DNA-PKcs介导多药耐药恶性胶质瘤细胞化疗抗性及分子机制

目的：观察DNA依赖的蛋白激酶的催化亚单位（DNA-PKcs）对多药耐药的恶性胶质瘤细胞化疗抗性的影响,探讨其介导化疗抗性的分子机制。方法：采用siRNA技术构建DNA-PKcs基因表达沉默的人胶质瘤U251细胞株;采用Western blotting法检测U251细胞（U251细胞）、多柔比星（ADM）耐药的U251细胞（U251/ADM细胞）和DNA-PKcs基因表达沉默的多柔比星耐药的U251细胞（U251/ADM/siDNA-PKcs细胞）中DNA-PKcs蛋白表达水平;采用CCK8法检测3组细胞增殖活性;采用Western blotting法检测3组细胞中多药耐药性1（MDR1）、报告基因质粒pNF-κB/p6、总Akt蛋白、pAkt/T308和pAKT/S473蛋白表达水平。结果：U251/ADM细胞DNA-PKcs蛋白表达水平明显高于U251细胞和U251/ADM/siDNA-PKcs细胞（P<0.01）;ADM、紫杉醇（PTX）和吉西他滨（GEM）对U251/ADM/siDNA-PKcs细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）值较U251/ADM细胞明显降低（P<0.01）;U251/ADM/SIDNA-PKcs细胞中pAKT/S473、pNF-κB/p65和MDR1蛋白表达水平均明显低于U251/ADM细胞（P<0.05）,而两者总Akt和pAkt/T308蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：DNA-PKcs能明显增强多重耐药的恶性胶质瘤细胞化疗抗性,其作用机制与pAKT/S473和pNF-κB/p65表达上调,诱导MDR1表达有关。     

姜黄素逆转P—gp介导卵巢癌多药耐药机制的研究

目的探讨姜黄素对P糖蛋白（P—gP）介导的卵巢癌多药耐药的逆转作用及其可能机制。方法采用二苯基溴化四氮唑蓝（MTT）法检测人卵巢癌癌细胞株加药后的增殖,碘化丙啶（PI）染色法检测细胞凋亡率,western blot法检测P—Akt和P-gP的表达量。结果姜黄素合用顺铂处理细胞（OVCAR-3／DDP细胞株）48h,顺铂的浓度在0．05—5μg／ml时,加入姜黄素25μmol／L,耐药细胞生存率下降明显（P〈0．05）,尤以顺铂0．25μg／ml和姜黄素25μmol／L作用时耐药细胞生存率下降最明显。单用顺铂组细胞的凋亡率为（13．2±2．5）％,采用在顺铂基础上联合使用姜黄素后细胞凋亡率为（21．8±3．5）％,与单独使用顺铂相比,顺铂与姜黄素联合使用诱导细胞凋亡的作用显著增强（P〈0．05）。与单用顺铂0．25μg/ml相比,联合使用姜黄素后p-Akt和P-gP的表达量明显降低（P〈0．05）,2组间Akt的表达量差异无统计学意义（P〉0．05）。结论姜黄素不增加顺铂对OVCAR-3细胞毒性作用;对于OVCAR-3／DDP细胞株,姜黄素明显增加顺铂细胞毒性;姜黄素明显抑制了p-Akt和P—gP蛋白的表达。姜黄素可能通过抑制Akt信号通路降低P—gP的表达进而逆转多药耐药。     

Survivin反义寡核苷酸增强U251人胶质瘤细胞对顺铂的敏感性研究

目的研究Survivin反义寡核苷酸对U251人胶质瘤细胞顺铂治疗敏感性的影响。方法脂质体介导Survivin反义寡核苷酸转染U251人胶质瘤细胞，Western blot法检测内源性Survivin表达水平的变化，MTT法检测顺铂对细胞生长情况的影响，流式细胞仪（FCM）观察顺铂诱导各组U251细胞的凋亡。结果反义Survivin脂质体复合物能有效下调Survivin表达水平，并且能抑制U251细胞的生长，提高U251细胞对顺铂的敏感性。流式细胞仪检测凋亡率明显提高。结论Survivin反义寡核苷酸能增强顺铂诱导的U251细胞凋亡。Survivin反义寡核苷酸和顺铂联合用药对U251细胞生存具有协同抑制效应，可改善治疗效果。     

