莪术醇对肝星状细胞铁死亡和上皮间质转换作用的研究

目的 探究莪术醇对肝星状细胞铁死亡和上皮间质转换(EMT)的影响,及其抗肝纤维化的分子机制。方法 用体外正常培养的肝星状细胞构建肝星状细胞活化模型,并分为空白组和低、中、高剂量实验组。空白组给予DMEM完全培养液正常培养;低、中、高剂量实验组分别给予含12.5、25.0、50.0 mg·L^-1莪术醇的DMEM完全培养液干预48 h。用CCK-8法观察莪术醇对肝星状细胞增殖的影响,用蛋白质印迹法检测谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)和溶质载体家族7成员11(SLC7A11)的表达水平,用免疫荧光法检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)和N-cadherin的表达情况。结果 中、高剂量实验组和空白组的细胞增殖率分别为(68.97±5.61)%、(61.91±4.40)%和(118.07±10.01)%,GPX4相对表达水平分别为0.37±0.04、0.28±0.03和0.58±0.05,SLC7A11相对表达水平分别为0.38±0.04、0.28±0.03和0.60±0.05,E-cadherin分别为6.76±1.09、9.57±1.73和2.05±0.72,N-c...     

莪术醇对肝星状细胞内质网应激和凋亡的作用研究

目的 探究莪术醇对肝星状细胞内质网应激和凋亡的作用,阐明其抗肝纤维化作用的机制。方法 将肝星状细胞分为对照组(正常培养)、模型组(1μg·mL^-1脂多糖)和低、中、高剂量实验组(在模型组基础上分别使用12.5、25.0和50.0 mg·L^-1莪术醇处理)组。用噻唑蓝法检测莪术醇对肝星状细胞活力的影响;用流式细胞术检测各组细胞凋亡发生情况和各组活性氧(ROS)的表达;用蛋白质印迹法检测各组B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、内质网应激相关蛋白(CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、蛋白激酶RNA样内质网激酶p-PERK)、半胱氨酸蛋白酶12(caspase12)蛋白表达情况;用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、胶原蛋白Ⅰ型(collagenⅠ)、胶原蛋白Ⅲ型(collagenⅢ)mRNA表达情况。结果 对照组、模型组、高剂量实验组细胞ROS表达水平分别为(21.09±4.51)%、(32.78±2.90)%和(72.81±6.89)%; GRP78蛋白相对表达水...     

莪术醇通过Sirt1-p53信号通路诱导肝星状细胞衰老减轻肝纤维化

目的 探讨莪术醇对肝纤维化的治疗作用及其可能机制。方法 用不同浓度莪术醇5、10、15、20、30、45、60、80和100μmol/L培养人肝星状细胞株HSC-LX2 24 h,采用CCK-8法检测细胞活力。选择三个浓度的莪术醇10、20、30μmol/L用于后续实验。Western blot法及免疫荧光实验检测肝纤维化相关蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、α1(Ⅰ)胶原及纤连蛋白的表达;衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测衰老细胞;实时定量PCR检测衰老标志物p16、p21、高迁移率族蛋白A1(HMGA1)及端粒酶逆转录酶(TERT) mRNA表达;Western blot法检测沉默交配型信息调节因子2同源蛋白1(Sirt1)和p53蛋白表达。结果 与莪术醇0μmol/L比较,莪术醇20、30μmol/L处理后,α-SMA、α1(Ⅰ)胶原及纤连蛋白的表达下调,SA-β-Gal染色阳性细胞增加,p16、p21、HMGA1 mRNA表达和p53蛋白表达增加,TERT mRNA表达和Sirt1蛋白表达降低(P<0.05或P<0.01)。加入Sirt1激动剂S...     

奥曲肽对肝星状细胞整合素信号通路的影响

目的通过研究奥曲肽对肝星状细胞（HSCs）整合素信号通路的影响,探讨奥曲肽抑制HSCs增殖的机制。方法体外培养HSCs,MTT法测定HSCs增殖,Westernblot测定细胞外信号调节激酶（ERK1）蛋白表达。结果干预24h,Ⅲ～Ⅴ组吸光度（A）值均显著低于Ⅱ组,抑制率分别是18.75%、37.50%和40.63%,差异有统计学意义（P〈0.05）。Ⅰ组有ERK1蛋白表达,OPN刺激24h后,ERK1蛋白含量较Ⅰ组高95.62%;Ⅲ～Ⅴ组ERK1蛋白含量则分别低了16.74%、34.30%和65.72%。结论奥曲肽能够通过下调整合素信号通路中的下游信号分子——ERK1,抑制骨桥蛋白刺激的HSCs增殖。     

