单细胞测序技术在骨关节疾病方面的应用

在关节疾病的发病机制的研究上,目前最常针对的对象还是骨、软骨及滑膜组织,以及从这些组织的整个病理改变的方向去探索可能的发病过程及发病机制,所以存在很多局限性和不准确性,比如忽略了疾病组织内部的单个细胞的异质性在疾病当中所发挥的作用。单细胞测序技术(single-cell sequencing)是在单个细胞水平上对基因组、转录组及表观基因组进行测序的技术,能够从组织样本中获得不同细胞间的异质性信息和对珍贵微量样本进行测序,从而更深层次地反映生命规律与本质,本文就单细胞测序技术的基本方法及在关节疾病方面的应用进行概述。     

下一代测序技术在前列腺癌的研究进展简

作为西方发达国家男性第二位死亡率的肿瘤,前列腺癌近年来在我国发病率呈迅速上升趋势,早期诊断、治疗对前列腺癌预后具有重要意义。下一代测序技术具有高通量、低成本、反应耗时短的优势,可以进行基因突变检测、单核苷酸多态性测定、基因测序、RNA测序、表观遗传学检测以及染色体结构分析,为在基因水平研究前列腺癌发病机制、预测前列腺癌风险性及预后提供了广阔的科研平台。本文对下一代测序撼术在前列腺癌中的研究进展及临床应用前景进行综述。     

二代测序技术应用于脑脊液检测在结核性脑膜炎中的早期诊断价值

目的评价二代测序技术应用于脑脊液检测在结核性脑膜炎（TBM）患者中的早期诊断价值。 方法前瞻性纳入2018年2月2日至2018年8月2日于山东省胸科医院就诊的临床怀疑TBM的患者共50例,并跟踪随访其诊疗结局。送检脑脊液标本均进行二代测序,测序所得原始序列与病原微生物数据库进行对比得到最终结果。二代测序结果以检测到结核分枝杆菌复合群唯一比对序列为阳性,未检测到唯一比对序列为阴性。以符合脑脊液结核分枝杆菌培养阳性、涂片阳性、Xpert MTB/RIF检测阳性及结核分枝杆菌核酸检测阳性等4项中至少1项即为确诊TBM患者;临床可疑TBM且抗结核治疗有效为临床诊断患者;有其他病原学依据或临床排除TBM者为非TBM患者。分析二代测序在TBM早期诊断中的敏感性和特异度。 结果确诊为TBM患者22例中Xpert MTB/RIF检测阳性13例,培养阳性6例,结核分枝杆菌核酸PCR检测阳性5例,临床诊断为TBM患者12例,非TBM患者16例。在确诊及临床诊断患者中,二代测序技术检测到结核分枝杆菌复合群系列20例,敏感性为58.8%（20/34）,特异度为100%（16/16）。在确诊患者中,二代测序的敏感性为63.6%（14/22）;在同步进行结核分枝杆菌培养、Xpert MTB/RIF检测与二代测序的50例标本中,以临床诊断为标准,3种方法的特异度均为100%（16/16）;传统方法、Xpert MTB/RIF检测及二代测序的敏感性分别为29.4%（10/34）、38.2（13/24）和58.8（20/34）,前两种检测方法与二代测序敏感性差异均有统计学意义（McNemar检验：χ² = 8.333、P = 0.013,χ² = 8.333、P = 0.065）。传统方法与二代测序联合检测的敏感性高达82.4%（28/34）。 结论二代测序技术能够较快速地检测脑脊液中的结核分枝杆菌复合群,且其敏感性和特异度均较高,可作为TBM的早期诊断指标。二代测序联合传统检测方法可提高检出率。     

全基因组测序技术的发展和应用

全基因组测序技术的出现对医学所有领域来说都是一次革命性的进步。对于每个生物个体来说,基因组包涵了其整个的遗传信息。全基因组测序技术能够全面、精确地分析基因组的碱基序列,从而破解其所包含的信息,揭示基因组的复杂性、多样性。通过对不同个体或群体的比对,可以发现其中的遗传特性或突变,进而加深对各种疾病发生、发展的了解,进而制定相应的应对方法。全基因组测序技术将会使人类对自然界生物及自身的了解更加深入并给人类的健康带来实际利益。     

评价全血DNA二代测序共有序列在人类免疫缺陷病毒优势准种研究中的准确性

目的 评价二代测序共有序列对人类免疫缺陷病毒(HIV)优势准种分析的代表性和准确性.方法 共收集29个HIV感染病例的32份全血样本,其中3个病例在随访期间发生耐药,分别采集治疗前和耐药后的两份样本.提取样本DNA,分别用二代测序和一代测序方法测定HIV pol区扩增产物序列.利用软件Sequencher(4.10.1...     

