-SMA表达增加78.05%,而培养6,7 d的HSC的形态和α-SMA变化不明显.培养第7天的HSC比培养第3天的细胞TβR-Ⅱ表达增高(3.30±0.83 vs 1.55±0.38,P＜0.05).结论TGF-β1对处部分活化状态中某阶段细胞的活化具有促进作用.完全活化的细胞对TGF-β1的刺激活化作用不敏感,原因与TβR-Ⅱ的表达量无关.     

大黄蔗虫丸对大鼠肝星状细胞活化及增殖的影响

目的观察大黄蔗虫丸对大鼠肝星状细胞活化及增殖的影响。方法用链酶蛋白酶和胶原酶原位灌注消化正常大鼠肝脏,Nycodenz密度梯度离心分离肝星状细胞(HSC),在制备大黄蔗虫丸大鼠药物血清的基础上,温育HSC。MTT比色法测定细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡及增殖周期情况。结果药物血清对体外培养的HSC有抑制作用,且存在浓度剂量依赖关系,但作用较弱,需在20%以上方见到显著性差异(P<0.05),对HSC凋亡及细胞增殖周期则无显著影响(P>0.05)。结论大黄蔗虫丸对HSC增殖有一定抑制作用,但可能不是其抗肝纤维化作用的主要途径,其抗肝纤维化作用与诱导细胞凋亡无关。     

肝苏对人肝细胞和肝星状细胞增殖、氧应激以及细胞外基质表达的影响

背景：有研究显示肝苏对肝细胞具有保护、抗炎、抗氧化和抗肝纤维化的作用,但其作用机制未明。目的：探讨肝苏对人肝细胞和肝星状细胞（HSC）增殖、氧应激以及细胞外基质表达的影响。方法：分别用0．01～1．0mg／ml肝苏培养肝细胞和HSC,以M1丫r法检测肝苏对肝细胞和HSC增殖的影响：用次氮基三乙酸铁（Fe-NTa）和0．05—1．0mg／ml肝苏共同培养肝细胞和HSC,检测超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量;用1．5mg／ml和2．5mg／ml肝苏培养HSC,以酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞外基质透明质酸（HA）、层黏连蛋白（LN）、I型胶原、Ⅲ型胶原和细胞因子转化生长因子（TGF）-β1含量。结果：在0．05。1．0mg／ml浓度范围内,肝苏可促进肝细胞增殖,但各浓度肝苏对HSC增殖无明显影响。肝苏可增高肝细胞SOD活性,降低肝细胞和HSCMDA含量,但对HSCSOD活性无明显影响。同时肝苏可抑制HSC细胞外基质HA、LN和细胞因子TGF-β1的表达,而I型胶原、Ⅲ型胶原无明显差异。结论：肝苏可促进肝细胞增殖,保护肝细胞和HSC免受氧应激损伤,抑制HSC分泌HA、LN和TGF-β1,提示其具有肝细胞保护、抗氧化和抗肝纤维化作用。