肝星状细胞激活与增殖相关信号转导通路在肝纤维化中的作用及机制

肝星状细胞激活和增殖在肝纤维化的发生过程中占有重要的地位。控制肝星状细胞的激活和增殖并逆肝纤维化的进程是抗肝纤维化研究的重点之一。本综述以肝星状细胞激活与增殖相关信号转导通路为中心,探讨其在肝纤维化发病作用方面的作用机制。通过干预细胞外信号传导通路,为研究肝纤维化的发病机制和药物治疗提供新的途径。     

鬼针草总黄酮对肝纤维化大鼠肝星状细胞TGF-β1信号传导通路的影响

目的研究外源性转移生长因子-β1(transforming growth factor betal,TGF-β1)对肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)的激活作用,观察鬼针草总黄酮(total flavonoids of Bidens Bipinnata L,TFB)对HSC中smad2/7和Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达的影响,以探讨TFB抗肝纤维化的作用及分子机制。方法采用Collagenase Ⅳ胶原酶原位肝灌注法分离HSC,MTT法观察TFB对TGF-β1刺激下HSC增殖的作用,ELISA法检测HSC自分泌TGF-β1和产生Ⅰ型胶原的影响;RT-PCR法观察分析TFB对TGF-β1刺激下HSC中smad2/7和Ⅰ型胶原基因表达的影响;Westernblot法观察TFB对TGF-β1刺激下HSC中smad2蛋白表达的影响。结果TGF-β1明显促进HSC增殖、自分泌TGF-β1和产生胶原,促进HSCsmad2、Ⅰ型胶原mRNA及smad2蛋白的表达,明显抑制smad7mRNA表达(P<0.05),TFB作用后,TGF-β1刺激的HSC中smads2mRNA、蛋白和Ⅰ型胶原mRNA表达受到抑制,smad7mRNA表达明显上调。结论TFB抗肝纤维化作用可能与其阻断HSCTGF-β1通路进而阻断HSC的活化、增殖有关。     

褪黑素对PDGF诱导的肝星状细胞中JAK2/STAT3信号通路的影响

目的探讨褪黑素对血小板衍生生长因子(PDGF)诱导的肝星状细胞-T6(HSC-T6)JAK2/STAT3信号通路的影响。方法将HSC-T6细胞分为6组:对照组、模型组、实验组(褪黑素1 nmol·L^-1、1μmol·L^-1、0.1 mmol·L^-1)、抑制剂组(AG490为JAK2/STAT3通路的抑制剂),MTT实验检测褪黑素对PDGF激活的HSC-T6细胞增殖的影响;免疫组化和Western blot检测褪黑素HSC-T6细胞中p-JAK2、p-STAT3蛋白的表达。结果与对照组比较,PDGF能明显激活HSC-T6细胞增殖,明显上调HSC-T6细胞中p-JAK2、p-STAT3的表达;与模型组比较,褪黑素和抑制剂均可抑制PDGF激活的HSC-T6细胞增殖,显著下调p-JAK2、p-STAT3的表达。结论褪黑素可抑制PDGF诱导的HSC-T6的活化与增殖,其机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路有关。     

肝复康经JNK信号通路在肝星状细胞凋亡中的调节机制

目的探讨中药肝复康经JNK(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信号通路在肝星状细胞凋亡中的调节机制。方法将SD大鼠随机分为5组:正常对照组(C),模型组(M),肝复康高(HT)、中(MT)、低(LT)剂量治疗组,每组给予相应的处理;HSC-T6细胞株随机分为3组:正常对照组、乙醛组及肝复康治疗组。HE染色法观察肝组织形态结构变化;RT-PCR法测定MKK4、MKK7、JNK1、JNK2、COX-2、Survivin、Caspase-3、α-SMA、collagenⅠ和collagenⅢ的基因表达水平;免疫组织化学法和免疫蛋白印记法观察COX-2在肝组织和肝星状细胞中的表达。结果正常组中COX-2几乎不表达。与正常组相比,模型组中COX-2表达显著增加(P<0.05)。与模型组相比,肝复康治疗组各组中COX-2表达均明显降低,其中,中剂量组最明显(P<0.05)。与正常组相比,模型组中MKK4、MKK7、JNK1、JNK2、COX-2、Survivin的基因表达水平均显著上调(P<0.05)。与模型组相比,肝复康治疗组各基因表达水平均明显减弱,中剂量组最明显(P<0.05),其中Caspase-3基因表达呈相反趋势。COX-2和Survivin的表达呈正相关,和Caspase-3的表达呈负相关。检测α-SMA、collagenⅠ与collagenⅢ基因表达,与模型组相比,中剂量治疗组表达水平明显下调(P<0.05)。结论肝复康可通过抑制JNK信号通路的传导诱导肝星状细胞凋亡,发挥抗纤维化作用。     