下一代测序联合质谱检测诊断普城沙雷菌感染

目的普城沙雷菌是一种革兰阴性肠杆菌,广泛存在于自然界,主要生长在植物、动物和昆虫中,其感染人体非常少见,并表现出多种抗生素耐药的特点。目前临床工作中尚无普城沙雷菌特异性的检测方法而对该病难以诊断。本文通过下一代测序联合质谱检测诊断普城沙雷感染一例,探讨该方法应用于临床诊断的价值。方法通过下一代测序联合质谱检测,诊断一例包括血培养在内的多项检查均为阴性,临床表现为发热、肌痛、肌肉肿胀的IgA肾病患者为普城沙雷菌感染。结果质谱检测结果发现,患者体温升高时大量与炎症、免疫及包括普城沙雷菌在内的多种细菌相关的蛋白质升高,多种与DNA复制、生长因子及细胞凋亡相关的信号通路被激活。下一代测序结果表明,患者体温升高时多种细菌(包括沙雷菌属、耶尔森菌属、埃希菌属、果胶杆菌属、沙门菌属、伯克菌属、克雷白杆菌属、泛生菌属、微杆菌属等)相关的基因片段升高,其中普城沙雷菌相关的基因片段明显高于其他沙雷菌,测得序列条数为72 726条(占63.5%)。在多种抗生素治疗无效的基础上,予以复方磺胺甲嗯唑治疗后,患者的体温逐渐降至正常,肌痛、肌肉肿胀以及一般情况逐渐好转,C反应蛋白、白细胞介素6、降钙素原、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等多项指标逐步恢复正常。结论下一代测序联合质谱检测可以应用于临床中复杂疾病的诊断,尤其对感染性疾病的诊断具有一定提示意义。     

测序技术在结直肠癌研究中的应用

测序技术的出现是分子生物学领域的伟大变革,该技术已经被广泛应用于各类疾病的研究并取得了重大突破。结直肠癌是一种涉及到多种基因表达改变的疾病,高通量测序技术在结直肠癌基因组、转录组、循环肿瘤DNA及表观遗传学研究中发挥了重大作用,为人类从更深层次认识结直肠癌的发生发展机制,更好的指导临床诊疗做出了巨大贡献。本文就测序技术在结直肠癌研究中的应用做简要综述。     

单细胞测序技术及其在结直肠癌中的研究进展

结肠直肠癌(CRC)是全球第三常见及第二位肿瘤致死癌症疾病, 由于基因突变的发生及肿瘤转移等事件造成CRC的预后不良。单细胞测序技术可以在单细胞水平上进行基因组、转录组、表观遗传学的高通量测序分析, 在肿瘤免疫微环境分析、肿瘤异质性检测、肿瘤转移机制探究及循环肿瘤细胞(CTCs)监测等有着特殊的技术优势。本文简要介绍了单细胞测序的技术流程及数据处理并回顾目前单细胞测序在CRC应用进展, 从而为了解CRC发生及肿瘤进展过程中的肿瘤内异质性、深入理解CTCs的应用与寻找新的药物作用靶点提供参考。     

基于脑组织转录组整合分析探索大鼠氯胺酮的麻醉机制

目的:通过观察氯胺酮麻醉对大鼠大脑皮质转录组表达的影响,探讨其可能的麻醉机制。方法:选择5~6周龄雄性SD大鼠6只,采用完全随机法分为氯胺酮组（KET组）和对照组（Ctrl组）,每组3只。分别腹腔注射麻醉剂量氯胺酮（50 mg/kg）或等体积生理盐水后30 min,提取大脑皮质进行mRNA测序（mRNA sequenc...     

瘢痕疙瘩TNF受体Ⅱ基因1573位点突变的研究

目的 探讨瘢痕疙瘩患者TNF受体Ⅱ(TNF receptor Ⅱ,TNFR-Ⅱ)基因1573位点突变的情况. 方法收集22例自愿捐献的经临床及病理确诊的瘢痕疙瘩标本,其中男6例,女16例;年龄18～53岁.设患者自身外周静脉血标本为正常对照.提取基因组DNA,PCR扩增TNFR-Ⅱ基因1573位点片段,DNA测序,将测序结果 与GeneBank比较.结果 实验提取DNA浓度均＞0.5 μg/μL,纯度(A260/A280)均＞1.5,经琼脂糖凝胶电泳检测,与所设计DNA片段大小相近,符合实验要求.13例瘢痕疙瘩标本检测示不同程度突变,突变率为59.1%;9例1663编码子发生点突变,,占总数的40.9%.与外周静脉血比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).突变类型主要为点突变、插入、缺失,为多位点、多类型,呈多态性. 结论 TNFR-Ⅱ基因1573位点突变与瘢痕疙瘩的发生有关.     

