高氧对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞Notch受体的影响

目的 检测Notch 1在肺泡Ⅱ型上皮细胞(ACEⅡ)与肺成纤维细胞共培养的高氧损伤模型中表达的变化,初步探讨Notch信号在高氧肺损伤中的作用,为临床防治新生儿急、慢性肺损伤提供理论的依据.方法 Spragne Dawkey雌鼠12只,体质量200～220 g,雄鼠3只,220～250 g,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供.将共培养的AEC Ⅱ随机分为高氧组和对照组.高氧组按3L/nlin通入950 ml/L O2和250 ml/L CO2,10 min后,立即用封口胶密封培养板,置于37℃、50 ml/L CO2培养箱.于给氧后24、48、72、96 h,收获各组细胞,测氧仪检测培养瓶中的O2体积分数,将低于900mi/L O2的标本弃去.免疫组织化学法鉴定细胞,台盼蓝拒染实验计算细胞纯度,确认共培养造模成功.每24 h更换培养基并给氧.每一时间点同时设对照组,置于37℃、50 ml/L CO2培养箱中培养.NTT法检测AECⅡ增殖活力,绘制生长曲线;免疫组织化学法定位Notch1蛋白;荧光定量PCR检测noteh1 mRNA;流式细胞术双标记法检测AEC Ⅱ、AEC I细胞百分率.结果 免疫组织化学法显示高氧组Notch1活化人核受抑;高氧组各时间点Notch1 mRNA分别下降为对照组的0.43、0.29、0.11、0.03倍(置信限95%),通氧后AECⅡ百分率显著降低[24 h高氧组vs.对照组:(68.92±6.88)%vs.(90.35±4.01)%,P=0.006;48 h高氧组vs.对照组:(38.03±3.27)%、vs.(61.47±4.81)%,P=0.000;72 h高氧组vs.对照组:(20.13±4.45)%vs.(52.05±3.35)%,P=0.000;96 h高氧组vs.对照组:(8.17±1.99)%vs.(52.59±2.93)%,P:0.000].AEC I百分率除96 h外均增高[24 h高氧组vs.对照组:(0.1l±0.03)%vs.(0.01±0.01)%,P=0.006;48 h高氧组vs.对照组:(49.73±3.45)%vs.(16.13±2.13)%,P=0.000;72 h高氧组vs.对照组:(52.43±3.14)%vs.(5.98±0.95)%,P=0.000;96 h高氧组vs.对照组:(19.85±3.26)%vs.(29.03±3.16)%,P=0.0007].结论 高氧可抑制AECⅡNotch1受体的活化,引起AECⅡ增殖减弱,转分化异常.研究如何调控Notch信号通路将为修复肺泡上皮,恢复其正常生理功能打开新思路.     

高氧对早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响及降钙素基因相关肽的保护作用

目的 观察高氧对早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)的影响以及降钙素基因相关肽(CGRP)对AECⅡ的保护作用.方法 将原代分离培养的孕19 d早产鼠AECⅡ接种至6孔培养板,实验随机分为空气组、高氧组、高氧CGRP组、高氧CGRP受体拮抗剂组.空气组和高氧组分别置于体积分数为21%的空气和60%的氧气中暴露24 h;高氧CGRP组在暴露前加入CGRP;高氧CGRP受体拮抗剂组在高氧CGRP组基础上加入CGRP受体拮抗剂(CGRP 8-37).培养24 h后,用分光光度计测定各组丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(TAOC)、超氧化物歧化酶(SOD)水平;用流式细胞仪检测活性氧(ROS)和细胞凋亡率;用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定表面活性蛋白C(SPC)的mRNA表达.结果 与空气组比较,高氧组ROS、MDA水平及细胞凋亡率均显著增高,TAOC、SOD水平及SPC mRNA表达均显著降低(P均<0.01).与高氧组比较,高氧CGRP组细胞MDA、ROS水平及细胞凋亡率均显著下降;而TAOC、SOD水平及SPC mRNA表达均明显增高(P均<0.01).高氧CGRP受体拮抗剂组与高氧组各指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05).结论 暴露于60%氧24 h可导致早产鼠AECⅡ发生氧化损伤,诱导细胞凋亡及SPC mRNA表达下降;而CGRP可部分减轻AECⅡ的氧化损伤,减少凋亡,促进SPC mRNA表达,对高氧损伤的AECⅡ起保护作用.     