Genistein对胶质瘤细胞株U251MG作用的研究

目的探讨Genistein对胶质瘤细胞株U251MG的作用。方法采用光镜和倒置显微镜观察Genistein对胶质瘤细胞株U251MG生长的影响,并用流式细胞仪检测Genistein对U251MG细胞凋亡的影响。结果 Genistein在25μg/mL和50μg/mL作用48 h后,对U251MG细胞生长均有抑制作用,凋亡率均较对照组显著增加（P〈0.01）,并呈剂量依赖性。结论 Genistein既可以抑制U251MG细胞增殖,又可以诱导其凋亡。     

腺病毒介导hCTR1转染用于治疗顺铂耐受宫颈癌的基础研究

目的 诱导培养对顺铂耐药的人宫颈癌细胞株,并进一步研究针对宫颈癌细胞耐药的机制和相应的治疗方法。 方法 采用浓度梯度递增法使用顺铂处理人宫颈癌细胞C-33A,诱导出顺铂耐药细胞株C-33A/cis后,通过Western blot检测铜离子转运蛋白（copper transporter 1,CTR1）的表达改变,使用顺铂耐药细胞株C-33A/cis建立肿瘤皮下荷瘤模型,使用转染有hCTR1基因的腺病毒注射液（ad-hCTR1）并联合顺铂给药,观测肿瘤体积的改变,并在最后一次注射10 d后处死小鼠,通过免疫组化方法检测肿瘤组织中CTR1的表达。 结果 浓度梯度递增法诱导出的耐药细胞株C-33A/cis较亲代细胞C-33A对顺铂引起的细胞毒性敏感性下降,顺铂的半致死剂量浓度（IC₅₀）由（1.86±0.08）μmol/L提升至（8.11±0.21）μmol/L。Western blot结果显示耐药细胞C-33A/cis中CTR1的表达降低。利用顺铂耐药细胞株C-33A/cis建立的皮下瘤模型,在给予ad-hCTR1后,肿瘤组织内可检测到CTR1表达增高;对荷瘤鼠给予腺病毒转染CTR1联合顺铂给药后,肿瘤体积增长受到抑制。 结论 腺病毒转染CTR1联合顺铂给药可能提高耐药性宫颈癌的治疗效果。     

miR-18b-5p调控WWOX对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响

目的研究miR-18b-5p对胶质瘤U251细胞增殖、凋亡的影响和潜在的分子机制。方法qRT-PCR检测癌旁组织和胶质瘤组织中miR-18b-5p的表达,MTT法和流式细胞术检测胶质瘤U251细胞增殖和凋亡率,Western blotting检测包含WW域的氧化还原酶基因（WWOX）、Cyclin D1、p21、Bax和Bcl-2蛋白表达,双荧光素酶报告系统验证miR-18b-5p和WWOX的调控关系。结果与癌旁组织相比,胶质瘤组织中miR-18b-5p的表达量升高（P < 0.01）。抑制miR-18b-5p表达可以抑制胶质瘤U251细胞增殖并促进细胞凋亡;miR-18b-5p靶向负调控WWOX的表达;过表达WWOX可抑制U251细胞增殖并诱导细胞凋亡;抑制WWOX表达逆转了抑制miR-18b-5p表达对U251细胞增殖、凋亡的影响（P < 0.01）。结论miR-18b-5p可能通过靶向调控WWOX表达抑制胶质瘤U251细胞增殖并诱导细胞凋亡,miR-18b-5p是胶质瘤潜在的分子靶点。     

