体外自发性搏动乳鼠原代心肌细胞的分离培养及超微结构

目的：通过对sD乳鼠体外自发性搏动的心肌细胞（CMs）分离培养,并观察其超微结构,以了解心肌干细胞的特性。方法：用体外分离、纯化培养sD乳鼠自发性搏动的心肌细胞,应用倒置显微镜及透射电镜观察其形态结构与超微结构,并进行心肌特异性标志troponinI（cTnI）的免疫细胞化学鉴定。结果：体外分离、纯化培养出心肌细胞,细胞具有自发性搏动特性,表达心肌特异性抗体TropninI。电镜下可见细胞内出现肌丝样结构及z线结构,细胞普遍存在肌小节,细胞间有闰盘连接;部分细胞表面有大量微绒毛,细胞器丰富,可见内质网、线粒体。结论：体外可分离培养扩增出自律性搏动的CMs,这些细胞表现增殖活跃,具有千细胞的增殖旺盛特性。     

次乌头碱对心肌细胞Ca2+调控蛋白mRNA表达的影响

目的 考察次乌头碱(HA)对原代培养乳大鼠心肌细胞L-钙通道、钙调蛋白(CaM)、肌质网雷诺定受体(RyR2)mRNA表达的影响.方法 体外培养乳大鼠心肌细胞,采用RT-PCR法测定L-钙通道α1C亚基、CaM及RyR2 mRNA的表达.结果 HA作用15 min时,60、120 μΜ/L能提高心肌细胞膜L-钙α1C ...     

The culture of primary cardiac cells

目的:探讨SD大鼠乳鼠心肌细胞的分离及培养方法,并进行形态学观察.方法:取出生1～3d的SD大鼠的乳鼠,胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶分别消化心肌组织,差速贴壁法分离心肌细胞,并加入适量BrdU纯化心肌细胞,显微镜下观察心肌细胞形态及纯度,结果:成功分离培养心肌细胞并观察其形态,计算存活率92％,纯度90％,2～3d出现同步搏动.结论:胰蛋白酶联合Ⅱ型胶原酶消化可分离存活率较高的心肌细胞,用差速贴壁法并加入适量BrdU可纯化心肌细胞,使细胞搏动良好.     

新生大鼠心肌细胞体外培养及其与心肌成纤维细胞形态比较

目的探索一种快速分离和培养新生大鼠心肌细胞的方法,比较心肌细胞和成纤维细胞的形态差异。方法胰蛋白酶消化法分离新生大鼠心肌细胞进行体外培养,差速贴壁法纯化心肌细胞,倒置显微镜跟踪观察心肌细胞的生长及搏动情况,台盼兰负染法检测心肌细胞活力,通过HE染色观察心肌细胞和成纤维细胞的形态学差异。结果接种24 h后细胞全部贴壁,部分细胞开始自发性搏动,48 h后,细胞体积增大,并伸出伪足,形状以三角形和梭形为主,3 d后细胞聚集成片并同步搏动且细胞活力均在90%以上。心肌细胞为梭形或三角形,胞质致密,多为单核细胞;心肌成纤维细胞呈泡状,双核和三核细胞较多,培养过程中不发生搏动。结论胰蛋白酶消化法培养新生大鼠心肌细胞快速有效,差速贴壁法纯化的心肌细胞可用于实验研究。     

大豆甙对培养大鼠心肌细胞自发性搏动及动作电位的影响

观察大豆（ｄａｉｄｚｉｎ）对培养的Ｗｉｓｔａｒ大鼠心肌细胞自发性搏动及动作电位电参数的影响。将０．７８～６．２５μｇ／ｍｌｄａｉｄｚｉｎ，分别加入到培养４～８ｄ的Ｗｉｓｔａｒ大鼠心肌细胞的培养液中，依次记录加药前、后心肌细胞群落的自发性搏动及动作电位电参数的变化。结果：大豆甙可剂量依赖性的抑制培养的Ｗｉｓｔａｒ大鼠心肌细胞自发性搏动及动作电位参数，该作用可被Ｃａ２＋８０μｇ／ｍｌ与肾上腺素１０μｇ／ｍｌ所反转。结论：大豆甙具有钙通道阻滞作用。     

