慢病毒介导的绿色荧光蛋白转基因小鼠的制备及鉴定

目的以携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒为载体制备转基因小鼠,建立慢病毒介导的转基因动物制备技术平台。方法将慢病毒表达载体FUGW与ViraPowerTMLentiviral Packaging Mix按1∶2比例混合,用LipofectamineTM2000转染293FT细胞,包装出的病毒经浓缩后以293T细胞测定病毒滴度。采用受精卵卵周隙显微注射的方式制备转基因小鼠。出生小鼠用PCR法检测GFP基因整合情况,并在荧光体视显微镜下鉴定外源基因的表达情况。结果病毒包装过程中,转染后24h即可见GFP表达,72h时293FT细胞的转染效率达95%以上,镜下可见大量绿色荧光。包装出的慢病毒滴度为106U/ml,经浓缩后可达108U/ml。PCR检测显示,F0代小鼠GFP PCR阳性率为70.27%(26/37)。荧光体视显微镜下观察荧光小鼠所占比例,F0代为65.2%(15/23),F1代为55.0%(11/20),荧光强度在两代个体中相当。F0代、F1代中GFP均呈广泛表达。结论制备出携带GFP可传代的转基因小鼠,建立了慢病毒载体介导的转基因小鼠制备技术平台。     

稳定表达人VEGF165的NIH/3T3细胞株的筛选与鉴定

 目的 培养NIH/3T3细胞,并进行慢病毒载体介导的VEGF165基因转染,为建立转基因小鼠血管瘤模型奠定基础.方法 采取贴壁培养法分离培养NIH/3T3细胞,细胞随机分为3组,分别为Lenti-VEGF165-EGFP 重组慢病毒载体转染组、Lenti-EGFP慢病毒转染组和未转染组,转染后72 h荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪分选后用ELISA方法检测VEGF165外分泌.结果 ELISA 检测转染后小鼠NIH/3T3细胞,Lenti-VEGF165-EGFP 重组慢病毒载体感染组、Lenti-EGFP慢病毒转染组和未转染组培养上清中VEGF165浓度分别为(205±15)、0、0 ng/L(P<0.05) 结论 NIH/3T3细胞获得慢病毒载体介导的VEGF165表达基因修饰且稳定传代,为下一步血管瘤动物模型研究奠定了基础.     

大鼠B细胞淋巴瘤-2基因的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的 克隆大鼠B细胞淋巴瘤-2(bcl-2)基因全长cDNA,构建及鉴定大鼠bcl-2基因慢病毒表达载体.方法 采用RT-PCR法从大鼠脾脏组织中扩增全长bcl-2 cDNA,将扩增产物克隆至pMD18-T载体中,测序正确后,将基因连接到慢病毒载体pGC-FU(含EGFP 基因)中,构建慢病毒载体表达质粒pGC-FU-bcl-2,将pGC-FU-bcl-2质粒和包装质粒(pHelper1.0、pHclp-er2.0)共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞后,细胞即可分泌携带bcl-2基凶的重组慢病毒.将重组慢病毒感染293T细胞,通过Western blot-ring鉴定目的 蛋白bcl-2的表达.结果 经DNA序列分析测定证实大鼠bcl-2基因序列与GenBank中一致;pGC-FU-bcl-2中携有正确的bcl-2基因,并能转染人胚肾上皮细胞;pGC-FU-bcl-2及包装质粒共转染包装细胞293T细胞能产生重组病毒pGC-FU-bcl-2;目的 基因bcl-2能被重组慢病毒高效地转导人人胚肾上皮细胞中,并达到稳定表达,荧光显微镜下能直接观察到荧光蛋白,Westernblotting能榆测到bcl-2蛋白在靶细胞中的表达.结论 成功克隆了大鼠bcl-2基因并构建了重组慢病毒载体,包装出高浓度慢病毒,转染人胚肾上皮细胞后能够稳定表达bcl-2基因,为进一步研究该基因的功能及细胞凋亡相关疾病的治疗奠定了基础.     