脂氧素A4对肺泡Ⅱ型上皮细胞水通道蛋白1,3,5的影响

目的 探讨脂氧素A4(LipoxirA4,LxA4)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)攻击的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(typeⅡpenumonocyte,AT Ⅱ)水通道蛋白(aquaporin,AQP)1,3,5的影响.方法 每次取SPF级健康SD雄性大鼠,体质量200～250 g一只,对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞进行分离、纯化,鉴定,得到纯度为≥90%的肺泡Ⅱ型上皮细胞,将细胞随机分为:①溶剂对照(乙醇,0.7μL/mL)组;②空白组(无血清的培养基不含任何药物);③LXA4(1×10-7moL/mL)组;④LPS(1μg/mL)组;⑤LPS+LXA4(1μg/mL LPS+1×10-7moL/mL LXA4)组.药物刺激4 h后用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞上AQP1,AQP3和AQP5的mRNA的表达,免疫组织化学方法(IHC)检测肺泡Ⅱ型上皮细胞上AQP1,AQP3和AQP5蛋白的表达.试验重复6次.采用方差分析进行统计学处理.结果 RT-PCR和免疫组织化学法结果显示,用1 μg/mL的LPS刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞4 h后ATⅡ上AQP1,AOP3和AQP5的mRNA和蛋白表达较空白组明显减低(P＜0.01),而LPS+LXA4组中ATⅡ上AQP1,AQP3和AQP5的mRNA和蛋白表达较LPS模型组有明显增高(LPS+LXA4,AQP1:0.647±0.132,AQP3:0.900±0.856,AQP5:0.879±0.058;LPS.AQP1:0.297±0.133,AQP3:0.512±0.113,AQP5:0.647±0.110;P＜0.01),且LXA4组中ATⅡ上AQP1,AQP3和AQP5的mRNA和蛋白表达较空白组也有明显增高(LXA4,AQP1:0.539±0.142,AQP3:0.818±0.176,AQP5:0.841±0.066;Blank Control,AQP1:0.518±0.139;AQP3:0.138±0.136,AQP5:0.766±0.066;P＜0.01).结论 大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞上表达有AQP1,AQP3和AQP5,LXA4能促进脂多糖攻击的肺泡Ⅱ型上皮细胞上AQP1,AQP3和AQP5mRNA和蛋白表达上调.     

降钙素基因相关肽对高氧暴露下肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖及蛋白激酶Cα信号途径的调控作用

目的 探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对高氧暴露下肺泡Ⅱ型上皮细胞(AEC Ⅱ)的促增殖作用及其蛋白激酶Cα/核转录因子-κgB(PKCa/NF-κB)信号途径的调控机制.方法 将原代分离培养的孕21 d胎鼠AEC Ⅱ分为空气组、高氧组、高氧CGRP组、高氧CGRP拮抗剂组.空气组和高氧组分别在21%O2或85%O2中暴露24 h;高氧CGRP组在高氧处理前加入CGRP,高氧CGRP拮抗剂组同时加入CGRP和CGRP受体拮抗剂CGRP8-37.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法和流式细胞术测定细胞增殖能力和不同细胞周期细胞比例;蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测胞膜和胞质PKCα的表达;激光共聚焦检测NF-κB p65的细胞核表达.结果 高氧组G0/G1期细胞比例明显高于空气组[(80.652±6.253)%比(45.825±2.899)%],而细胞增殖率[(68.752±5.766)%比(100.000±6.682)%]及S期、G2/M期细胞比例[分别为(14.198±4.785)%比(27.470±2.775)%,(5.148±1.688)%比(26.708±1.863)%]均低于空气组(均P<0.01).CGRP干预可提高高氧暴露AEC Ⅱ的增殖能力[(94.813±6.102)%],使S期和G2/M期细胞增多((30.547±9.861)%,(17.668±9.509)%,均P<0.01].高氧组胞膜与胞质PKCα比值显著低于空气组(0.63±0.10比1.00±0.09),而NF-κB p65的荧光强度高于空气组(22.98±2.20比14.54±2.35);高氧CGRP组胞膜与胞质PKCα比值(1.41±0.23)及核内NF-κB p65荧光强度(35.38±3.37)均高于高氧组(0.63±0.10,22.98±2.20)及高氧CGRP拮抗剂组(O.74±0.10,24.88±1.81,均P<0.01).结论 CGRP可促进高氧暴露下AEC Ⅱ的生长增殖;PKCα参与了CGRP对细胞作用的信号传递,而NF-κB是PKCα的下游分子之一,仅部分执行PKCα的效应.     