大鼠肝星状细胞的分离和培养

目的:本文参考Friedman等的不连续密度离心法并作改良,建立了一种经济、简便、可靠的分离大鼠肝星状细胞(HSC)的方法。方法:用链霉蛋白酶和胶原酶灌流大鼠肝脏,Nycodenz密度梯度离心分离HSC,并进行体外培养,结果:分离培养的HSC经台盼蓝拒染实验活细胞大于98％,细胞得率为3.95×10个/肝脏。结论:该方法简便、实用、稳定、可靠,而且本方法的建立为进一步研究HSC与肝纤维化的关系,尤其是细胞水平及分子生物学水平的研究奠定了基础。     

肝星状细胞凋亡信号途径及其药物治疗的研究进展

各种致病因素所致慢性肝损伤均可引起肝纤维化,肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)的激活是肝纤维化发生发展的中心环节,促进其凋亡被认为是肝纤维化逆转的始动因素。HSC的凋亡机制十分复杂,调控活化HSC凋亡的信号转导途径研究甚少。目前已知的HSC凋亡信号途径主要包括线粒体途径、死亡受体途径和非死亡受体途径。基于这些信号转导途径,研究出选择性诱导HSC凋亡的药物将成为抗肝纤维化治疗的重要手段。该文将对HSC凋亡信号转导通路的最新进展进行综述,并对目前已知的具有促HSC凋亡作用的药物进行总结分类。     

Effect of Rho-ROCK signaling pathway on pulmonary fibrosis

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is characterized by progressive lung scarring, reduced median survival, poor prognosis and limited therapeutic options, leading to great need for new pharmacologic therapies. In recent years, researchers have found that Rho-ROCK signaling pathway may be a new drug target in the prevention of IPF. This article reviewed the role of Rho-ROCK pathway in pulmonary fibrosis and the application of ROCK inhibitors in experimental models of IPF. Multiple lines of evidence therefore indicated that ROCK inhibition has great potential to be a powerful therapeutic tool in the prevention and treatment of IPF in clinic.     

丹皮酚体外对肝星状细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨丹皮酚对大鼠肝星状细胞(HSC)增殖和凋亡的影响。方法 HSC加入丹皮酚1.66～49.8 mg·L-1作用48 h后,MTT比色法和锥虫蓝染色法检测HSC的存活率。HSC与丹皮酚33.2 mg·L-1分别作用6,12,24,36和48 h,锥虫蓝染色法检测HSC的存活率。HSC与丹皮酚1.66～69.7 mg·L-1作用48 h用细胞乳酸脱氢酶(LDH)活性测定试剂盒检测细胞上清中LDH活性。丹皮酚1.66～49.8 mg·L-1与HSC作用24 h分别用光学显微镜、Hoechst 33258染色和流式细胞术检测HSC细胞形态、细胞凋亡和凋亡率;丹皮酚1.66～49.8 mg·L-1作用48 h用流式细胞术检测细胞周期。结果 MTT实验结果表明,丹皮酚16.6～49.8 mg·L-1对HSC增殖具有明显抑制作用,且具有浓度效应关系(r=0.955,P<0.05),作用48 h时IC50值为105.4 mg·L-1。锥虫蓝染色实验结果表明,丹皮酚对HSC存活率的抑制作用不仅具有浓度效应关系(r=-0.936,P<0.05),浓度为33.2 mg·L-1时还具有时间效应关系(r=-0.965,P<0.05)。丹皮酚16.6～69.7 mg·L-1作用48 h无明显细胞毒性。流式细胞仪检测结果显示,丹皮酚8.3～49.8 mg·L-1作用24 h能显著促进HSC细胞凋亡(P<0.05),且具有浓度效应关系(r=0.920,P<0.05)。丹皮酚33.2和49.8 mg·L-1作用48 h可调节细胞周期,G0/G1期细胞增加(P<0.01),S期细胞减少(P<0.01),具有浓度依赖性(r=0.980,P<0.05)。结论丹皮酚具有促进HSC凋亡和抑制HSC增殖的作用,可能是其抗肝纤维化作用机制之一。     

渥漫青霉素对大鼠肝星状细胞增殖的影响

目的探讨渥漫青霉素对大鼠肝星状细胞(HSC)增殖的影响.方法用链霉蛋白酶和胶原酶灌流大鼠肝脏,Nycodenz密度梯度离心分离大鼠HSC,进行体外培养;并以MTT比色法观察渥漫青霉素对HSC增殖的影响.结果低浓度渥漫青霉素的抑制作用不明显(P>0.05),当药物浓度上升为2.5mg/L时,抑制作用增强,呈明显药物浓度依赖关系.结论渥漫青霉素抗肝纤维化的作用是抑制了HSC的增殖,它对于防治肝纤维化可能有一定的临床意义和应用前景.     