上调microRNA-150表达对肝癌SMMC7721细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨上调microRNA- 150 (miR- 150)表达对肝癌SMMC7721细胞增殖和凋亡的影响及其可能机制.方法 SMMC7721细胞分成miR-150感染组(加入pGIPZ-miR-150慢病毒表达载体)、阴性对照组(加入只含GFP的慢病毒载体)和空白对照组(不转染).采用荧光定量PCR检测miR-150的表达情况,Western blotting检测靶基因c-Myb蛋白的表达,CCK-8法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 荧光定量PCR结果显示,转染miR-150pGIPZ后,SMMC7721细胞miR-150表达量(2.48±0.15)较阴性对照组(0.81±0.09)增加了2倍(p＜0.01).CCK-8法检测结果显示,与阴性对照组和空白对照组比较,miR-150组的细胞增殖率显著降低(P＜0.05).Western blotting检测结果表明,miR-150组细胞c-Myb蛋白表达(0.31±0.07)与空白对照组(0.80±0.09)及阴性对照组(0.81±0.08)相比明显减少(P＜0.0l).流式细胞仪检测结果显示,miR-150组细胞凋亡率(19.36％±1.78％)与阴性对照组(5.12％±0.54％)及空白对照组(4.68％±0.35％)相比明显增加(P＜0.01).结论 上调miR-150表达可通过降低靶基因c-Myb的表达,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,miR-150可能成为肝癌靶向治疗新的靶基因.     

慢病毒颗粒包装、浓缩及对脐带血CD34^＋细胞感染

目的：建立慢病毒包装、浓缩及感染脐带血CD34＋细胞的条件方法。方法：采用第3代慢病毒系统包装病毒上清,结合超滤和超速离心两种方法对病毒进行浓缩。联合应用体外扩增培养,促进静止期细胞进入细胞周期、感染过程中促进细胞黏附和固定及重复感染等方法促进病毒感染。结果：CD34＋细胞体外培养48h,细胞表面CD34标志物表达水平没有明显改变,通过两步法浓缩后,病毒滴度可达5.06×10^7/ml,对脐带血CD34＋细胞的感染效率可达37.7%。结论：通过上述方法可以获得滴度为107/ml以上的慢病毒上清,实现对脐带血CD34＋细胞的有效感染。     

慢病毒介导的敲低UBC9表达抑制ERβ类泛素化修饰水平

目的建立稳定敲低UBC9蛋白表达的293T细胞株,检测其对雌激素受体β(ERβ)类泛素化修饰水平的调节作用。方法构建4条针对人UBC9基因的慢病毒短发夹RNA(shRNA)的干扰载体,将其与慢病毒包装辅助质粒共转染293T细胞后,收集病毒上清,感染293T细胞,经嘌呤霉素(puromycin)筛选后获得稳定表达慢病毒介导UBC9 shRNA的混合细胞集落,分别用实时(real-time)PCR和Western印迹方法检测UBC9的表达情况,瞬时转染方法检测UBC9表达水平对ERβ类泛素化修饰水平的影响。结果建立了稳定敲低UBC9的293T细胞株,UBC9降低能够抑制ERβ类泛素化修饰水平。结论 UBC9在ERβ类泛素化修饰反应中发挥重要作用。     

长链非编码RNA-GAS5慢病毒表达载体构建及其转染效率鉴定

目的构建长链非编码RNA-GAS5(lncRNA-GAS5)过表达及干扰慢病毒载体,并在人滋养细胞中进行转染效率鉴定。方法获取lncRNA-GAS5基因序列,合成重组lncRNA-GAS5全基因序列,同时设计并合成3条lncRNA-GAS5 RNAi序列,构建过表达及干扰慢病毒载体,转染至293T细胞包装病毒并测定其滴度,转染人滋养细胞株HTR-8/SVneo后,使用荧光显微镜观察荧光表达情况,采用实时定量聚合酶链式反应法检测lncRNA-GAS5表达,并筛选出最佳干扰效率的表达载体。结果过表达载体感染细胞后,其表达量提高了2.12倍;干扰载体感染细胞后,其表达量降低了67.3%。结论本实验成功构建了lncRNA-GAS5慢病毒过表达和干扰载体,可为后续进一步研究提供基础。     

