沉默整合素α6通过激活FOXO1信号通路促进人牙髓干细胞的成牙本质向分化

目的:探讨沉默整合素α6(integrinα6,ITGA6)是否通过激活FOXO信号通路影响人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)的成牙本质向分化。方法:利用课题组前期构建的ITGA6沉默慢病毒干扰hDPSCs,通过Real-time PCR和Western blot验证干扰效率,同时检测空载组(sh-NC)和ITGA6沉默组(sh-ITGA6)的FOXO信号通路活性。然后用AS1842856抑制FOXO1,经矿化诱导7 d后进行Western blot和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色来观察hDPSCs的成牙本质向分化情况。结果:Real-time PCR和Western blot结果显示构建的ITGA6沉默慢病毒能有效干扰hDPSCs中ITGA6的表达;与sh-NC组比,sh-ITGA6组FOXO1在mRNA水平表达上调(P<0.05),同时Western blot结果显示其在胞核表达量增加(P<0.05);Western blot检测成牙本质向分化标记物显示,sh-ITGA6组牙本质...     

Notch信号通路参与BMP-6对人牙髓细胞增殖分化作用的研究

目的:本研究通过观察骨形成蛋白-6(BMP-6,bone morphogenetic protein-6)对人牙髓细胞(hDPCs,humandentalpulp cells)增殖和成牙本质向分化的影响,以及Notch信号在其中可能的作用,初步探讨骨形成蛋白-6在牙髓损伤修复中的作用与机制。方法:采用组织块酶消化法体外培养hDPCs,分别应用BMP-6和γ-分泌酶抑制剂DAPT单独或共处理第3-5代hDPCs,采用CCK8法检测细胞增殖情况,碱性磷酸酶(ALP,alkalinephosphatase)试剂盒检测ALP活性,茜素红染色法检测矿化结节形成情况,观察牙髓细胞的增殖及成牙本质向分化能力。结果:CCK8结果显示,BMP-6促进hDPCs增殖,DAPT抑制hDPCs增殖,而经DAPT预处理的hDPCs,BMP-6对其促增殖作用减弱,与对照组相比均具有统计学差异(P<0.05);ALP结果显示,BMP-6可促进hDPCs的ALP活性,DAPT则明显抑制其ALP活性,与对照组相比均具有统计学差异(P<0.05),且DAPT可减弱BMP-6对细胞ALP活性的增强作用,与BMP-6组比较具有统计学差异(P<0.05);茜素红染色结果显示,BMP-6处理组矿化结节数量最多,BMP-6和DAPT共处理组次之,DAP7处理组最少。结论:BMP-6可促进hDPCs增殖和成牙本质向分化能力,而阻断Notch信号,可抑制BMP-6对hDPCs的促增殖及促成牙本质向分化作用。     

小檗碱对牙髓干细胞MAPK/ERK信号通路及成牙本质向分化的影响研究

目的 探讨小檗碱对牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)成牙本质向分化及p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路的影响.方法 采用酶消化法提取DPSCs,将培养鉴定的DPSCs传代培养至第3～5代,用于以下实验.实验分为对照组(正常培养DPSCs)、矿化...     

Notch配体Delta1对人牙髓干细胞分化的影响

目的:探讨Notch配体Delta1对体外人牙髓干细胞(dentalpulpstemcells,DPSCs)向成牙本质细胞分化能力的影响。方法:利用逆转录病毒载体建立高表达人Delta1基因的人牙髓干细胞系;实验分三组,正常牙髓干细胞组、转导细胞组及混合组(正常与转导细胞比例为100∶1),分别进行体外分化诱导。倒置显微镜观测各组细胞各生长期出现的时间;VonKossa染色计数各组形成钙化结节数;Westernblot法检测各组细胞牙本质涎磷蛋白表达。结果:与正常牙髓干细胞相比,转导细胞各生长期出现时间明显提前,形成的钙化细胞结节数目显著增加,牙本质涎磷蛋白表达显著升高。结论:Delta1基因转导牙髓干细胞仍保持了体外向成牙本质细胞分化的能力;Notch-Delta1信号与分化诱导因子协同作用可促进人牙髓干细胞向成牙本质细胞分化。     