氧化应激状态下肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡及细胞外信号调节激酶信号转导机制的研究

目的 探讨氧化应激状态下肺泡Ⅱ型上皮细胞（ATⅡ型细胞）修复存活、凋亡及其细胞外信号调节激酶（ERK）对凋亡的调控作用。方法 采用过氧化氢（H2O2）处理体外分离纯化培养的原代大鼠ATⅡ型细胞；用蛋白质免疫印迹法（Western blotting）检测H2O2刺激后ATⅡ型细胞磷酸化ERK1／2（p—ERK1／2）的表达，用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT）检测细胞存活率；用流式细胞仪检测细胞凋亡率，并观察ERK特异性抑制剂PD98059干预后细胞凋亡的变化。结果 与对照组比较，10μmol／L和100μmol／L的H2O2处理对ATⅡ型细胞存活率和凋亡率无明显影响；500μmol／L和1000μmol／L的H2O2处理可导致ATⅡ型细胞的存活率明显降低，凋亡率显著升高（P均＜0．05），呈剂量依赖性。500μmol／LH2O2处理ATⅡ型细胞30min，细胞存活率和凋亡率均无显著变化；处理180min细胞存活率明显降低，凋亡率明显增高（P均＜0．05），呈时间依赖性。500μmol／LH2O2可刺激P—ERK1／2阳性表达，以刺激30min表达最强；使用ERK抑制剂（PD98059）干预后，ATⅡ型细胞凋亡率明显增高。结论 H2O2可以剂量和时间依赖的方式诱导ATⅡ型细胞凋亡，ERK信号转导途径参与了ATⅡ型细胞的凋亡调控，对氧化应激状态下的ATⅡ型细胞可能起到保护作用。     

降钙素基因相关肽对肺泡Ⅱ型上皮细胞的保护作用

目的:探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对脂多糖(LPS)引起的肺泡Ⅱ型上皮细胞(AT-Ⅱ)损伤的保护作用。方法:分离培养大鼠AT-Ⅱ,LPS复制AT-Ⅱ损伤模型,给予不同剂量(1×10-6、1×10-7、1×10-8mol/L)的CGRP进行治疗,通过观察不同时间点细胞培养液上清中LDH、AKP、MDA、总磷脂(TPL)水平及细胞培养液上清的表面张力(ST)变化,研究CGRP对LPS引起的AT-Ⅱ损伤的保护作用。结果:不同剂量、不同时间点条件下,CGRP均可减轻LPS引起的细胞培养液上清LDH、AKP活性及MDA含量的升高,且呈明显的剂量依赖性。LPS可使细胞培养液上清中ST水平升高、TPL含量降低,CGRP在不同剂量、不同时间点均可抑制LPS引起的细胞培养液上清中ST的升高及TPL含量降低,在本实验范围内剂量依赖性明显。结论:ANP可显著减轻LPS引起的AT-Ⅱ损伤,促进肺表面活性物质(PS)的合成、分泌,且该作用有明显的剂量依赖性。     

蒿甲醚对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞DNA的影响

目的:蒿甲醚除了具有良好的临床治疗作用外,对正常组织有极大的副作用。实验拟观察蒿甲醚对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响。方法:实验于2005-09-20/2007-03-10在山东省泰山医学院生命科学研究所、中心实验室和机能实验室完成。①实验材料:蒿甲醚购自昆明制药厂,分析纯,使用前先进行预处理,处理方法:研磨后用溶液配成1g/L的母液,超声助溶解后供实验用。Wistar大鼠70只,体质量(70±15)g,雌雄不拘,由山东大学医学院实验动物中心提供。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法:将大鼠随机分为普通饲料对照组(n=10)和实验组(n=60),实验组分6个亚组,分别在饲料中加入0.1,0.2,0.4,0.8,1.6,3.2mg/kg的蒿甲醚。采用单细胞凝胶电泳技术观察大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞DNA的改变。结果:70只大鼠,饲养过程中实验组死亡6只,死亡原因为饲料添加蒿甲醚造成。当饲料中的蒿甲醚浓度为0.1mg/kg时,大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞DNA损伤率与对照组相比,差异无统计学意义;饲料中的蒿甲醚浓度超过0.2mg/kg时,大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞DNA损伤率明显增加,与对照组相比,差异有统计学意义。且损伤程度与饲料中蒿甲醚含量呈正相关。结论:当饲料中的蒿甲醚浓度超过0.2mg/kg时,蒿甲醚可在一定程度上改变肺泡Ⅱ型上皮细胞的DNA生物学特性。且随着蒿甲醚浓度的升高,这种损害更为明显。     