慢病毒介导的Ⅰ型胶原shRNA在大鼠系膜细胞中的表达

目的探讨慢病毒介导的Ⅰ型胶原(ColⅠ)短发夹RNA(shRNA)在大鼠系膜细胞的表达情况。方法利用三质粒合成法将表达质粒合成慢病毒表达载体,分别用感染增强剂(对照组)、空慢病毒载体(pSC-GFP组)和慢病毒表达载体(pSC-GFP/ColⅠ组)感染大鼠系膜细胞。采用流式细胞仪检测各组大鼠系膜细胞的转染效率,并采用RT-PCR和Western blotting方法检测各组ColⅠmRNA及ColⅠ蛋白表达情况。结果pSC-GFP和pSC-GFP/ColⅠ均能高效感染大鼠系膜细胞,其中pSC-GFP感染效率为72.42%,pSC-GFP/ColⅠ感染效率高达75.42%。RT-PCR检测提示pSC-GFP/ColⅠ组细胞ColⅠmRNA表达量较对照组、pSC-GFP组显著降低(P<0.05),其抑制效率为32.64%±0.12%,而后两组ColⅠmRNA表达差异无统计学意义。Western blotting检测显示,与对照组、pSC-GFP组比较,pSC-GFP/ColⅠ组蛋白表达明显降低(P<0.05),而对照组与pSC-GFP组之间ColⅠ蛋白表达差异无统计学意义。结论慢病毒载体能稳定、高效地将ColⅠs...     

慢病毒载体介导HIF-1α RNAi对人胰腺癌细胞Patu8988相关基因表达的影响

目的 探讨慢病毒表达载体介导HIF-1α RNA干扰(RNAi)对人胰腺癌细胞Patu8988HIF-1α和Glut-1表达的影响.方法 构建针对HIF-1α基因的RNAi慢病毒表达载体LV-RNAi-HIF-1α.乏氧条件下体外培养4h,转染LV-RNAi-HIF-1α的Patu8988细胞为实验组;转染空病毒载体和未转染任何病毒载体Patu8988细胞分别为阴性对照组和空白对照组.采用荧光定量RT-PCR和Western印迹法检测Patu8988细胞HIF-1α表达情况,采用RT-PCR法检测转染LV-RNAi-HIF-1α后Patu8988细胞Glut-1的表达情况.采用SPSS 17.0软件行单因素方差分析和两样本t检验分析各组之间的差异.结果 构建的慢病毒表达载体LV-RNAi-HIF-1α,在常氧和乏氧状态下致HIF-1α mRNA表达分别下降65.1％(0.209/0.321)和80.6％ (0.791/0.982)(t=10.52和15.24,均P＜0.05),阴性对照组分别为0.6％(0.002/0.321)和7.2％(0.071/0.982)(t=5.26和7.38,均P＜0.05);乏氧状态下实验组、阴性对照组和空白对照组HIF-1α蛋白的表达分别为0.159±0.010、0.745±0.012和0.711±0.023,差异有统计学意义(F=35.52,t=6.72和10.56,均P＜0.05),实验组较其他2组表达下降;乏氧条件下实验组Glut-1 mRNA表达(0.040±0.003)较阴性对照组(0.054±0.003)和空白对照组(0.062±0.004)均有明显下降(F=35.28,t=5.94和8.55,均P＜0.01).结论 通过构建LV-RNAi-HIF-1α慢病毒表达载体沉默HIF-1α基因表达,可降低Patu8988胰腺癌细胞Glut-1 mRNA表达.     

利用PCR方法获得shRNA抑制内外源性基因的表达

目的探讨PCR法获得的shRNA对外源性基因和内源性基因表达的抑制效果。方法选择绿色荧光蛋白(GFP)和大鼠肾脏系膜细胞高丰度表达的纤维连接蛋白(FN)分别作为外源性和内源性基因的靶基因,设计特异性引物,利用PCR扩增获得shGFPRNA和shFNRNA。前者与pEGFP质粒共转染至293T细胞,48h后进行激光共聚焦检测细胞表达GFP阳性率;后者转染至大鼠系膜细胞(RMC)中,48h后提取总RNA逆转录成cDNA,经realtimeRTPCR检测FN的mRNA表达水平,提取细胞总蛋白进行Westernblot检测FN蛋白表达水平。结果PCR获得的shGFPRNA产物能有效抑制外源性基因GFP的表达,抑制效率可达70%±3.2%;shRNA转染组内源性基因FN的表达水平明显下降,与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。结论PCR方法可快速简单、廉价地获得shRNA,对内源性或外源性基因进行特异性抑制。     