乙型肝炎病毒全基因组PCR扩增产物的直接测序

目的建立乙型肝炎病毒全基因组PCR扩增产物直接测序的方法并对序列进行分析。方法PCR法扩增乙型肝炎病毒全长基因,PCR扩增产物纯化后直接进行DNA序列测定;将已测定序列的PCR扩增产物用上述方法进行再测序以评价该方法的保真性;应用进化树分析及对齐比较等方法分析HBV基因型和YMDD变异情况。结果20例标本中有18例扩增阳性并得到全长基因组序列;保真性分析表明,本法引起的人为核苷酸突变率约为1‰;序列分析表明,18例标本中有10例为基因型B、8例为基因型C;2例出现耐拉米夫定的YMDD变异,均为基因型C。结论乙型肝炎病毒全基因组PCR扩增产物直接测序,方法简便,可满足临床和科研的需要。     

阴道微生物多样性与女性不孕症相关性研究进展

随着高通量测序技术的发展和成熟,其在临床诊疗中的作用和应用越来越广泛,其中对阴道微生物群的研究也逐渐展开。女性阴道微生物状况受自身内分泌状态、年龄、种族、生活习惯等多种因素影响,与女性生殖健康密切相关,并直接或间接影响女性妊娠率和妊娠结局。本文对不孕症妇女阴道微生物多样性进行了总结,并对阴道微生物的组成和功能进行探讨,有利于从微生物组学的角度对不孕症做更精确全面的认识,从而对女性不孕症的临床防治工作提供新的思考和方法。     

PCR-ST Amp法应用于HLA-DRB1测序分型的研究

目的采用单管PCR扩增(ST Amp)方法建立高效的人类白细胞抗原-DRB1(HLA—DRB1)基因测序分型(SBT)技术并探讨其应用价值。方法合成7个5’端特异性扩增引物和1个3’端共用引物，将上述引物混合在一起组成单个PCR反应用于HLA—DRB1的DNA测序分型分析。结果所有样本都能成功分型．分型结果准确可靠，重复性好。结论STAmp法改进了测序分型技术，具有高分辨率、高特异性和高效率的特点．值得推广应用。     

1例隐睾症家系的外显子测序分析

目的:对收治的1个隐睾症家系进行全外显子测序(WES),筛选并分析该家系中与隐睾症发生相关的突变位点,为该疾病的遗传学病因提供证据。方法:收集本中心收治的一对同时患有单侧隐睾且存在家族史的同卵双生双胞胎兄弟及其父母的血液DNA样本,对该家系进行NextSeq500 PE150测序,以GATK、VarScan软件对SNP和InDel进行低频变异检测,并关联多个数据库(dbSNP、1000g、ESP6500、HGMD、OMIM等)对变异结果进行注释。结果:基因组分析显示,双胞胎患儿中,ROR2基因(c.2249G>A.p.G750D)存在杂合子非同义变异,变异来源为父亲。AR基因(c.1625G>A;p.R542Q)存在半合子非同义变异,变异来源于母亲。这两处变异在基因数据库中较为少见,预测与隐睾相关。结论:ROR2基因突变(c.2249G>A.p.G750D)与AR基因突变(c.1625G>A;p.R542Q)可能是该家系发生隐睾症的遗传学病因。     

生物信息学(6):生物信息学与医学研究

生物信息学（bioinformatics）是20世纪80年代末至90年代初伴随基因组测序数据迅猛增加而逐渐形成的一门交叉学科。人类基因组计划的顺利推进产生了海量基因数据，这些数据中蕴藏着丰富的生物学内涵，如果能充分挖掘并加以利用．可能揭示出很多对人类有用的信息。     

CCDC40基因突变导致不动纤毛综合征一例报道及文献复习

本文报道采用外显子测序技术对1例具有不动纤毛综合症(PCD)临床表现的患者进行基因突变检测,发现该患者CCDC40基因中有一个先前未被鉴定的突变位点(c.2609G>A),改变了CCDC40蛋白序列,导致"9+2"纤毛的超微结构缺陷(内动力臂和微管排列存在异常)。     