氧化应激诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡及Bax和p53的表达变化

目的 探讨氧化应激状态下肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)凋亡的变化规律及Bax和p53表达的变化.方法 用过氧化氢(H2O2,500 μmol/L)处理不同时间模拟机体活性氧攻击损伤ATⅡ细胞的体内情况,建立氧化损伤性细胞模型;用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,荧光显微镜及流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位,蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测Bax和p53的蛋白表达变化.结果 与对照组比较,随H2O2刺激时间延长,ATⅡ细胞存活率明显下降(F=85.211,P＜0.05),线粒体膜电位也明显下降(F=72.453,P＜0.05),凋亡率却明显增加(F=54.002,P＜0.05);同时发现Bax蛋白和p53蛋白表达均明显增加(F1=28.118,F2=43.456,P均＜0.05).结论 氧化应激能损伤ATⅡ细胞,使细胞线粒体膜电位下降,细胞凋亡率增加、存活率下降,Bax和p53可能参与了ATⅡ细胞的凋亡.     

肺泡Ⅱ型上皮细胞形态与功能的研究进展

肺泡 型上皮细胞 (type alveolarepithelial cell or type pneumocyte,AT )是一种多功能细胞 ,对维持肺泡结构和功能有重要意义。其主要功能有 :1增殖功能 :它是 型、 型上皮细胞的祖细胞 〔1 ,2〕,在正常细胞更新和损伤修复过程中 ,AT 可以分化为 型细胞 ,也可通过有丝分裂补充自身的数量 ,因此被认为是肺泡上皮的干细胞〔3,4〕 ;2合成和分泌肺表面活性物质 (pulm onarysurfactant,PS) ;3维持肺泡内外液体平衡 ;4近年还发现 AT 具有免疫调节的作用 〔5〕。AT 的位置比较特殊 ,容易受到来自空气和血液两方面的损害。空气中的各种有…     

脂氧素A4对脂多糖攻击的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞水通道蛋白5的影响

目的 探讨脂氧素A4(LipoxinA4,LXA4)对脂多糖(1ipopolysaccharide,LPS)攻击的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar type Ⅱ penumonoeyte,ATⅡ)水通道蛋白(aquaporin,AQP)5的影响.方法 对大鼠ATⅡ细胞进行分离、纯化,以1 μg/mL的LPS刺激ATⅡ 4 h建立LPS攻击ATⅡ细胞模型.将ATⅡ随机分为:空白对照(无血清的培养基不含任何药物)组;溶剂对照(乙醇,0.7μL/mL)组;LPS(1μg/mL)组;LXA4(1×107mol/mL)组;LPS+LXA4组.用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测大鼠ATⅡ中AQP5的信使核糖核酸(mRNA)的变化,免疫组织化学方法(IHC)检测ATⅡ中AQP5蛋白表达.结果 1μg/mL的LPs刺激ATⅡ4 h后,ATⅡ中AQP5的mRNA和蛋白表达较空白组明显减低(P<0.01),而LPS+LXA4组ATⅡ中AQP5的mRNA和蛋白表达较LPS组明显增高(P<0.01),且LXA4组ATⅡ中AQP5的mRNA和蛋白表达较空白组也明显增高(P<0.01).结论 大鼠ATⅡ上表达有AQP5,LXA4能促进AQP5 mRNA和蛋白表达上调,提示LXA4可能通过上调AQP5的表达起到促进肺泡水肿液清除作用.     

