人胎脑星形胶质细胞原代分离培养及鉴定

目的探索并建立人胎脑星形胶质细胞的原代培养方法.方法分别以组织块法和消化法分离、培养和纯化人胎脑星形胶质细胞,并用形态学观察和免疫细胞化学方法进行鉴定.结果组织块法的培养效果优于消化细胞培养法;原代培养、纯化的细胞生长稳定,经鉴定为星形胶质细胞.结论采用组织块法原代培养人胎脑星形胶质细胞,简单易行、所获细胞纯度高,可用于体外星形胶质细胞的进一步研究.     

原代小胶质细胞及神经元细胞培养不同纯化方法的比较

目的探讨建立简便高效的原代小胶质细胞及神经元培养和纯化方法。方法神经元与胶质细胞混合培养后,采用温和胰酶消化法、恒温振荡法、利多卡因分离法及手摇法分离纯化小胶质细胞,无血清培养法及阿糖胞苷法分离纯化神经元,细胞计数、流式细胞术及细胞化学染色鉴定小胶质细胞及神经元。结果手摇法分离纯化小胶质细胞与温和胰酶消化法、恒温振荡法、利多卡因分离法比较,细胞产量更高、活性更好;无血清培养法培养神经元比阿糖胞苷法细胞纯度更高、活性更好,形成神经网络结构的时间也更早。结论手摇法分离纯化小胶质细胞是产量最高、简便、经济的方法,而无血清培养法更能提高神经元的纯度及活性。     

胎大鼠脑内小胶质细胞的分离纯化和鉴定

 摘要：目的 分离纯化和鉴定胎大鼠脑内小胶质细胞,为小胶质细胞的研究奠定基础。方法 利用盐酸利多卡因注射液联合震荡培养法分离纯化胎大鼠脑内小胶质细胞,免疫荧光技术及流式细胞技术鉴定小胶质细胞的纯度。结果 通过盐酸利多卡因注射液联合震荡培养法,得到98%纯度的小胶质细胞。结论 盐酸利多卡因注射液联合震荡培养法是一种能获得较高纯度胎大鼠脑内小胶质细胞的方法。     

新生大鼠大脑O-2A细胞系的分离纯化和双向分化培养

目的在体外培养条件下获取纯度较高的O-2A细胞系细胞并探索其分化规律。方法根据星形胶质细胞、O-2A祖细胞的生长时间差异及细胞的粘附特性不同，采用振荡法和差速贴壁法，结合1型星形胶质细胞条件培养液，培养、分离纯化O-2A祖细胞。结果纯化的O-2A祖细胞胞体呈椭圆形，具有典型的双极突起；经免疫细胞化学染色鉴定，细胞的纯度达90％。在有血清的情况下，O-2A祖细胞定向分化为2型星形胶质细胞；在无血清的情况下，定向分化为少突胶质细胞。结论通过振荡法和差速贴壁法，结合1型星形胶质细胞条件培养液分离纯化培养的O-2A祖细胞具有双分化潜能。     

受体相互作用蛋白140在小鼠原代小胶质细胞中的表达分析

目的:分离、纯化和原代培养小鼠的小胶质细胞并检测该细胞中受体相互作用蛋白140(RIPl40)的表达模式.方法:以McCarthy等的经典培养方法为基础进行小鼠小胶质细胞的分离,以不换液营养缺失法、机械振摇法纯化和培养小鼠小胶质细胞;用CD11b(MAC-1)对分离的小鼠小胶质细胞进行鉴定;采用实时-聚合酶链反应和western免疫印迹法检测RIP140 mRNA和蛋白质在小鼠原代小胶质细胞中的表达模式:用免疫细胞化学确定RIP140在小胶质细胞中的定位表达模式.结果:成功对小鼠小胶质细胞进行了分离、纯化和培养;mRNA和蛋白表达分析显示,RIP140在小鼠原代小胶质细胞中确有表达,免疫组化结果提示RIP140主要在小鼠小胶质细胞的细胞核中表达.结论:利用McCarthy经典改良方法可成功分离纯化出高纯度小鼠原代小胶质细胞;小鼠原代小胶质细胞确实表达RIP140,以细胞核表达为主.     