氯通道ClC-2反义寡核苷酸对顺铂作用下神经胶质瘤U251细胞侵袭力的影响

目的：探讨氯通道ClC-2 反义寡核苷酸(AON)抑制ClC-2基因表达对顺铂(DDP)作用下神经胶质瘤U251细胞侵袭力的影响,为ClC-2成为神经胶质瘤综合治疗的新基因靶点提供理论依据。方法：U251细胞按处理方法不同分为对照组（转染无义寡核苷酸）、AON组（转染ClC-2反义寡核苷酸）、DDP组（无义寡核苷酸与顺铂联用）和AON +DDP组（ClC-2反义寡核苷酸与顺铂联用）。应用RT-PCR检测相关基因ClC-2、cyclin D1 、MMP-2、MMP-9 mRNA表达;Transwell 小室侵袭实验检测各组细胞侵袭力;Transwell 小室迁移实验检测各组细胞迁移率。结果：与对照组比较,AON组、DDP组和AON +DDP组ClC-2、cyclin D1 、MMP-2、MMP-9 mRNA表达率降低（P＜0.05）;Transwell 小室侵袭实验中对照组、AON组、DDP组和AON +DDP组侵袭细胞数分别为81.00±4.58、42.01±4.36、48.33±2.52和12.67±5.13;与对照组比较,AON组、DDP组和AON +DDP组穿透细胞数明显降低（P＜0.05）。Transwell 小室迁移实验中AON 组、DDP组、AON +DDP组细胞迁移率（%）分别为72.40±2.20、51.48±1.29、37.87±1.50,与对照组比较均明显降低（P＜0.05）。结论：①转染ClC-2反义寡核苷酸能有效抑制ClC-2 mRNA表达;②抑制ClC-2 mRNA能降低U251细胞的迁移力和侵袭力;③ClC-2 mRNA表达降低可促进顺铂对U251细胞迁移力和侵袭力的抑制作用。     

人鼻咽癌顺铂耐药细胞株的建立及其生物学特性

目的建立人鼻咽癌顺铂耐药细胞株并探讨其生物学特性。方法采用药物大剂量冲击和逐渐增加剂量相结合的方法建立人鼻咽癌顺铂耐药细胞株CNE2/DDP,MTS法检测顺铂对CNE2和CNE2/DDP的半数抑制浓度(IC50)和耐药系数(RI),观察CNE2、CNE2/DDP细胞形态,绘制细胞生长曲线及计算细胞倍增时间,并用流式细胞仪检测细胞凋亡情况及Western blot法检测细胞MDR1表达水平。结果 MTS法检测DDP对CNE2的IC50为1.28μg/mL,CNE2/DDP的IC50为20.49μg/mL,RI达16。CNE2细胞形态饱满,长满时呈铺路石样紧密排列,CNE2/DDP细胞呈长梭形,CNE2/DDP较敏感细胞CNE2生长缓慢,倍增时间为39.0 h,流式细胞仪检测显示当DDP浓度大于1.0μg/mL时,CNE2的凋亡率明显高于CNE2/DDP细胞(P<0.05);进一步研究显示CNE2/DDP细胞中MDR1蛋白表达水平明显高于CNE2细胞。结论成功建立了稳定的人鼻咽癌顺铂耐药细胞株CNE2/DDP,且耐药性能显著,可作为深入研究鼻咽癌顺铂耐药机制较为理想的模型。     

Anti-uPAR单克隆抗体顺铂对胶质瘤增殖和uPAR蛋白表达的影响

目的研究Anti-uPAR单克隆抗体、顺铂对人脑胶质瘤细胞U251皮下瘤增殖影响以及尿激酶型纤溶酶原激活因子受体(uPAR)在U251皮下瘤的表达特征,评估其在胶质瘤恶性生长方式中的作用。方法以人脑胶质瘤细胞株U251为材料,制作裸鼠皮下胶质瘤模型。应用Anti-uPAR单克隆抗体、抗肿瘤药物顺铂干预肿瘤生长进程,使用免疫组化技术观察uPAR在肿瘤细胞的表达以及抗肿瘤效果。结果Anti-uPAR单克隆抗体、抗肿瘤药物都成功地抑制了肿瘤的生长,顺铂只能够降低U251移植瘤的增殖,而不能象Anti-uPAR单克隆抗体一样抑制肿瘤的生长并能使之缩小。顺铂抑制了uPAR蛋白在U251肿瘤细胞上的表达。结论uPAR与内源性uPA的结合是胶质瘤增殖及其生存的关键所在,针对uPA/uPAR为靶点的治疗方案可能为胶质瘤的治疗开辟一条新的研究思路。     