维甲酸拮抗丙烯醛损伤肺泡Ⅱ型上皮细胞的作用

背景:肺泡Ⅱ型上皮细胞是肺泡上皮组织的干细胞,它的损伤和多种肺部疾病密切相关。有研究显示维甲酸不仅能促进发育期大鼠肺泡的形成,还能促进肺损伤后的修复,但也有研究表明维甲酸在肺气肿模型的治疗中无明显作用。目的:探索维甲酸能否拮抗丙烯醛对原代培养大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤作用。方法:综合Dobbs等的细胞分离方法并加以改良,从普通雄性SD大鼠肺组织中成功分离出较高纯度的肺泡Ⅱ型上皮细胞,并行原代培养。应用MTT法检测丙烯醛对肺泡Ⅱ型上皮细胞活性的影响,流式细胞术检测在丙烯醛及维甲酸作用下肺泡Ⅱ型上皮细胞的细胞周期变化。结果与结论:MTT检测结果显示丙烯醛作用下大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞生长明显受抑,而且肺泡Ⅱ型上皮细胞活性与药物浓度成剂量效应关系。流式细胞仪检测结果显示丙烯醛作用下G1期细胞增加,维甲酸对丙烯醛的拮抗作用不明显。提示丙烯醛对原代培养的肺泡Ⅱ型上皮细胞具有明显的损伤作用,但维甲酸对丙烯醛的拮抗作用不明显,其作用机制还需进一步深入研究。     

血红素加氧酶-1对原代培养大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡及线粒体跨膜电位的影响

目的 探讨血红素加氧酶-1 (HO-1)对过氧化氢(H2O2)氧化损伤肺泡Ⅰ型上皮细胞(AEC Ⅰ)凋亡以及线粒体跨膜电位(MTMP)的影响.方法 将24只健康雄性SD大鼠腹腔注射麻醉处死后取肺,分离纯化AEC Ⅰ接种于培养板,原代培养24 h后等量分为正常对照组、H2O2损伤组、HO-1保护组、HO-1抑制组4组.采用0.5 mmol/L H2O2刺激AEC Ⅰ 2.5 h建立细胞氧化损伤模型.制模后用0.2μmol/L HO-1或20μmol/L锌原卟啉Ⅸ处理给予保护或抑制.处理2.5h后用荧光显微镜观察细胞的形态学变化;分别于处理0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h5个时间点用流式细胞仪检测细胞凋亡率及MTMP去极化比例的变化.结果 荧光显微镜下观察.:H2O2损伤组可见大量呈绿色(凋亡早期)、红色(凋亡中晚期)荧光的凋亡细胞;HO-1保护组所见绿色或红色荧光细胞明显减少;HO-1抑制组与H2O2损伤组镜下所见相似.流式细胞仪检测结果显示:与正常对照组比较,H2O2损伤组细胞凋亡率增加,且随H2O2作用时间延长逐渐增加,2.5h达峰值[0.5 h:(30.27±0.74)％比(3.76±0.81)％,2.5 h:(40.46±0.91)％比(22.74±0.60)％,均P＜0.05],MTMP去极化比例明显降低(0.99±0.21比1.91±0.16,P＜0.05);与H2O2损伤组比较,HO-1保护组AEC Ⅰ细胞凋亡率明显降低[0.5 h:(5.99±0.60)％比(30.27±0.74)％,2.5h:(22.69±1.69)％比(40.46±0.91)％,均P＜0.05],MTMP去极化比例明显升高(2.02±0.12比0.99±0.21,P＜0.05);与HO-1保护组比较,HO-1抑制组细胞凋亡率明显增加[0.5 h:(30.73±1.08)％比(5.99±0.60)％,2.5h:(41.38±0.57)％比(22.69±1.69)％,均P＜0.05],MTMP去极化比例明显降低(0.98±0.09比2.02±0.12,P＜0.05).结论HO-1可保护AEC Ⅰ细胞完整性,降低细胞凋亡率并且稳定MTMP,对H2O2所致大鼠AEC Ⅰ氧化损伤具有一定的保护作用.     

内毒素对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞水通道蛋白5的影响

目的:观察内毒素对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(typeⅡpenumonocyte)水通道蛋白5(aquaporin-5)的影响。方法:对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞进行分离、纯化,用1μg/mL的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞4h,并将肺泡Ⅱ型上皮细胞随机分为正常对照组和LPS组。分别采用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)和免疫组织化学法(IHC)检测肺泡Ⅱ型上皮细胞中水通道蛋白5的表达。结果:RT-PCR结果显示LPS刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞后水通道蛋白5的信使核糖核酸(mRNA)水平明显低于正常对照组(P<0.01)。免疫组织化学法显示大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞上水通道蛋白5呈阳性染色,且LPS刺激后肺泡Ⅱ型上皮细胞上水通道蛋白5阳性细胞率显著低于正常对照组(P<0.01)。结论:大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞上存在水通道蛋白5,且水通道蛋白5表达减少可能与LPS引起的肺水肿有关。     

Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡在高氧肺损伤中的作用机制

凋亡有外源性途径和内源性途径。外源性途径通过人胱天蛋白酶8（caspase-8）和BH3结构域凋亡诱导蛋白（Bid）间接作用于内源性途径.使死亡受体通路与线粒体通路联系起来,有效放大凋亡信号。Ⅱ型肺泡上皮细胞（AECⅡ）是肺组织中的重要细胞,AECⅡ的功能状态是决定肺损伤病理转归的主要因素。高氧导致AECⅡ凋亡在高氧肺损伤中起重要作用。本文就高氧肺损伤引起AECⅡ凋亡机制作一综述。     

脂氧素A4对内毒素攻击的肺泡Ⅱ型上皮细胞Na+-K+-ATP酶的影响

目的 探讨促炎症消退介质脂氧素A4(LipoxinA4,LXA4)对内毒素(endotoxin)攻击的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar type Ⅱ epithelial cells,ATⅡ)Na+-K+-ATP酶的影响.方法 AT Ⅱ成功分离纯化后随机(随机数字法)分为5组:①空白组(PBS);②溶剂对照组(乙醇,0.7μL/mL);③脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(1μg/mL)组;④LXA4(1×10-7mol/mL)组;⑤LPS(1μg/mL)+LXA4(1×10-7mol/mL)组.药物干预4 h后用RT-PCR法检测ATⅡ上Na+-K+-ATP酶α1,β1亚基的mRNA的表达,用高效液相法测定细胞ATP,ADP,AMP和腺嘌呤核苷酸总量(TAN),间接测得Na+-K+-ATP酶的活性和AT Ⅱ能荷.结果 RT-PCR结果显示:LPS组α1,β1亚基的mRNA表达较空白组明显降低(P＜0.05),而LPS+LXA4组的α1,β1亚基的mRNA表达较LPS模型组有明显增高(P＜0.05).酶活性检测结果显示:LPS组Na+-K+-ATP酶活性较空白组明显增高(P＜0.05).与LPS刺激组比较,LPS+LXA4组酶活性明显增高(P＜0.05).能荷结果显示:LPS组较空白组明显增高(P＜0.05),其余各组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 LXA4能上调内毒素攻击的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞Na+-K+-ATP酶α1,β1亚基mRNA表达,增强Na+-K+-ATP酶的活性,并能有效维持细胞的能量代谢平衡,提示LXA4可能通过上调Na+-K+-ATP酶的基因表达和功能活性,维持细胞代谢稳定,从而起到促进肺泡水肿液清除的作用.     

HO-1对原代培养大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响

目的 研究血红素加氧酶-1(HO-1)对原代培养大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AEC-Ⅱ)生长的直接影响.方法 免疫黏附法纯化SD大鼠AEC-Ⅱ,细胞进行活性和纯度鉴定后,随机分为七组:A组(正常对照组);B组(H2O2组,0.5 mmol/L H2O2);C1～5组(0.01～50 μmol/L HO-1).各组进行细胞形态学观察、细胞计数和以MTT法测定OD值.结果 ①免疫黏附法可收获AEC-Ⅱ(2～2.5)×107个/鼠,活性和纯度均＞90%;电镜下可见AEC-Ⅱ特征性结构--嗜锇性板层小体(Lb).②B组培养AEC-Ⅱ至29 h,发现贴壁细胞数量减少,胞内可见反光增强的空泡,上清液中可见较多的细胞碎片.③C组与A组比较细胞计数、OD值差异无统计学意义(P＞0.05),细胞形态无明显改变;与B组比较细胞计数、OD值差异有统计学意义(P＜0.05).结论 0.01～50 μmol/L HO-1对原代培养AEC-Ⅱ的生长没有直接的细胞毒性,可以在体外AEC-Ⅱ培养中使用.     

