慢病毒介导的绿色荧光蛋白转基因小鼠的制备及鉴定

目的以携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒为载体制备转基因小鼠,建立慢病毒介导的转基因动物制备技术平台。方法将慢病毒表达载体FUGW与ViraPowerTMLentiviral Packaging Mix按1∶2比例混合,用LipofectamineTM2000转染293FT细胞,包装出的病毒经浓缩后以293T细胞测定病毒滴度。采用受精卵卵周隙显微注射的方式制备转基因小鼠。出生小鼠用PCR法检测GFP基因整合情况,并在荧光体视显微镜下鉴定外源基因的表达情况。结果病毒包装过程中,转染后24h即可见GFP表达,72h时293FT细胞的转染效率达95%以上,镜下可见大量绿色荧光。包装出的慢病毒滴度为106U/ml,经浓缩后可达108U/ml。PCR检测显示,F0代小鼠GFP PCR阳性率为70.27%(26/37)。荧光体视显微镜下观察荧光小鼠所占比例,F0代为65.2%(15/23),F1代为55.0%(11/20),荧光强度在两代个体中相当。F0代、F1代中GFP均呈广泛表达。结论制备出携带GFP可传代的转基因小鼠,建立了慢病毒载体介导的转基因小鼠制备技术平台。     

MyD88干涉慢病毒颗粒的包装和鉴定

目的制备MyD88分子的慢病毒干涉颗粒,建立稳定下调MyD88的HEK293细胞系。方法将携带特异性干涉序列的DNA片段克隆入干涉质粒pSicoR中,并制备携带不同干涉序列的慢病毒颗粒。将慢病毒颗粒感染HEK293细胞,建立稳定细胞系,经RT-PCR和报告基因分析方法确定不同干涉序列对MyD88表达的下调及信号通路激活的阻断作用。结果成功制备携带干涉序列的慢病毒颗粒,并获得稳定感染慢病毒的HEK293细胞系,经鉴定发现感染912位序列的细胞MyD88mRNA表达水平下调为对照组的28%,对CBLB502的激活作用下降为对照组的24%。结论成功制备MyD88的慢病毒干涉颗粒,可用于建立MyD88稳定下调的细胞系。     

绿色荧光蛋白在肿瘤研究中的应用

绿色荧光蛋白 (greenfluorescentprotein ,GFP)来源于海洋生物水母 ,是近年来细胞生物学中应用最为广泛的标记性蛋白质之一。GFP的cDNA全长约2 .6kb ,编码 2 38个氨基酸残基 ,分子量为 2 7× 10 3 u。无需加外源性分子 ,在 395nm、4 70nm波长光线激发下 ,GFP肽链内部第 6 5～ 6 7位的氨基酸残基通过自身环化和氧化形成一个绿色荧光基团 ,性质稳定 ,使用普通荧光显微镜即可观察到[1,2 ] 。改进后的GFP突变型 ,所发荧光强度高 ,吸收峰单一 ,极大地提高其应用价值。目前 ,GFP在肿瘤的发病机制、生物学行为、药效评价和基因治疗等方面得…     

绿色荧光蛋白在胚胎干细胞研究中的应用

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein．GFP)作为一种方便、有效的活性标记物，无需外源反应底物，无需进行细胞或组织的固定和渗透处理．使检测更加方便。是细胞生物学和分子生物学研究的一个重要工具，已得到了广泛的应用。胚胎干细胞(Embryonic StemCell．ES cell)是从早期胚胎中分离得到的多能细胞，在胚胎发育、细胞移植、组织器官构建、药物研制、基因治疗等研究方面发挥着巨大的作用。本文就GFP的特性及其在ES细胞研究中的应用作一简述。     

绿色荧光蛋白在转基因动物研究中的应用

来源于水母(Aequorea Victoria)的绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP),现已成为细胞生物学和分子生物学中应用最广泛的分子标记之一.其内源性荧光基团在受到紫外或蓝光激发时可发现清晰可见的绿光.由于检测方便,对生物体基本没有毒性,在很多领域已有取代LacZ,荧光素酶等传统标记方法的趋势,在制作转基因动物过程中更是如此.本文综述了GFP在标记目的基因、筛选阳性胚胎等方面的应用.     