siRNA沉默肿瘤坏死因子α诱导蛋白2表达对胶质瘤细胞侵袭及增殖的影响*

目的 探讨沉默肿瘤坏死因子α诱导蛋白2（TNFAIP2）表达对胶质瘤细胞侵袭及增殖的影响。方法 使用Lipofectamine 2000介导siRNA转染胶质瘤细胞U87和U251下调TNFAIP2 mRNA的表达;运用细胞划痕及Transwell实验检测沉默TNFAIP2表达对U87及U251细胞迁移、侵袭的影响;通过CCK-8实验检测沉默TNFAIP2表达对胶质瘤细胞U87及U251增殖的影响。结果 Lipofectamine 2000介导si-TNFAIP2转染U87及U251细胞可下调TNFAIP2 mRNA的表达;沉默TNFAIP2表达可降低胶质瘤细胞U87和U251迁移侵袭的能力;沉默TNFAIP2表达可抑制U87及U251细胞的增殖。结论 siRNA沉默TNFAIP2表达可抑制胶质瘤细胞的侵袭和增殖。     

长春新碱诱导人脑胶质瘤细胞的耐药性

本文报告以细胞周期特异化疗药长春新碱（ＶＣＲ）对人脑胶质瘤Ｕ２５１ＭＧ细胞进行体外分步诱导法造成细胞的耐药性。细胞集落实验表明，经ＶＣＲ诱导的胶质瘤细胞Ｕ２５１ＶＲ—４０在１０～４０ｎｇ／ｍＬＶＣＲ培养液中，其细胞形成相当率是未诱导组Ｕ２５１ＭＧ细胞的２～１３倍（Ｐ＜０．０１）。同时，耐ＶＣＲ的Ｕ２５１ＶＲ—４Ｑ细胞对阿霉素（ＡＤＭ）亦有交叉耐药性，但与卡氮芥（ＢＣＮＵ）无耐药性产生。另外，５ｕｇ／ｍＬ尼卡地平（ＮＣＤＰ）能使其反转成药敏细胞。诱导过程中还发现，Ｕ２５１ＭＧ胶质瘤细胞直接在高浓度ＶＣＲ（６０ｎｇ／ｍＬ培养液中被杀伤和发生明显形态变化后，仍有少数细胞在无化疗药培养环境７～１０天可以复苏并且再增殖。研究结果不仅表明ＶＣＲ诱导的胶质瘤细胞能够产生多药耐受性（ＭＤＲ），而且提示该胶质瘤细胞中可能还存在一种修复微管系统的抗药机理。     

CREB参与胶质瘤细胞多药耐药分子机制的研究

目的 分析CREB基因参与胶质瘤U251细胞系多药耐药的形成及可能存在的机制. 方法 免疫组化法检测各级别脑胶质瘤标本中CREB水平差异;分布诱导法建立胶质瘤U251耐药细胞系U251/TR;Crispr/cas9特异性敲除耐药株的CREB基因,流式细胞分析术(FCM)检测药物干预下细胞凋亡情况;Western blotting、rt-PCR检测ABCG2、MGMT、MRP及P-gp基因表达水平. 结果 成功培养出稳定的脑胶质瘤耐药细胞系U251/TR,耐药倍数为7.特异性敲除耐药株CREB基因获得U251/RC细胞系,TMZ干预下U251/RC凋亡水平远高于U251/TR.Western及rt-PCR测定结果显示,U251/RC的ABCG2、MGMT、MRP及P-gp表达水平均明显降低. 结论 CREB通过多种机制参与调控下游ABCG2、MGMT、MRP及P-gp的表达水平,参与胶质瘤细胞多药耐药性的产生与发展.     