肝星状细胞信号转导机制及可能的抗肝纤维化药物作用新靶点

肝纤维化是肝脏对一系列慢性刺激的损伤修复反应,以细胞外基质的过度沉积为主要特征。近年来,肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)的激活以及由此产生的一系列复杂生物学效应在肝纤维化发生、发展过程中所处的重要地位已得到普遍共识。各种损伤刺激通过不同或相同的HSC信号转导途径介导了HSC的激活,并使其转化为肌成纤维细胞,合成大量细胞外基质成分。作用于这些信号或其转导过程的药物正成为防治肝纤维化的策略之一。     

姜黄素衍生物对原代大鼠肝星状细胞作用的体外研究

目的：观察姜黄素衍生物（Curc-OEG）抑制原代肝星状细胞（HSC）增殖、活化以及诱导其凋亡的作用,探讨其可能的作用机制。方法：采用IV型胶原酶、DNA酶消化SD雄性大鼠肝脏,percoll梯度离心得到纯化的肝星状细胞。细胞分离后1d分别加入0、6.25、12.5μg/mL的姜黄素衍生物,作用7d后用RT-PCR及Western blot检测细胞α-SMA、TGF-β1、Smad2的mRNA水平和蛋白表达量。活化的肝星状细胞在第14天分别加入0、6.25、12.5、25、50、75μg/mL的姜黄素衍生物,作用24h后RT-PCR检测凋亡基因Bax、Bcl-2的mRNA水平和纤维化相关基因TGF-β1、collagen I、NF-κB及TIMP-1的mRNA水平。结果：药物作用7d后,6.25μg/mL和12.5μg/mL浓度药物处理组与对照组相比,细胞数目分别减少了56%和86%。在12.5μg/mL浓度药物作用下,原代肝星状细胞α-SMA、TGF-β1及Smad2的mRNA表达水平分别下调83%、85%及75%,蛋白表达水平分别下调94%、92%及73%（P〈0.05）。25μg/mL浓度药物作用24h后,细胞凋亡明显。在50μg/mL浓度药物作用下,活化的肝星状细胞Bax的mRNA表达水平上调约2.3倍,Bcl-2的mRNA表达水平下调约5.6倍;TGF-β1、collagen I、NF-κB及TIMP-1的mRNA表达水平分别下调90%、83%、74%、65%（P〈0.05）。结论：姜黄素衍生物可以明显抑制原代肝星状细胞的增殖和活化,促进活化的肝星状细胞凋亡及减少细胞外基质的沉积。     

JAK/STAT途径调节瘦素诱导的肝星状细胞Ⅰ型胶原基因的表达

目的研究瘦素对肝星状细胞(HSC)α1(Ⅰ)型胶原mRNA表达和蛋白合成的影响,探讨Janus激酶/信号传导及活化转录因子(JAK/STAT)信号传导通路在瘦素诱导的HSC胶原基因表达过程中的作用。方法采用RT-PCR法、ELISA法和Western blot法分别检测不同浓度的瘦素对人肝星状细胞株LX-2α1(Ⅰ)型胶原mRNA表达、蛋白合成以及JAK1、STAT3磷酸化状态的影响;采用Western blot法和RT-PCR法分别观察JAK1抑制剂AG490对瘦素诱导的JAK1磷酸化和α1(Ⅰ)型胶原mRNA表达的影响;采用Western blot法分别观察AG490、LX-2转染STAT3反义寡核苷酸(STAT3-ASON)对瘦素诱导的STAT3磷酸化状态的影响;应用RT-PCR法检测LX-2转染STAT3-ASON对瘦素诱导的α1(Ⅰ)型胶原mRNA表达的影响。结果瘦素增加LX-2α1(Ⅰ)型胶原mRNA表达和蛋白合成,呈剂量效应关系,当瘦素浓度为80μg·L-1时达到最大值;瘦素促进JAK1、STAT3磷酸化,呈时间效应关系;AG490完全阻断瘦素诱导的JAK1、STAT3磷酸化和α1(Ⅰ)型胶原mRNA的表达;LX-2转染STAT3-ASON阻断瘦素诱导的STAT3磷酸化和α1(Ⅰ)型胶原mRNA的表达。结论瘦素通过增加HSCα1(Ⅰ)型胶原mRNA表达和蛋白合成而在肝纤维化发生发展过程中发挥重要的作用,JAK/STAT信号传导通路参与并调节该过程,AG490和LX-2转染STAT3-ASON可有效阻滞此传导途径。在人HSC中,活化的JAK1和STAT3信号可作为肝纤维化治疗新的分子靶点。