大鼠骨髓间充质干细胞的钆-荧光双标记及MRI体外示踪的研究

目的 应用多聚胺载体,对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)进行钆喷替酸葡甲胺(Gd-DTPA)及荧光双标记,探讨MSCs MR磁性标记及体外示踪的可行性.方法 以聚乙烯亚胺-罗丹明复合物(JetPEI-FluoR)为载体,制备Gd-DTPA双标记示踪剂,培养分离SD大鼠骨髓MSCs,以此示踪剂体外标记间MSCs.对标记后细胞行生物学性状检测及电镜、荧光镜观察.应用1.5 T MR仪,对标记的干细胞进行sE T1 WI及T2 WI及混合(mixed)回波序列的T1测量,标记细胞正常传代后进行MR检查,观察标记的持久性.标记细胞、未标记细胞的T1 WI信号强度、T1之间的比较使用t检验,台盼蓝拒染率采用两因素重复资料方差分析,不同浓度示踪下细胞吸光度比较采用单因素方差分析.结果双标记示踪剂标记5×105个MSCs,标记成功了4.25×105个,荧光镜下标记率为85%,电镜下钆(Gd)颗粒主要位于胞质内高尔基体周围.双标记示踪剂孵育3、6、12、24 h内标记细胞的台盼蓝拒染率分别为(96.55±2.90)%、(94.17±2.56)%、(97.16±3.12)%、(94.23±2.67)%,相应的未标记细胞的拒染率分别为(95.86±2.67)%、(92.04±2.21)%、(93.38±3.64)%、(92.12±2.53)%,24 h内标记细胞与未标记细胞拒染率差异无统学意义(F=4.523,P＞0.05).细胞增殖实验中,在2.5、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0 μl不同浓度示踪剂时,标记细胞的吸光度分别为(0.1884±0.0151)、(0.1878±0.0190)、(0.1741±0.0160)、(0.1135±0.0215)、(0.1079±0.0145)、(0.0811±0.0079),未标记细胞为(0.1940±0.0116),Gd-DTPA 30.0 μl以下标记细胞与未标记细胞吸光度差异无统计学意义(q'=0.2225～0.9458,P＞0.05).标记后细胞凋亡指数为5.08%,对照组未标记细胞为3.86%.未标记细胞T1 WI平均信号强度及T1分别为240.3±24.7、(2457±56)ms,而标记细胞为336.2±20.7、(1102±64)ms,两者间差异有统计学意义(t值分别为12.656、17.889,P值均＜0.01),T1 WI可监测到最低密度为5×103个标记细胞.标记细胞正常传代后,MRI体外可持续显示至第4代标记细胞.结论应用多聚胺载体对大鼠间充质干细胞进行Gd-DTPA及荧光双标记,安全有效,MRI能示踪体外双标记的干细胞.     

人野生型和突变型CITED2真核表达质粒的构建与表达

目的 构建人转录辅助因子CITED2突变型(c.573-578del6)及野生型真核表达质粒并检测两种重组质粒CITED2蛋白的表达情况.方法 分别以健康儿童和CITED2基因突变的先天性心脏病患儿血细胞DNA为模板,PCR定向克隆扩增野生型和突变型CITED2编码链,分别T/A克隆至pMD19-T simple质粒上,筛选出野生型和突变型CITED2的T载体重组质粒.应用DNA重组技术将T载体重组质粒上的CITED2基因片段亚克隆入真核表达载体pEGFP-C1,构建pEGFP-C1-wtCITED2和pEGFP-C1-mtCITED2真核表达质粒,并分别转染至HEK293细胞,24h后在荧光显微镜下观察质粒转染情况,48h后应用流式细胞仪检测转染效率,Western blotting检测CITED2蛋白的表达.结果 成功构建了人野生型pEGFP-C1-wtCITED2和突变型pEGFP-C1-mtCITED2真核表达质粒.转染至HEK293细胞后24h,在荧光显微镜下可观察到各转染组EGFP的表达,转染后48h流式细胞仪检测转染效率为50％ ～ 60％,Western blotting检测可见CITED2蛋白与EGFP的融合表达.结论 成功构建了人转录辅助因子CITED2突变型及野生型真核表达质粒,并检测到CITED2蛋白的表达.     