去泛素化酶USP9X对胶质瘤细胞U251放射敏感性的影响

目的:通过检测放疗对胶质瘤细胞β-catenin及去泛素化酶USP9X表达的影响,以期了解去泛素化酶USP9X与胶质瘤细胞放射敏感性的关系。方法:培养胶质瘤细胞U251细胞株,通过不同放疗剂量照射后,Realtime PCR法检测细胞中USP9X与β-catenin基因表达,Western Blotting法检测USP9X与β-catenin的蛋白表达,流式细胞仪检测不同放射剂量处理后U251细胞凋亡水平。结果:Real Time PCR结果显示在1Gy放疗剂量照射时USP9X和β-catenin的表达水平最高,随后随放疗剂量增加,USP9x和β-catenin基因表达成下降趋势,WesternBlotting结果显示USP9x、β-catenin的蛋白表达量与基因表达水平成正相关,凋亡实验结果显示细胞凋亡率与放射剂量成正相关。结论:在1Gy放疗剂量照射时USP9X和β-catenin的表达水平最高,证明小剂量放疗可提高U251细胞的放射抵抗,随后随放疗剂量增加,USP9x和β-catenin的表达成下降趋势,证明USP9x与胶质瘤细胞的放射后凋亡水平相关。     

MGMT介导的人脑胶质瘤耐药细胞系的建立

目的：建立由O^6-甲基鸟嘌呤－DNA甲基转移酶（MGMT）介导的人脑胶质瘤耐药细胞株U251／BCNU。方法：模拟卡氮芥（BCNU）的临床用药程序,采取恒定药物浓度、周期性使用的方式诱导U251的抗药性。检测U251／BCNU的耐药指数及MGMT mRNA的表达;比较U251及U251／BCNU细胞的体外增殖变化。结果：经过反复总共5次的用药过程,历时4个月,成功地建立了对BCNU具有稳定抗药性的U251／BCNU,其对BCNU的耐受程度约为U251的17倍。RT－PCR显示,U251／BCNU细胞有MGMTmRNA的表达。U251及U251／BCNU细胞的体外群体倍增时间差异无显著性。结论：在体外成功地建立了一株由MGMT介导的人脑胶质瘤耐药细胞系,为进一步探讨胶质瘤的耐药机制及逆转方式奠定了基础。     

肿瘤坏死因子α诱导蛋白3在胶质瘤中的表达特性及其对胶质瘤细胞侵袭和迁移的影响

目的 探讨肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(TNFAIP3)在胶质瘤中的表达及其对胶质瘤细胞侵袭、迁移的影响。方法 采用实时荧光定量法(qRT-PCR)检测人星形胶质细胞NHA和胶质瘤细胞株U87、U251、SNB19、T98和LN229中TNFAIP3的表达,以U87和SNB19为实验对象。使用阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导小干扰RNA(siRNA)转染U87和SNB19以下调TNFAIP3的表达;采用Transwell检测下调TNFAIP3对U87及SNB19侵袭的影响;运用划痕实验检测下调TNFAIP3对U87及SNB19迁移的影响。结果 和NHA(0.144±0.008)相比,TNFAIP3在U87(1.380±0.066)、U251(0.663±0.062)、SNB19(1.405±0.032)、T98(1.002±0.068)、LN229(0.667±0.027)中的表达均升高(均P<0.05)。si-TNFAIP3转染U87及SNB19可下调TNFAIP3的表达,继续培养24 h, U87及SNB19侵袭和迁移能力均下降(均P<0.05)。结论 ...     