单细胞测序法研究肿瘤异质性

对于肿瘤领域的研究工作者及临床医生来说,肿瘤异质性是一个长久以来所关注的热点问题。所谓肿瘤异质性,即是指肿瘤细胞具有不同表型和功能。目前解释肿瘤异质性机制的理论包括肿瘤进化理论（clonal evolution,CE）以及肿瘤干细胞（cancer stem cell,CSC）理论。前者强调的是肿瘤细胞具有突变的生物学特性,从而导致肿瘤的发生及发展。而后者则强调肿瘤干细胞的分化,使其发展成为具有不同功能的肿瘤细胞,稳定肿瘤的内环境。从种种迹象表明,两种理论相互共存,促进了肿瘤的发牛发展。近年来,单细胞测序（single cell sequencing,SCS）作为一种最新开展的研究方法已应用到了肿瘤异质性研究领域,并具有良好的临床应用前景。它的开展可极大程度地辅助早期小病灶肿瘤的发现、循环肿瘤细胞（circulating tumour cells,CTCs）的监测以及晚期肿瘤药物耐药的判断,从而提高肿瘤的早期诊断、个体化治疗的效果以及预后等方面。     

HLA配型新策略:融测序与构象于一体的RSCA系统

造血干细胞移植后可发生一系列的并发症 ,如移植物抗宿主病 (ＧＶＨＤ)和感染 ,约有 90 %的患者在移植后发生ＧＶＨＤ。其中对诱发ＧＶＨＤ及其程度影响最大的是供、受者的ＨＬＡ相合程度。目前 ,已成熟的 8～ 9种ＨＬＡ分型方法 ,基本上可分为两种类型。第一类是以鉴别ＨＬＡ基因序列不同为基础的ＨＬＡ分型技术 ,如血清学分型、序列特异性引物 (ＳＳＰ)ＰＣＲ、序列特异性寡核苷酸探针 (ＳＳＯＰ)分型技术以及单核苷酸序列分析 (ＳＢＴ)等。由于ＨＬＡ各等位基因之间存在序列互换现象 ,即同一序列可以出现在不同的等位基因中 ,这使得上述…     

通过转录组测序和生物信息学方法鉴别小胶质细胞炎症激活过程中的关键通路和基因

目的通过转录组测序和生物信息学分析, 探究小胶质细胞炎症激活的关键通路和基因。方法使用质量浓度为1 μg/ml的脂多糖对小胶质细胞进行刺激, 建立小胶质细胞炎症模型。使用ELISA法和RT-qPCR检测小胶质细胞炎症模型IL-6和TNF-α水平。对建立的小胶质细胞炎症模型进行转录组测序, 采用生物信息学方法筛选出差异表达基因。对差异表达基因进行GO分析和KEGG分析。使用String数据库构建差异表达基因的蛋白互作网络, 并使用Cytoscape软件进行蛋白互作网络的可视化。使用MCODE应用程序提取蛋白互作网络的模块, 使用cytohubba应用程序提取枢纽基因。采用RT-qPCR验证枢纽基因的mRNA表达水平。对枢纽基因进行富集分析, 预测其靶向miRNA, 预测可能与其作用的药物。结果经ELISA和RT-qPCR检验, 小胶质细胞炎症模型建立成功。通过转录组测序和生物信息学分析, 筛选出434个差异表达基因。GO分析显示这些差异表达基因主要集中在细胞对细胞因子刺激的反应、炎症反应、对外界刺激反应的调节等条目。KEGG分析显示这些差异表达基因主要集中在趋化因子信号通路、TNF信号通...     

e抗原阴性的慢性乙型肝炎患者病毒基因变异与临床转归

目的研究HBeAg阴性的慢性乙型肝炎病毒的基因变化及其与临床转归的关系。方法应用基因测序的方法检测HBeAg阴性的慢性乙型肝炎、肝硬化患者乙型肝炎病毒1762、1764、pre-18963个位点的基因突变,分析肝炎、肝硬化的发生与各位点变异的关系。结果135例HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者中发生1762位点变异者9例,pre-1896位点变异者36例,1762、1764位点联合变异者27例,1762、1764、pre-1896位点联合变异者63例。45例肝硬化患者中发生pre-1896位点变异者27例,1762、1764位点联合变异者9例,1762、1764、pre-1896位点联合变异者共9例。结论山东地区HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒以BCP1762、1764、pre-1896位点联合变异为主,其中pre-1896位点的变异对于肝硬化的发生有重要意义。