白藜芦醇在人牙髓干细胞成牙本质向分化中的调控机制研究

目的：探讨白藜芦醇是否通过上调沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)的表达并激活β-catenin信号通路,从而促进人牙髓干细胞（DPSCs）成牙本质向分化。方法：不同浓度白藜芦醇（0、10、15、20、50μmol/L）作用于DPSCs 7天和14天后,利用CCK-8法检测细胞增殖活性。在15μmol/L白藜芦醇作用下,成牙本质向分化诱导培养DPSCs 7天后,检测碱性磷酸酶（ALP）活性;采用实时定量反转录PCR(qRT-PCR)检测Runt相关转录因子2(Runx2)、牙本质涎磷蛋白（DSPP）和牙本质基质蛋白1(DMP-1)的mRNA表达情况;采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测DPSCs分化诱导不同时间（0、3、5、7、14天）后SIRT1的蛋白表达情况。15μmol/L白藜芦醇作用下分化诱导培养DPSCs 7天后,检测SIRT1和活化β连环蛋白（β-catenin）表达水平。采用GraphPad Prism 9软件包对数据进行统计学分析。结果：15μmol/L白藜芦醇对DPSCs 7天和14天的增殖活性...     

PI3K/AKT信号通路对体外人牙髓细胞增殖和成牙本质向分化能力的影响

目的 研究PI3K/AKT信号通路对人牙髓细胞（hDPC）体外增殖作用和成牙本质向分化能力的影响.方法 体外培养hDPC,采用PI3K通路抑制剂LY294002（LY）处理hDPC,CCK8法检测细胞增殖情况,Western blot蛋白印记检测PI3K/AKT通路下游蛋白AKT、磷酸化AKT（p-AKT）水平在6、12、24、48、72 h的改变,检测成牙本质向分化指标DSPP的蛋白水平变化;设立空白对照组、矿化诱导组、LY组、矿化诱导＋LY组共4组,成牙本质向矿化诱导14 d,茜素红染色检测矿化结节形成情况.结果 CCK8结果显示,LY294002在24、48和72 h可抑制hDPC的增殖（24 h：Z=-0.358,P＜ 0.05;48 h：t=11.674,P＜ 0.05;72 h：t=10.832,P＜ 0.05）;Western blot显示,LY294002抑制PI3K/AKT通路下游蛋白p-AKT活性,在24 h时作用最明显,成牙本质向分化指标DSPP蛋白水平降低;茜素红染色结果显示,矿化结节的数量B组最多、C组最少.结论 PI3K/AKT信号通路可促进hDPC的增殖和成牙本质向分化能力.     

牙髓干细胞分化的研究进展

牙髓干细胞(DPSC)是一种具有高度增生、自我更新能力和多相分化潜能的成体干细胞,在一定条件下可向特定的细胞类型分化,在牙髓修复和牙齿再生中发挥着重要的作用。本文主要就DPSC成骨向分化、成牙本质向分化的研究进展作一综述。     

组蛋白去甲基化酶Jmjd3对牙髓干细胞成牙本质向分化的影响研究

目的研究组蛋白去甲基化酶Jmjd3对牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)成牙本质向分化的影响。方法原代分离培养DPSCs,用流式细胞术和茜素红染色鉴定DPSCs。体外诱导DPSCs成牙本质向分化不同时间(0、3、5、7、14 d),qRT-PCR检测Jmjd3及成牙本质细胞标志物牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein1,DMP1)的表达情况。用不同浓度(0、1、10μmol/L)的Jmjd3抑制剂GSK-J4处理DPSCs 14 d,q RT-PCR检测DSPP、DMP1的表达情况。结果原代培养的DPSCs表达间充质干细胞表面标记物CD44、CD29、CD146,体外诱导培养具有成骨分化潜能。DPSCs成牙本质向分化过程中,Jmjd3、DSPP、DMP1表达水平均上调(P<0.05),且可能具有时间依赖性。10μmol/L GSK-J4处理DPSCs可明显抑制DSPP、DMP1的表达(P<0.05)。结论Jmjd3在DPSCs成牙本质向分化过程中发挥正调节作用,且与其去甲基化酶活性相关。     