长链非编码RNA-GAS5慢病毒表达载体构建及其转染效率鉴定

目的构建长链非编码RNA-GAS5(lncRNA-GAS5)过表达及干扰慢病毒载体,并在人滋养细胞中进行转染效率鉴定。方法获取lncRNA-GAS5基因序列,合成重组lncRNA-GAS5全基因序列,同时设计并合成3条lncRNA-GAS5 RNAi序列,构建过表达及干扰慢病毒载体,转染至293T细胞包装病毒并测定其滴度,转染人滋养细胞株HTR-8/SVneo后,使用荧光显微镜观察荧光表达情况,采用实时定量聚合酶链式反应法检测lncRNA-GAS5表达,并筛选出最佳干扰效率的表达载体。结果过表达载体感染细胞后,其表达量提高了2.12倍;干扰载体感染细胞后,其表达量降低了67.3%。结论本实验成功构建了lncRNA-GAS5慢病毒过表达和干扰载体,可为后续进一步研究提供基础。     

α2巨球蛋白cDNA片段-增强型绿色荧光蛋白质粒的构建

目的：构建以巨球蛋白cDNA片段（FP6）-增强型绿色荧光蛋白（pEBFP）质粒（pEBFP／FP6双表达质粒）。方法：利用PCR技术克隆出FP6，将其克隆至pMD18-T载体中，再通过分子克隆技术将FP6插入pEBFP表达基因中，构建pEBFP／FP6质粒，双酶切和测序鉴定。结果：PCR方法能克隆FP6，并成功构建pEBFP／FP6质粒，双酶切和测序结果表明构建的pEBFP／FP6质粒完全符合设计要求。结论：利用PCR、酶切、连接反应等基因克隆手段，可以构建pEBFP／FP6双表达质粒。     

携带绿色荧光蛋白的可诱导性真核表达载体的构建及其表达

目的　构建携带绿色荧光蛋白 (GFP)的可诱导性真核表达载体。方法　将GFPcDNA片段克隆到可诱导性真核表达载体pMD neo上 ,构建成携带绿色荧光蛋白的可诱导性真核表达载体pMD GFP ;再采用脂质体转染法 ,将GFP基因转入HCC 92 0 4细胞中 ,用荧光显微镜观察其表达情况。结果　成功构建了携带绿色荧光蛋白的可诱导性真核表达载体pMD GFP ;荧光显微镜观察显示 ,在转染GFP基因的HCC 92 0 4 /GFP细胞中 ,荧光均匀地分布于整个细胞。结论　携带绿色荧光蛋白的可诱导性真核表达载体的构建 ,为进一步观察活体内肿瘤的生长和转移提供了基础。     

含绿色荧光蛋白基因的子宫内膜异位症体外模型的建立

目的 由腺病毒介导绿色荧光蛋白基因转染子宫内膜细胞,构建子宫内膜异位症体外模型.方法 取5例正常子宫内膜组织,分离子宫内膜基质细胞和腺上皮细胞,进行形态学观察和免疫荧光鉴定.用携带有绿色荧光蛋白基因的腺病毒转染细胞,比较转染后12、18、36、42h细胞的绿色荧光蛋白表达阳性率和凋亡率的差异.结果 分离培养获得高纯度的子宫内膜腺上皮细胞(90%)和基质细胞(接近100%).两种细胞均表达绿色荧光;与腺上皮细胞比较,基质细胞转染率明显增高(F=8.362,P=0.020),凋亡率明显降低(F=46.119,P<0.001);转染对细胞的凋亡率无明显影响(F=4.208,P=0.057).结论 利用腺病毒介导的绿色荧光蛋白基因载体转染子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞,可获得相对稳定的体外荧光子宫内膜异位症模型.     

Tmub1过表达及沉默慢病毒载体转染对大鼠BRL-3A肝细胞增殖的影响

目的 探讨Tmub1蛋白在肝细胞增殖中的作用.方法 分别使用Tmub1沉默慢病毒载体、Tmub1过表达慢病毒载体及对应的空载体转染大鼠BRL-3A肝细胞,得到稳定转染的细胞.转染后采用Western blotting检测Tmub1蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期.结果 转染LV-Tmub1慢病毒的肝细胞Tmub1蛋白表达明显增加,转染LV-Tmub1-RNAi慢病毒的肝细胞Tmub1蛋白表达明显降低,与正常肝细胞比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).转染LV-Tmub1慢病毒的肝细胞增殖最快,转染LV-Tmub 1-RNAi慢病毒的肝细胞增殖最慢,两组之间差异有统计学意义(P＜0.01).过表达Tmub1慢病毒载体转染的肝细胞的G2+S期明显长于沉默Tmub1慢病毒载体转染的肝细胞,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 Tmub1蛋白可促进BRL-3A肝细胞的增殖.     

3种基于PCR的荧光标记方法的比较研究

目的：荧光标记物是目前杂交型基因芯片所检测的主要目标底物，本实验比较了3种基于PCR的荧光标记方法在基因芯片检测中的应用效果。方法：荧光分子标记的引物或荧光分子修饰的核苷酸可以在PCR反应中通过Taq，Pfu等DNA聚合酶掺入到PCR产物中，在此过程中，荧光分子又可以通过不同的方法掺入到PCR产物中。方法1：直接将荧光分子化学合成在引物的5’端；方法2：在PCR反应体系中加入荧光分子修饰的核苷酸单体，由DNA聚合酶将其掺入PCR产物中；方法3：对PCR产物通过非模板依赖性的酶促加尾反应在其3’端随机加入荧光修饰的核苷酸。本实验优化了3种荧光标记方法，并以检测CYP3A4基因外显子5中4个核苷酸位点的探针微阵列为例，比较了检测效果。结果：在各自优化的实验条件下，从扩增、标记效率以及芯片杂交的信号强度、背景、分辨率等方面进行比较，3种方法得到的荧光标记样品无明显区别，但后两种方法操作过程复杂，使用成本高，对反应条件苛刻。结论：3种基于PCR扩增的荧光标记方法均可以提供优质的荧光标记探针或样品(底物)，在实际应用中，各自有不同的特点及适用范围。     