一种改良小胶质细胞的培养方法

目的建立一种简便高效的小胶质细胞的原代培养及纯化方法。方法无菌环境下采取雄性新生SD大鼠（24h内）全脑,清洗、剪碎,以0.25%胰蛋白酶消化,200目滤网过滤,混合培养。9d后,利用盐酸利多卡因注射液代替传统机械振摇纯化分离小胶质细胞;采用免疫细胞化学方法检测CD11b/c的表达情况,观察小胶质细胞形态。结果改良方法可获得高产量和高纯度的小胶质细胞。显微镜下可见刚贴壁的小胶质细胞多为圆形,边缘不规则;培养4～5d后小胶质细胞形态多呈阿米巴样,折光不均。结论该方法步骤简便,可有效地提高小胶质细胞的产量和纯度,具有较高的实用价值,为研究与小胶质细胞相关的疾病提供了基础。     

一种新的小胶质细胞分离纯化方法

目的 建立一种高效率的原代小胶质细胞体外分离纯化方法.方法 以McCarthy等经典的小胶质细胞原代培养培养方法为基础,并进行改进,使用低浓度胰酶消化法帮助小胶质细胞从混合培养的胶质细胞分离下来,用OX42抗体免疫组化染色鉴定.结果 获得了高纯度的小胶质细胞.结论 低浓度胰酶消化法分离小胶质细胞与经典的振摇分离法所获得的纯度相当,但提高了细胞的分离效率.     

大鼠脑皮质星形胶质细胞的纯化培养

目的获取纯度较高的大鼠脑皮质星形胶质细胞，用于进一步实验。方法取新生大鼠大脑，用酶消化结合机械吹打方法分离皮质细胞制成细胞悬液，差速贴壁法去除成纤维细胞，培养融合时，恒温摇床振荡法去除少突胶质细胞、小胶质细胞等，纯化后，观察星形胶质细胞生长变化规律，并通过GFAP免疫细胞化学方法鉴定星形胶质细胞。结果大鼠脑皮质细胞接种后24h全部贴壁，部分细胞已伸出突起；3～5d时细胞增殖最明显，细胞数目增加，体积增大，突起相互交织成网状；原代培养7～10d时细胞基本融合并开始分层生长。振荡纯化处理后，GFAP免疫细胞化学染色阳性细胞可达98％。结论用差速贴壁和恒温振荡方法可获得高纯度皮质源性星形胶席细胸．     

新生大鼠大脑皮质O-2A祖细胞的体外诱导分化

目的 :探索新生大鼠大脑皮质O -2A祖细胞的体外分离纯化的培养条件 ,并观察其在体外增殖、分化的规律 ;鉴定体外培养的O -2A祖细胞、2型星形胶质细胞及少突胶质细胞。方法 :根据 1型星形胶质细胞、O -2A祖细胞的生长时间差异及细胞的粘附特性不同 ,采用振荡法和差速贴壁法 ,并结合使用生长因子 (PDGF ,bFGF )刺激O -2A祖细胞增殖 ,从而分离纯化、扩增O -2A祖细胞 ;观察O -2A祖细胞在有血清 (D/F + 2 0 %FCS)和无血清 (CDM )培养条件下的分化情况。免疫细胞化学法鉴定O -2A祖细胞(A2B5 )和分化成熟的 2型星形胶质细胞 (GFAP ,A2B5 )及少突胶质细胞 (CNPase)。结果 :①分离纯化的O -2A祖细胞胞体呈椭圆形 ,具有典型的双极或三极突起 ;经免疫细胞化学染色鉴定 ,A2B5抗体标记阳性 ,细胞纯度达 95 % ;②应用有血清的培养基诱导O -2A祖细胞定向分化为 2型星形胶质细胞 ,2型星形胶质细胞的胞体较大 ,突起多而细长 ,GFAP和A2B5抗体标记均为阳性 ;③应用无血清的化学条件培养基诱导O -2A祖细胞定向分化为少突胶质细胞 ,少突胶质细胞的胞体小 ,突起短而细 ,相互交织呈“蜘蛛网”样 ,CNPase抗体标记阳性。结论 :①采用振荡法和差速贴壁法 ,并结合使用生长因子 ,建立了分离纯化O -2A祖细胞的方法 ;②分离纯化的O -2A     