miR-155对前列腺癌放射治疗的增敏作用

 目的 探讨miR-155在前列腺癌放射治疗(简称放疗)中的增敏作用。方法 转染anti-miR-155,抑制前列腺癌DU145和PC-3细胞中miR-155水平,联合应用放射治1疗,通过观察DU145和PC-3细胞的存活率、黏附率,以及前列腺癌细胞的凋亡率,并观察Caspase-3和Caspase-9表达水平和活性的变化。结果 与对照组相比,DU145和PC-3细胞经放射或anti-miR-155单独处理后,细胞存活率(放射组分别为25.6%±2.0%和21.6±1.0%;anti-miR-155处理组分别为20.5%±1.0%和15.5%±1.0%)和黏附率(放射组分别为0.8%±0.1%和0.7%±0.1%;anti-miR-155处理组分别为0.7%±0.1%和0.6%±0.1%)均显著降低(P<0.01);前列腺癌细胞凋亡率增高(放射组分别为3.3%±0.3%和4.2%±0.3%;anti-miR-155处理组分别为4.1%±0.1%和3.9%±0.2%);Caspase-3和Caspase-9表达水平和活性均提高(P<0.01);联合组的细胞存活率(分别为10.1%±0.5%和6.1%±0.5%)和黏附率(分别为0.4%±0.1%和0.4%±0.1%)低于单独处理组(P<0.01,n=6),细胞凋亡率(分别为6.9%±0.4%和6.8%±0.3%),Caspase-3和Caspase-9表达水平和活性等均高于单独处理组(P<0.01)。结论 抑制miR-155可增加人前列腺癌的放疗敏感性,提高放射线对人前列腺癌细胞的治疗效果,其机制可能与Caspase-3和Caspase-9参与细胞凋亡的途径相关。     

shRNA重组慢病毒载体在小鼠造血系统中的长期高效表达

目的构建在小鼠造血干细胞中高效表达的shRNA重组慢病毒载体并研究其在小鼠造血系统中的长期稳定表达。方法将p-CMV和重组并鉴定正确的p-SFFV慢病毒载体与辅助病毒载体PAX2和PMD2G混合后,采用磷酸钙方法共转染293T包装细胞,获得具有感染能力的成熟慢病毒感染经流式细胞仪分选并体外培养的小鼠骨髓造血干细胞,分析其表达效率后,选取感染效率较高的p-SFFV慢病毒载体感染小鼠骨髓造血干细胞,并通过骨髓移植技术输入放射线照射后的小鼠体内。在移植后4周和9周分别获取小鼠外周血样本,移植后16周获取小鼠骨髓样本,分析供体细胞在小鼠体内的表达。结果成功重组了p-SFFV慢病毒载体并在小鼠骨髓造血干细胞中高效表达（感染效率72.4%）;骨髓移植实验表明,携带外源性shRNA的慢病毒载体可在小鼠造血系统内长期稳定表达（感染效率92%）。结论shRNA重组慢病毒载体在小鼠造血系统中可长期稳定表达。     

microRNA-7真核表达载体的构建及其对细胞增殖能力的影响

目的构建miR-7真核表达载体,以研究miR-7过表达后对细胞增殖能力的影响。方法以人全血标本基因组为模板,PCR扩增miR-7序列,然后将该序列克隆入pHRS-1cla-CMV-EGFP载体中,构建pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体。将构建好的载体瞬时转染入293FT细胞中,利用RT-PCR技术对转染前后293FT细胞中miR-7的表达水平进行检测。将pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体瞬时转染入乳腺癌细胞系MCF-7中,利用CCK-8法以及BrdU增殖实验检测过表达miR-7后细胞增殖能力的变化。结果构建的pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体质粒酶切和测序鉴定结果正确,实时定量RT-PCR结果表明,与转染pHRS-1cla-CMV-EGFP对照载体细胞相比,转染pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体72 h后的293FT细胞成功地过表达miR-7达76.8倍。CCK-8法以及BrdU增殖实验检测过表达miR-7后乳腺癌细胞系MCF-7的增殖能力显著性下降（P〈0.05）。结论成功构建了pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体,瞬时转染后细胞可以有效地高表达miR-7,同时证明过表达miR-7可以使细胞的增殖能力受到明显抑制。     