少突胶质细胞祖细胞高效分离培养及EGFP基因转染

目的：建立高效分离少突胶质细胞祖细胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）的方法，并转染增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因。方法：采用2次接种培养和差速振荡分离，结合使用神经营养因子（bFGF、PDGF-AA），体外分离纯化和扩增培养OPCs，用抗A285、GFAP、CNPase免疫荧光抗体鉴定细胞类型。采用脂质体介导EGFP基因转染OPCs，筛选获得稳定表达EGFP的OPCs细胞。结果：分离培养的OPCs细胞呈A2B5阳性，纯度达到99％，具有增殖和双向分化的潜能（GFAP阳性的2型星形胶质细胞和CNPase阳性的少突胶质细胞），传代培养1个月仍具有增殖能力。EGFP基因转染后OPCS细胞能发出绿色荧光，并继续保持增殖分化特性。结论：二次接种培养和差速振荡分离法可获得高纯度OPCs细胞；EGFP基因转染可作为示踪OPCs迁移的有效方法。     

三种不同内固定方式治疗锁骨远端骨折的疗效比较

目的比较三种内固定方式治疗锁骨远端的临床疗效,以期指导临床合理选择和应用。方法回顾性分析2011年1月—2013年5月东营市人民医院采用锁骨远端解剖型钢板内固定(A组)、锁骨钩钢板内固定(B组)和双钢板垂直内固定(C组)三种方法治疗63例锁骨远端粉碎性骨折患者,其中A组18例,CraigⅡ类Ⅱ型15例,Ⅱ类V型3例;B组24例,CraigⅡ类Ⅱ型20例,Ⅱ类V型4例;C组21例,CraigⅡ类Ⅱ型18例,Ⅱ类V型3例。采用Constant-Murley评分系统评价肩关节功能,并对三组患者的骨折愈合时间、术后并发症发生情况等进行对比分析。结果 63例患者术后获13~19个月(平均17.2个月)随访。三组患者肩关节Constant-Murley评分优良率分别为94.4%、75.0%、90.5%,A组、C组明显优于B组,差异均有统计学意义(P0.001)。B组术后并发症发生率为16.7%,明显高于A组(0)和C组(4.8%),差异有统计学意义(P0.05)。结论三种内固定技术治疗锁骨远端骨折均可获得较好的临床效果,锁骨远端解剖型钢板及双钢板垂直内固定术后肩关节疼痛及肩关节活动受限发生率更低。     

三种蛋白染色方法在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中的应用

目的：比较ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）中蛋白染色的３种方法。方法：将ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中的蛋白分别用银染、同染和考马斯亮蓝染色,并对铜染或考马斯亮蓝染色后的蛋白进行相应的复染。结果：快速银染法灵敏度最高,但操作步骤繁琐,染色时间约５０ｍｉｎ;考马斯亮蓝染色灵敏度最低,需染色和脱色,时间约为１ｈ;铜染灵敏度介于银染和考马斯亮蓝染色之间,但染色时间仅５ｍｉｎ,不需脱色,且可直接用考马斯亮蓝或快速银染法复染。结论：用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ进行蛋白检测时,铜染可作为蛋白快速分析的首选方法。     

红色荧光-VEGF_(165)融合蛋白载体在细胞内的定位和表达

目的　构建在哺乳动物细胞中表达人VEGF1 65(hVEGF1 65)红色荧光蛋白 (RFP)的融合表达载体。方法　根据已知的人VEGF1 65序列 ,用PCR方法 ,从质粒pUC1 8/VEGF1 65中扩增出去除终止密码子的VEGF1 65片段 ,定向克隆至pDsRed1 N1质粒中。重组质粒经限制性内切酶和DNA序列测定鉴定。以DOTAP为介导 ,将pDsVEGF1 65Red1 N1转染 2 93 T细胞 ,4 8小时后用RT PCR、激光共聚焦显微镜检测VEGF1 65在细胞内表达和分布情况。结果　重组的融合蛋白表达载体经酶切、PCR和DNA序列测定证明构建正确 ,并在2 93 T细胞中表达。报告基因 -红色荧光蛋白在细胞质、细胞核中都有一定的分布。结论　成功构建了pDsVEGF1 65Red1 N1红色荧光蛋白融合表达载体 ,该载体能在哺乳动物细胞中表达 ,为研究VEGF的细胞内定位提供了一个重要而方便的工具