MiR-148a-3p靶基因的预测与验证

目的:预测和验证miR-148a-3p的靶基因.方法:利用生物信息学方法预测miR-148a-3p的靶基因;在神经胶质瘤细胞U87/U251中建立miR-148a过表达及抑制表达稳定细胞系.利用qPCR实验验证miR-148a-3p与靶基因的靶向关系;利用Western Blot实验检测靶蛋白表达水平.结果:生物信息学方法预测结果显示dynein light chain LC8-type 2(DYNLL2)为miR-148a-3p靶基因之一;qPCR实验结果显示DYNLL2在神经胶质细胞HA1800与神经胶质瘤细胞U87/U251中的表达有差异,在神经胶质瘤细胞miR-148a过表达及抑制表达的细胞中表达有差异;Western Blot实验结果显示DYNLL2的蛋白表达水平在神经胶质细胞HA1800与胶质瘤细胞U87/U251中有差异.结论:miR-148a-3p与DYNLL2有确切的靶向关系,DYNLL2在神经胶质细胞与胶质瘤细胞中均有表达,与正常胶质细胞相比,DYNLL2在神经胶质瘤细胞中表达下调,包括基因水平和蛋白水平,miR-148a-3p能够负向调控DYNLL2的表达.     

上调microRNA-34a抑制胶质瘤细胞的增殖及侵袭

目的 探讨microRNA-34a(miR-34a)在胶质瘤组织中的表达情况以及对人脑胶质瘤细胞系U251增殖及侵袭的影响.方法 选取川北医学院附属医院2013年3月至2017年3月胶质瘤组织标本30例和重症脑外伤需行手术者正常脑组织标本10例作为研究对象,采用荧光定量PCR法检测miR-34a在胶质瘤组织表达情况.体外实验,将人工合成的miR-34a模拟物miR-34a mimic转染至U251细胞系,采用荧光定量PCR、MMT、Transwell法检测miR-34a在U251细胞系中表达以及对U251细胞增殖和侵袭能力的影响.依据细胞转染情况,分为Control组(不转染任何基因)、Mock组(转染miRNA-neg序列)和miRNA-34 a mimic组(转染miRNA-34a mimic序列).结果 miRNA-34a在人脑胶质瘤组织中相对表达水平为(0.35±0.07),低于正常人脑组织的(1.00±0.13),差异有统计学意义(P<0.05);转染后,荧光定量PCR结果显示,Control组、Mock组、miRNA-34a mimic组miRNA-34a相对表达水平分别为(1.00±0.08)、(0.98±0.11)和(6.19±0.34),miRNA-34a mimic组与Control、Mock组比较,差异有统计学意义(P<0.05);MMT结果显示,在不同时间点,miRNA-34a mimic组U251细胞增殖抑制率高于Control组、Mock组,差异有统计学意义(P<0.05);Transwell结果显示,Control组、Mock组、miRNA-34a mimic组侵袭细胞数分别为(90.53±5.84)个、(88.21±5.04)个和(27.46±2.76)个,miRNA-34a mimic组与Control、Mock组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论miR-34a在胶质瘤组织中表达下调,上调miR-34a表达可抑制胶质瘤细胞的增殖及侵袭.     

鸦胆子油乳对胶质瘤U251细胞血管内皮生长因子表达水平的影响

目的:研究鸦胆子油乳对胶质瘤U251细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达水平的抑制情况.方法:体外培养人脑胶质瘤U251细胞,设置对照组和3个药物组(鸦胆子油乳终质量浓度分别为5 g/L、25 g/L和1.25 g/L),利用酶联免疫吸附法测定培养细胞上清液中VEGF含量;应用免疫细胞化学法检测胶质瘤U251细胞中VEGF的变化.结果:酶联免疫吸附法测定培养细胞上清中VEGF含量显示,随着药物浓度的增加U251细胞分泌的VEGF均较对照组明显减少(P<0.01).免疫组织化学显示,随着鸦胆子油乳注射液作用剂量的增加,VEGF蛋白的表达逐渐减少.结论:鸦胆子油乳注射液能抑制胶质瘤细胞中VEGF的表达.