高纯度少突胶质前体细胞改良培养方法的建立

目的对传统培养方法进行改良,以获得更高纯度的少突胶质前体细胞（OPCs）。方法新生1～2d Sprague-Dawley（SD）大鼠的大脑皮质混合胶质细胞原代培养8d后,采用恒温摇床振荡分离法、差速贴壁法和胰酶消化法结合条件限定培养基纯化培养细胞,台盼蓝染色光学显微镜观察细胞形态;纯化培养2d后进行A2B5和DAPI免疫荧光染色鉴定和细胞纯度分析。结果光学显微镜观察发现纯化培养细胞的胞膜完整,细胞无损伤;免疫荧光染色后细胞纯度分析显示,A2B5染色阳性细胞占DAPI染核细胞的百分比为98.14%。结论通过对传统的混合胶质细胞培养及振荡分离和纯化方法的改进,能够培养出高纯度的OPCs。     

高纯度少突胶质前体细胞改良培养方法的建立

目的 对传统培养方法进行改良,以获得更高纯度的少突胶质前体细胞(OPCs)。方法 新生1~2 d Sprague-Dawley（SD）大鼠的大脑皮质混合胶质细胞原代培养8 d后,采用恒温摇床振荡分离法、差速贴壁法和胰酶消化法结合条件限定培养基纯化培养细胞,台盼蓝染色光学显微镜观察细胞形态;纯化培养2 d后进行A2B5和DAPI免疫荧光染色鉴定和细胞纯度分析。结果 光学显微镜观察发现纯化培养细胞的胞膜完整,细胞无损伤;免疫荧光染色后细胞纯度分析显示,A2B5染色阳性细胞占DAPI染核细胞的百分比为98.14%。结论 通过对传统的混合胶质细胞培养及振荡分离和纯化方法的改进,能够培养出高纯度的OPCs。     

成年犬骨骼肌成肌细胞的培养纯化、鉴定及生长特性的研究

目的 建立简便、有效的成年犬骨骼肌成肌细胞(skeletal myoblast cells,SMCs)体外分离培养、纯化和鉴定的方法,并观察犬SMCs的生长特性.方法 采用机械分解法与IA型胶原酶和胰蛋白酶的二步酶消化法相结合,分离消化法培养获取犬SMCs,用DMEM培养液培养,以Ficoll梯度液纯化,进行Desmin免疫组化鉴定,并观察细胞形态、生长特性.结果 犬SMCs培养后经台盼蓝检查成活率达95%以上,在接种后4～5 d增殖达高峰,细胞生长旺盛;Ficoll分离纯化的SMCs纯度较高;Desmin免疫细胞化学染色有97%的SMCs胞浆呈阳性反应.结论 改良方法获得的SMCs具有良好的增殖、分化能力;采用Ficoll纯化以血清培养,即可获得高产量高纯度的SMCs.     

小胶质细胞培养、分离、纯化和鉴定的初步研究

目的：探讨培养、纯化小胶质细胞的方法。方法：新生大鼠，取脑组织捣碎、消化、培养。用振摇法分离小胶质细胞，并进行传代、鉴定。结果：分离、培养的小胶质细胞，细胞折光性强，圆形，一些细胞有短的突起，小胶质细胞特异性标记抗体CD68免疫化学染色显示小胶质细胞的纯度在95％以上。结论：本实验方法所培养的小胶质细胞纯度高，为其功能研究奠定了基础。     

犬成年骨骼肌成肌细胞的培养纯化、鉴定及生长特性的研究

目的建立简便、有效的成年犬骨骼肌成肌细胞（skeletal myoblast cells，SMCS）体外分离培养、纯化和鉴定的方法，并观察犬SMCs的生长特性。方法采用机械分解法与IA型胶原酶和胰蛋白酶的二步酶消化法相结合，分离消化法培养获取犬SMCs，用DMEM培养液培养，以Ficoll梯度液纯化，进行Desmin免疫组化鉴定，并观察细胞形态、生长特性。结果犬SMCs培养后经台盼蓝检查成活率达95％以上，在接种后4～5d增殖达高峰，细胞生长旺盛；Fiooll分离纯化的SMCs纯度较高；Desmin免疫细胞化学染色有97％的SMCs胞浆呈阳性反应。结论改良方法获得的SMCs具有良好的增殖、分化能力；采用FicollU纯化以血清培养，即可获得高产量高纯度的SMCs。     