Oct4基因沉默对结直肠癌细胞凋亡的诱导作用及机制研究

目的 探讨Oct4基因沉默对人结直肠癌SW480细胞凋亡的影响及其可能机制.方法 将对数生长期SW480细胞分为3组.①空白对照(Con)组:不转染病毒;②阴性对照(NC)组:转染阴性对照病毒;③RNA干扰(RNAi)组:转染Oct4-shRNA慢病毒载体.采用实时荧光定量PCR检测Oct4 mRNA表达;采用Western blotting检测Oct4、p-Akt 蛋白表达;采用流式细胞仪测定Oct4+及CD44+细胞比例变化及肿瘤细胞凋亡情况.结果 与NC组比较,RNAi组Oct4 的mRNA(分别为1.00和0.19±0.02)和蛋白(分别为0.032±0.004和0.007±0.001)表达量均有明显下降(P＜0.0l),Oct4+细胞比例(分别为91.53％和10.70％)和CD44+细胞比例(分别为59.69％和23.58％)明显减少,p-Akt蛋白表达明显受抑(0.11+0.03和0.03±0.01),细胞凋亡明显增加(分别为l2.1％±1.8％和43.2％±4.5％,P＜0.01).结论 沉默Oct4基因可明显减少SW480细胞中Oct4+及CD44+细胞比例,增加细胞凋亡,其作用可能与PI3K/Akt通路有关.     

反义表皮生长因子受体对人肺癌细胞放射敏感性的影响

目的 观察反义表皮生长因子受体(EGFR)对人肺腺癌细胞系放射敏感性的影响。方法在脂质体介导下用质粒pcDNA3-反义EGFR(pcDNA3-antiEGFR)转染spc-a-1细胞,并以未转染(对照组)和空质粒pcDNA3转染(pcDNA3组)细胞作对照。用G418筛选稳定表达的细胞克隆,以RT-PCR和Western blot检测转染后EGFR的mRNA及蛋白表达抑制情况,流式细胞仪检测转染后细胞周期及单次照射8 Gy后各组细胞凋亡比例。3组细胞分别给予6 MV X射线照射0、2、4、6和8 Gy,计算克隆形成率,拟合生长曲线。结果pcDNA3-antiEGFR组与对照组、pcDNA3组比较,EGFR mRNA和蛋白表达量明显减少,G₂/M期比例分别为(29.53±1.91)％、(13.7±1.30)%和(12.40±1.34)％,单次照射8Gy后,3个组细胞的凋亡率分别为(39.24±1.57)%、(13.79±0.63)%和(15.02±0.85)%。与对照组相比较,pcDNA3-antiEGFR组细胞的D₀、D_q、SF₂值分别由2.11、2.49和0.84降至1.19、0.15和0.32,提示抑制EGFR表达,可降低spc-a-1细胞对射线所致亚致死性损伤的修复能力。结论反义EGFR可以降低人肺癌spc-a-1细胞中EGFR的表达,改变细胞周期分布,促进凋亡,降低亚致死性损伤的修复能力,增加肺癌细胞系spc-a-1的放射敏感性。     

骨形态发生蛋白4重组腺病毒的构建及其对NIH3T3细胞成骨分化作用的研究

目的:构建骨形态发生蛋白4(BMP4)重组腺病毒,探讨其对NIH3T3成纤维细胞向成骨方向分化的影响。方法:将BMP4基因克隆连接到载体pAdTrack-CMV中,在细菌BJ5183中与pAdEasy腺病毒基因组进行同源重组,得到BMP4重组腺病毒基因组,通过转染HEK293细胞包装出重组腺病毒。利用BMP4重组腺病毒转染NIH3T3细胞,采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和western-blot检测BMP4在细胞中的mRNA和蛋白表达。Gomori改良钙钴法检测BMP4重组腺病毒转染后的NIH3T3细胞碱性磷酸酶表达;von kossa染色检测BMP4重组腺病毒转染后NIH3T3细胞的成骨分化情况。结果:获得了BMP4转移质粒pAdTrack-BMP4和BMP4重组腺病毒基因组,并包装出重组腺病毒。BMP4在转染后的NIH3T3细胞中得到表达,表达的BMP4蛋白具有生物学活性。转染后的NIH3T3细胞碱性磷酸酶表达增加。BMP4促进了NIH3T3细胞向成骨方向分化,形成钙结节。结论:本实验成功构建了BMP4重组腺病毒;BMP4重组腺病毒可促进NIH3T3细胞向成骨方向分化。