血管生成素4对牙髓干细胞成牙本质向分化的作用

目的 探讨血管生成素4(angiopoietin 4,ANGPT4)对牙髓干细胞成牙本质向分化的影响。方法 本实验研究已通过单位伦理委员会审查批准,并获得患者知情同意。将人前磨牙进行固定、脱钙、脱水、包埋和切片,免疫荧光染色观察ANGPT4的表达及定位。体外分离培养人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells,hDPSCs）,于倒置相差显微镜下观察hDPSCs的生长状态及形态;流式细胞术检测细胞表面相关分子标志物的表达;碱性磷酸酶和茜素红S染色鉴定h DPSCs成牙本质向分化的潜能;油红O染色鉴定hDPSCs成脂向分化潜能。提取hDPSCs成牙本质向诱导后不同时间点的RNA,采用RT-qPCR分析hDPSCs体外成牙本质向分化过程中ANGPT4基因及成牙本质细胞相关基因的表达。采用siRNA基因沉默技术沉默hDPSCs中ANGPT4基因的表达,通过RT-qPCR和Western blot检测沉默效率;在hDPSCs中沉默ANGPT4基因表达24 h后进行成牙本质向诱导,在诱导的第7天和14天分别进行碱性磷酸酶和茜素红S染色,检测沉默ANGPT4后hDPSCs的...     

Notch信号通路在牙髓干细胞增殖和分化中的调控作用

Notch信号通路是进化过程中高度保守的信号转导机制,通过细胞与细胞间的相互作用控制细胞的命运。牙髓干细胞是一种具有高度增殖和多向分化潜能的成体干细胞,在组织再生中发挥重要作用。该文就该信号通路的组成及其对牙髓干细胞调控的分子机制作一综述。     

胞壁酰二肽对人牙髓细胞分化影响的研究

目的 探讨天然免疫受体核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2(nucleotide-binding oligomerization domain-2,NOD-2)在深龋牙髓组织中的表达及NOD-2特异性配体胞壁酰二肽(muramyl dipeptide,MDP)对人牙髓细胞分化的影响.方法 实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测深龋及健康人牙髓组织中NOD-2表达差异;1 mg/L MDP刺激体外培养的人牙髓细胞0、2、6、12、24 h,实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹法及免疫荧光检测NOD-2基因及蛋白表达;不同质量浓度MDP刺激人牙髓细胞24 h,蛋白质免疫印迹法检测24 h后牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)的表达;0.1 mg/L MDP 作用于人牙髓细胞0、2、6、12、24 h,检测不同时间点牙本质涎磷蛋白(sialophosphoprotein,DSPP)、骨钙蛋白mRNA及骨桥蛋白的表达.结果深龋牙髓组织中NOD-2 mRNA相对表达量为(0.2610±0.0824),较健康牙髓组织(0.0024±0.0002)显著增高(P<0.05).实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法结果显示NOD-2表达随时间上调,免疫荧光检测证实NOD-2蛋白表达于胞质.MDP质量浓度为0.1 mg/L时DSP蛋白表达量最大(0.3782±0.0564),并随MDP质量浓度增加而下降;DSPP、骨钙蛋白mRNA表达呈时间依赖性,12 h达最大值,24 h后有所下降;骨桥蛋白表达量随时间上调.结论深龋牙髓组织中NOD-2表达升高,MDP与人牙髓细胞的分化相关.

Abstract：

Objective To investigate the nucleotide-binding oligomerization domain-2(NOD-2)gene expression in deep caries and the effects of NOD-2 agonist muramyl dipeptide(MDP)on the differentiation of human dental pulp cells(hDPC). Methods NOD-2 gene level in deep caries and healthy pulp tissue was determined by real-time quantitative polymerase chain reaction(realtime-PCR). Realtime-PCR,Western blotting and immunofluorescence were performed to evaluate NOD-2 gene and protein expression. Dentin sialoprotein(DSP)protein level was assessed when hDPC were challenged by different concentrations of MDP for 24 hours, and sialophosphoprotein(DSPP), osteocalcin(OCN)mRNA and osteopontin(OPN)protein level were detected at different time points after incubation with 0.1 mg/L MDP. Results NOD-2 mRNA level was higher in pulp tissue of deep caries(0.2610±0.0824) than that in healthy controls(0.0024±0.0002),P<0.05.The expression of NOD-2 gene and protein increased in a time denpendent manner upon stimulation with MDP. Immunofluorescence confirmed that NOD-2 protein was located in cytoplasm. Moreover, 0.1 mg/L MDP augmented DSP protein level. DSPP and OCN mRNA were elevated with time and reached the peak at 12 h and down-regulated. OPN protein level also increased with time. Conclusions Dental pulp NOD-2 expression are up-regulated in pulp tissue of deep caries. MDP may be related to the differentiation of hDPC.     