新生SD大鼠心肌细胞的原代分离和培养

目的:建立简便有效的心肌细胞分离和原代培养方法,获得具有理想数量和活性的原代心肌细胞。方法:无菌条件下取出生72h内的新生SD大鼠心脏,去除心肌结缔组织和心房组织,只保留左心室,采用胰酶和胶原酶Ⅰ联合消化、差速贴壁分离的方法,获得心肌细胞进行体外培养,观察细胞的形态变化,对细胞的搏动频率、搏动细胞数进行统计分析。结果:分离的原代心肌细胞生长良好,核仁清晰可见。高倍镜下观察,心肌细胞接种12h后,少数细胞贴壁生长,且贴壁的少数单个细胞出现自发搏动,之后搏动细胞数以及细胞搏动频率都逐渐增加,接种48h后细胞完全铺展开来并连接成片,自发搏动呈现同步性和岛屿状。结论:本实验方法获得的新生SD大鼠心肌细胞生长状态好,细胞存活率和自发搏动性高,操作简单,重复性好,是一种理想、可靠的原代心肌细胞培养方法。     

新生小鼠心肌干细胞与心肌细胞共培养诱导分化试验

目的了解心肌条件培养液有无诱导心肌干细胞(cardiac stem cells,CSCs)分化为心肌细胞的作用,CSCs与心肌细胞接触能否影响CSCs向心肌分化。方法用免疫磁珠分选原代CSCs,得到纯化的c-Kit~+ CSC。分3组培养:条件液组用心肌条件培养液诱导CSCs 21 d,混合组分别用PKH 26或DAPI标记CSCs后与心肌细胞混合培养8 d,空白组无干预培养21 d,观察CSCs形态变化。各组完成培养后,用免疫组化法鉴定肌钙蛋白Troponin-T和缝隙连接蛋白connexin 43表达。结果心肌条件培养液不能有效诱导CSCs表达心肌细胞特异蛋白Troponin-T和connexin 43,未见自发搏动细胞。CSCs与心肌细胞接触后,两者同步搏动。CSCs可表达Troponin-T和connexin43。结论心肌条件培养液无诱导CSCs向心肌细胞分化的作用,心肌细胞与CSCs接触能有效诱导CSCs向心肌细胞分化。     

地塞米松对感染柯萨奇B-2病毒的人胚心肌细胞保护作用的实验研究

该研究拟从细胞水平观察地塞米松对感染ＣｏｘＢ－２病毒的人胚心肌细胞的作用效果。采用培养的人胚心肌细胞接种ＣｏｘＢ－２病毒，观察细胞生长、搏动情况及超微结构，测定心肌细胞释放的ＬＤＨ（乳酸脱氢酶）活性。发现地塞米松治疗组的心肌细胞搏动较感染组者维持时间长，心肌细胞病变发展亦较缓慢，且ＬＤＨ值明显低于感染组。说明地塞米松对感染ＣｏｘＢ－２病毒的人胚心肌细胞有明显的保护作用，提示临床上在重症病毒性心肌炎，特别是早期阶段，应用激素治疗能减轻心肌病变，对进一步的抢救病人有重要意义。     

牛磺酸对培养的心肌细胞缺氧再给氧损伤的保护作用

目的：观察牛磺酸对培养的心肌细胞损伤的影响。方法：以培养的心肌细胞为模型。在缺氧再给氧损伤细胞后,观察心肌细胞活力及搏动频率的变化,结果：牛磺酸可以提高心肌细胞的活力,提高心肌细胞的搏动频率,使心肌细胞的搏动频率明显恢复。结论：牛磺酸对缺氧再给氧损伤培养的心肌细胞有保护作用。     

乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定

目的探讨和建立适用于乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞体外分离、培养及鉴定的技术方法。方法乳小鼠心脏剪成组织块,用Ⅱ型胶原酶加胰蛋白酶联合消化法分离细胞,再通过差速贴壁分离法分别收集、培养乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞。光学显微镜下分别观察成纤维细胞和心肌细胞的基本形态特征的变化,并对2种细胞行苏木素-伊红(HE)染色,用第2代心肌成纤维细胞行波形蛋白免疫荧光鉴定,而原代心肌细胞行α-横纹肌肌动蛋白、心肌肌钙蛋白和心肌肌球蛋白重链免疫荧光鉴定。结果差速贴壁分离法心肌成纤维细胞原代培养90 min基本贴壁,贴壁较早,培养第3～5代细胞生长良好,72 h心肌成纤维细胞波形蛋白免疫荧光鉴定纯度高达97%;而心肌细胞贴壁较晚,24 h贴壁后部分心肌细胞出现自发性搏动现象,48 h后细胞逐渐展开,72 h后逐渐形成细胞簇并出现同步搏动,心肌肌球蛋白重链、心肌横纹肌肌动蛋白、心肌肌钙蛋白免疫荧光鉴定心肌细胞纯度分别为95%、93%、95%。结论差速贴壁分离法结合免疫荧光鉴定可分离乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞,此方法成熟、稳定、有效,为研究心脏疾病的基础与临床研究提供了理想的实验模型。     