视神经星形胶质细胞原代培养技术研究

目的　介绍一种快速原代培养、分离、纯化视神经星形胶质细胞的方法。方法　对P2期小鼠的视神经进行组织块原代培养,振荡法分离纯化,形态学观察,免疫组织化学染色。结果　培养的星形细胞纯度高,GFAP染色显示98%阳性。结论　组织块原代培养,振荡法分离纯化视神经的星形胶质细胞,对细胞的损伤小、纯度高,是快速得到该细胞的理想途径。     

视神经星形胶质细胞原代培养技术研究

目的 介绍一种快速原代培养、分离、纯化视神经星形胶质细胞的方法。方法 对P2期小鼠的视神经进行组织块原代培养,振荡法分离纯化,形态学观察,免疫组织化学染色。结果 培养的星形细胞纯度高,GFAP染色显示98%阳性。结论 组织块原代培养,振荡法分离纯化视神经的星形胶质细胞,对细胞的损伤小、纯度高,是快速得到该细胞的理想途径。     

视网膜小胶质细胞活化模型的建立

目的: 建立视网膜小胶质细胞培养、纯化和鉴定的方法,以观察视网膜小胶质细胞活化后的形态和功能变化,探讨活化的小胶质细胞在糖尿病视网膜病变时的可能作用. 方法: 以细菌内毒素脂多糖(LPS)活化小胶质细胞,通过免疫细胞化学及con-focal显微镜技术、流式细胞术、MTT、ELISA等方法观察视网膜小胶质细胞形态、数量和功能的变化. 结果: 视网膜小胶质细胞纯度在96%以上,LPS激活的小胶质细胞发生形态改变,CD11b表达上调,释放细胞因子TNF-α,而细胞数量无明显改变. 结论: 从细胞免疫表型、纯度、形态学和分泌功能等方面都证明,本方法是一种稳定、高效的小胶质细胞分离纯化方法.     

小鼠脑内星形胶质细胞体外培养方法的优化

目的： 优化小鼠脑内星形胶质细胞的体外培养方法,为星形胶质细胞的功能研究奠定实验基础。 方法： 取新生0～1 d的C57BL/6乳鼠大脑皮质,胰酶消化结合机械吹打方法,分离皮质细胞,制成细胞悬液并差速贴壁处理,待细胞接种24 h轻柔换液,以后每隔2～3 d换液,且每次换液前手动振荡洗涤2次,传代3次后,行胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）免疫细胞化学染色及免疫荧光染色鉴定。 结果： 经过原代及传代培养,获得形态典型、纯度在95%以上的星形胶质细胞。结论： 优化后的体外培养星形胶质细胞方法,稳定有效,操作简便易行,并可获得高纯度的星形胶质细胞。     

SD大鼠脑皮层星形胶质细胞的原代培养及纯化方法改良

目的:探讨大鼠大脑皮层星形胶质细胞的培养方法,以获得纯度高的细胞进一步对其进行体外实验研究。方法:在Mc-Carthy方法基础上改用出生后1d的SD大鼠的大脑皮层,结合机械分离和胰酶消化后制备单细胞悬液接种,差速贴壁1h,培养14d以后上摇床以去除混杂细胞,细胞融合后传代,每次传代前都经历胰酶冲洗和差速贴壁,传3代后利用GFAP-FITC免疫荧光法对所获细胞进行鉴定。结果:经过原代传代及纯化,大脑皮层星形胶质细胞体外培养成功,并有较高的纯度。GFAP-FITC免疫荧光染色阳性。结论:经过合理取材、改良纯化方法后,可以更为简便得到纯度很高的星形胶质细胞。     

新生大鼠少突胶质前体细胞的培养与鉴定

目的 在体外培养条件下获取纯度较高的少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells,OPCs).方法 原代混合胶质培养,利用振荡法和差速贴壁法分离纯化少突胶质前体细胞,再用无血清化学条件培养基培养.免疫荧光法及膜片钳记录细胞电生理特性进行鉴定.结果 振荡分离后超过90%细胞为NG2阳性OPCs:OPCs电生理特性:输入阻抗Ra相对较高;电压依赖的K 电流具有外向整流特性;对河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)敏感的小的内向Na 流,不能产生动作电位.结论 振荡法结合差速贴壁可以获得纯度较高的OPCs;OPCs具有区别于神经元、星型胶质细胞、小胶质细胞的独有电生理特性.