Effects of Notch ligand Delta1 on the proliferation and differentiation of human dental pulp stem cells in vitro

Objective

Notch signalling controls cell fate decisions in adult and embryonic tissues. The Notch ligand Delta1 is known to influence proliferation and differentiation of many kinds of tissue specific stem cells. In the present study, we investigated the role of Delta1 in the regulation of dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro.

Methods

DPSCs were isolated from impacted third molars. Expression of human Notch1, 2 and Delta1 in DPSCs were detected by immunochemistry. Delta1 overexpressed DPSCs were constructed by a retroviral method. Delta1 transduced DPSCs proliferation changes were examined by means of colony-forming assay, BrdU incorporation assay and cell cycle analysis. Delta1 transduced DPSCs were cultured in differentiation-inductive medium. The nodule formation and DSPP expression were evaluated.

Results

It was shown that the Notch receptors and Delta1 ligand were expressed throughout the proliferation and differentiation process of cultured dental pulp stem cells. Furthermore, it was found in our study that Delta1 could significantly enhance the proliferation of DPSCs and permit DPSCs differentiating into odontoblast-like cells in differentiation-inductive environments.

Conclusions

Our findings verified that Notch-Delta1 signalling was expressed in human DPSCs in vitro and appeared to play pivotal role in DPSCs proliferation enhancement and differentiation regulation, thereby consistent with the hypothesis that the Notch pathway controls stem cell fate during pulp regeneration.     

小分子鹰嘴豆芽素A对人牙髓干细胞成骨分化的影响

目的:探讨不同浓度鹰嘴豆芽素A (biochanin A,BCA)对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)成骨分化的影响及相关分子机制.方法:通过组织块法分离培养原代人牙髓干细胞,流式细胞术鉴定其细胞表型.通过CCK-8法检测不同浓度BCA对hDPSCs增殖活性的影响,通...     

成体人牙髓干细胞的分离与鉴定

目的从成体人牙髓组织中分离培养牙髓干细胞，初步探讨其分化潜能。方法选取年轻患者因正畸或阻生拔除的健康第三磨牙，取出牙髓，采用酶消化及过滤法得到单细胞悬液，有限稀释法原代培养。扩大培养细胞克隆，检测STRO-1的表达。体外诱导分化后对各克隆从碱性磷酸酶(ALP)活性、矿化结节形成、牙本质涎蛋白(DSP)表达、Oil Red—O染色、PPARr2基因表达等方面进行检测。结果克隆来源细胞STRO-1表达阳性。在矿化液诱导下，克隆细胞呈现明显高的ALP活性；能够形成矿化结节；可以分泌表达DSP，已向成牙本质细胞方向发生了分化。成脂肪诱导后，Oil Red—O染色阳性，可检测到PPARr2基因表达。结论从成体人牙髓组织中可以分离培养出干细胞，在体外能有效增殖并保持低分化状态。     

人牙髓细胞向成牙本质细胞分化的蛋白质组学研究

目的 采用蛋白质组学方法分析人牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中细胞蛋白表达谱的改变,揭示特征蛋白在分化过程中所起的作用.方法对人牙髓细胞进行矿化诱导,提取诱导前后细胞总蛋白,双向电泳分离蛋白质,DeCyder V6.0软件确定差异蛋白点,质谱鉴定差异蛋白质.结果双向电泳确认46个差异蛋白质斑点,质谱鉴定20个蛋白斑点,差异蛋白质涉及细胞周期调节、能量代谢、信号传导等细胞生物学过程.结论蛋白质组学技术可高通量筛选与人牙髓细胞向成牙本质细胞分化相关的功能蛋白.