交感神经节与心肌细胞联合培养中神经元的迁移

目的：探测交感神经节与心肌细胞联合培养中神经元迁移以及迁出的神经元与心肌细胞之问的关系。方法：用倒置相差显微镜定期观察神经纤维和心肌细胞的生长；终止培养后，用Holmes还原银染色法观察神经纤维的生长情况和单个神经元的迁移、生长情况及其与心肌细胞之间的关系。结果：在相同的培养条件下，联合培养中的某些区域可见由交感神经节组织块迁出许多单个神经元，散在于单层分散的心肌细胞之间，为双极或单极神经元，并发出突起加入邻近的神经纤维网或终止于心肌细胞表面；由单纯培养的交感神经节中生长出的神经纤维弯曲较多，并相互交织成网状，在神经纤维网之间偶尔可见由交感神经节组织块中迁出的神经元，亦为双极或多极神经元，其突起加入邻近的神经纤维网，迁出的神经元的数量较联合培养中由交感神经节组织块迁出的神经元少。结论：在体外联合培养中，单层分散的心肌细胞对交感神经节中神经元的迁移具有诱导作用。     

P19细胞向心肌细胞分化过程中ZNF207基因的表达变化

目的:观察锌指蛋白207基因(ZNF207)在P19细胞向心肌细胞诱导分化过程中表达水平的变化,探讨ZNF207基因与心肌细胞分化之间可能的关系.方法:体外培养P19细胞,应用0.9%二甲基亚砜(DMSO)诱导其向心肌细胞分化,采用RT-PCR技术在细胞分化成熟的不同时段检测P19细胞中ZNF207基因mRNA表达水平.结果:ZNF207基因在P19细胞向心肌细胞分化的过程中均有表达,随细胞分化成熟.该基因表达水平逐渐升高.经统计学分析发现,在分化第0～2天该基因表达无差异;第2～10天表达持续性增高,各时间点之间均有差异,差异均有统计学意义(P＜0.05);第10～17天该基因稳定高表达,各时间点之间无差异.结论:ZNF207基因在P19细胞向心肌细胞分化过程中表达逐渐上调,可能有利于心肌细胞的分化和发育.     

PKC信号传导通路在缺氧心肌细胞表达VEGF中的作用

目的：明确缺氧对心肌细胞表达血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）的影响及蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）信号传导通路在其中的作用。方法：将原代培养大鼠心肌细胞模型分组：①正常缺氧４组：Ａ组正常对照;Ｒ组缺氧６ｈ;Ｃ组缺氧１２ｈ：Ｄ组缺氧２４ｈ。②ＰＫＣ激动剂４组;Ａ组缺氧２４ｂ对照;Ｂ组加入ＰＭＡ１０ｎｇ／ｍｌ缺氧２４ｈ;Ｃ组加入ＰＭＡ１００ｎｇ／ｍｌ缺氧２４ｈ;Ｄ组加入ＰＭＡ１０００ｍｇ／ｍｌ缺氧２４ｈ。③ＰＫＣ抑     

沙棘总黄酮改善心肌肥大的分子药理机制

目的 探讨沙棘总黄酮改善高血压及慢性心力衰竭等疾病造成的心肌肥大的分子药理机制。方法 用机械牵张负荷离体培养大鼠心肌细胞，使心肌压力超负荷，造成肥大；并通过免疫组织化学方法观察不同浓度沙棘总黄酮对牵张诱导的心肌组织NF－κB激活的影响。结果 牵张离体培养心肌细胞10h后，NF－κB被激活；沙棘总黄酮抑制牵张诱导的心肌细胞NF－κB的激活，其抑制作用与沙棘总黄酮存在浓度依赖关系。结论 沙棘总黄酮通过抑制NF－κB信号传递系统的激活，引起细胞内相关分子表达调控机制改变，从而发挥其药理作用。     

新生大鼠原代心肌细胞的培养与鉴定

目的:探索简单易行、成功率高的心肌细胞培养方法。方法:取新生大鼠心脏心尖部剪成1 mm×1 mm×1 mm大小进行体外组织块贴壁培养。结果:成功培养出原代心肌细胞,并能够传代。心肌细胞台盼蓝染色显示存活率>87%,免疫组化染色鉴定纯度>90%。结论:通过上述方法可获得较高存活率及纯度的心肌细胞,该培养方法简单易行,重复性好,符合实验需求。     

pIRES2-EGFP-hVEGF165真核表达载体的构建及在心肌细胞内的表达

目的：构建plRES2-EGFP-hVEGF165真核表达质粒并在心肌细胞内表达．方法：应用限制性内切酶将目的片段VEGFl65克隆入含有增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达质粒plRES2-EGFP中．转染心肌细胞后，应用荧光显微镜检测EGFP的表达，以免疫组化法检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在体及离体表达．结果：构建了真核共表达载体plRES2-EGFP-hVEGF165．转染心肌细胞后，荧光显微镜观察可见EGFP的表达，免疫组化染色证实细胞内有VEGF的表达．结论：外源性hVEGF165基因可在心肌细胞内稳定表达．     

牵张激活心肌细胞NK—kB及其调控β—MHC基因表达的研究

目的 探讨牵张刺激引起心肌细胞β－MHC基因重新表达的机制。方法 在硅橡胶模上培养心肌细胞并施加牵张刺激，用免疫组织化学方法检测NF－kB的激活情况，并用图像分析法检测NF－kB在激活与未激活状态下β－MHC蛋白的含量。结果 ①心肌细胞受到应变为20％的牵张刺激5小时后，NF－kB被显著激活，从胞浆移位入胞核。②牵张组心肌细胞与对照组、NAC（N－乙酰半胱氨酸）组和牵张＋NAC组心肌细胞相比，β－MHC含量增加，其它3组β－MHC含量无明显差异。结论 NF－kB信号传统系统参与了牵张诱导的β－MHC基因表达的调控。③     

升主动脉缩窄大鼠左室心肌细胞结蛋白重构

目的：通过观察左室心肌细胞结蛋白在升主动脉缩窄后心肌肥厚期和心力衰竭期的表达，探讨心肌肥厚和心力衰竭发生的机理。方法：制作大鼠升主动脉缩窄动物模型，间接免疫荧光技术检测游离心肌细胞内结蛋白的分布，Western Blot技术检测新鲜心肌组织中结蛋白的表达。结果：心肌肥厚组和心力衰竭组左室心肌结蛋白表达与对照组相比明显增多；心力衰竭组结蛋白纤维在心肌细胞内的分布与对照组相比无明显差异。结论：心肌细胞结蛋白表达的改变是慢性后负荷性心肌肥厚向心力衰竭转变的重要因素。     

过氧化氢对原代心肌细胞及H9c2细胞的损伤作用

目的:考察过氧化氢对H9c2心肌细胞及原代心肌细胞损伤作用的相似性。方法:选用H9c2心肌细胞与新生大鼠原代心肌细胞,应用MTT法测定不同浓度过氧化氢对H9c2心肌细胞及原代心肌细胞活性的影响,观察两株细胞对过氧化氢损伤的敏感性。结果:600～1 600μmol/L的过氧化氢对H9c2心肌细胞及原代心肌细胞所造成的氧化损伤均具有浓度依赖性,1 200μmol/L的过氧化氢使H9c2心肌细胞的存活率降低40%～60%(P<0.01),表现出与原代心肌细胞相似的H2O2损伤敏感性(P>0.05)。结论:H9c2心肌细胞与原代心肌细胞对过氧化氢氧化损伤具有相似的作用和浓度依赖性。     

EFFECT OF PEROXISOME PROLIFERATOR-ACTIVATED RECEPTOR ACTIVATORS ON TUMOR NECROSIS FACTOR-αL EXPRESSION IN NEONATAL RAT CARDIAC MYOCYTES A

Objecfive To investigate the effect ofperoxisome proliferator-αctivated receptor-α (PPARα) and PPARγ activators on tumor necrosis factor-α (TNFα) expression in neonatal rat cardiac myocytes. Primary cultures of cardiac myocytes from 1- to 3-dayold Wistar rats were prepared, and myocytes were ex-posed to lipopolysaccharide (LPS) and varying concentrations of PPARα or PPARγ activator (fenofibrate or pioglitazone).RT-PCR and ELISA were used to measure TNFα, PPARα, and PPARγ expression in cultured cardiac myocytes. Transient transfection of TNFα promoter with or without nuclear factor-kappaB (NF-κB) binding site to cardiac myocytes was performed. Performed Pretreatment of cardiac myocytes with fenofibrate or pioglitazone inhibited LPS-induced TNFα mRNA and protein expression in a dose-dependent manner. However, no significant changes were observed on PPARα or PPARα mRNA expression when cardiac myocytes were pretreated with fenofibrate or pioglitazone. Proportional suppression of TNFα promoter activity was observed when myocytes was transiently transfected with whole length of TNFα promoter (-721/ 17) after being stimulated with LPS and fenofibrate or pioglitazone, whereas no change of promoter activity was observed with transfection of TNFα reporter construct in deletion of NF-κBbinding site (- 182/ 17). Conchusions PPARα and PPARγ activators may inhibit cardiac TNFα expression but not accompanied by change of PPARα or PPARγ mRNA expression. Therefore PPARα and PPARγ activators appear to play a role in anti-inflammation.The mechanism may partly be involved in suppression of the NF-κBpathway.