生长激素抑制大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的机制

目的 研究生长激素(growth horlnone,GH)抑制脂多糖(Lipopolysaceharide,LPS)诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar epithelial typeⅡcell,AEC Ⅱ)凋亡的口I能机制.方法 原代培养成年雄性SD大鼠AECⅡ细胞,按如下方式分5组(每组8个复孔):I组:对照组(仅加DMEM培养基);Ⅱ组:LPS10ug/ml损伤组;Ⅲ组:GH1组(UPS 10 ug/ml+GH 50 ng/ml);Ⅳ组:GH2组(LPS 10 ug/ml+GH 100ng/ml);V组:GH3组(LPS 10 ug/ml+GH 200 ng/ml).IPS在其他试剂均加入并置37℃5%CO2培养箱培养1 h后再加入.培养24 h后,分别对AECⅡ细胞进行流式细胞仪检测细胞凋亡和免疫组化法检测Fas蛋白表达.统计方法 采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q检验,以P<0.05为差异具有统计学意义.结果 (1)Ⅱ～V组的细胞凋亡率及坏死率均明显高于I组(g凋亡率Ⅰ.Ⅱ=12.26,q坏死率Ⅰ,Ⅱ=18.34,q调亡率Ⅰ.Ⅲ=9.63,q坏死率Ⅰ.Ⅲ=5.75,q凋亡率I,Ⅳ=9.15,q坏死率Ⅰ,Ⅳ:5.39,q凋亡率Ⅰ.Ⅴ=10.87,q坏死率Ⅰ,Ⅴ=5.91,P<0.05).但Ⅲ～Ⅴ比Ⅱ组均有明显下降(q凋亡率Ⅱ,Ⅲ=15.24,q坏死率Ⅱ,Ⅲ=16.38,q凋亡率Ⅱ.Ⅳ=15.95,q坏死率Ⅱ.Ⅳ=16.95,q凋亡率Ⅱ.Ⅴ:14.57,q坏死率Ⅱ,Ⅴ=15.61,P<0.05).(2)Ⅱ～Ⅴ组Fas阳性率明显高于Ⅰ组(qⅠ.Ⅱ=35.67,qⅠ,Ⅲ=14.32,qⅠ.Ⅳ=13.87,q Ⅰ,=26.16,P<0.05),但Ⅲ～V组Fas阳性率比Ⅱ组有明显降低(qⅡ,Ⅲ=12.54,qⅡ,Ⅳ=13.02,qⅡ,Ⅴ=6.96,P<0.05).结论 GH可能通过降低AECⅡ细胞的Fas抗原的表达而使LPS所诱导的AECⅡ细胞凋亡减少.     

大鼠肠缺血灌注肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡坏死及继发性坏死与肺损伤

肺泡Ⅱ型上皮细胞（ＥＰⅡ）是肺泡膜的重要组成部分。我们观察了肠缺血再灌注时ＥＰⅡ凋亡率、坏死率及继发性坏死及其在肺损伤中的作用，现将结果报告如下。１　材料与方法１－１　动物分组与模型制作　健康雄性成年Ｗｉｓｔａｒ大鼠４０只，随机分为正常对照组（Ｎ）、肠缺血２ｈ组（Ｉ）、肠缺血２ｈ再灌注１５ｍｉｎ组（Ｒ１）、３０ｍｉｎ组（Ｒ２）、６０ｍｉｎ组（Ｒ３）共５组，每组８只。１％戊巴比妥０－３ｍｌ／１００ｇ背部皮下注射麻醉，无菌条件下开腹，微动脉夹闭肠系膜上动脉２ｈ后松夹再灌注。不同时间点活杀动物，留取血…     

急性肺损伤幼鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞和肺表面活性蛋白A的变化

目的 探索急性肺损伤(ALI)时肺泡Ⅱ型上皮细胞(AEC-Ⅱ)和肺表面活性蛋白A(SP-A)的变化规律.方法 110只SD幼鼠(雄性53只,雌性57只)随机分为对照组、ALI组(每组分6个亚组).ALI组腹腔注射脂多糖(LP3,4 mg/ks),对照组注射生理盐水.于注射后6,12,24,36,48,72 h每组处死8只幼鼠并取材.透射电镜下观察各组AEC-Ⅱ超微结构的变化.采用半定量RT-PCR法测量各组肺组织SP-A mRNA的表达,用Western blot法测量肺组织SP-A含量.采用SPSS 12.0统计软件包进行方差分析和方差齐性检验.结果 注射LPS 24 h后,AEC-Ⅱ表面微绒毛消失.24 h和48 h时AEC-Ⅱ中板层小体(LB)出现暂时性数馈增加.48 h时LB呈特征性"指环状"绕核排列和巨大的空泡样LB.72 h时LB数目显著减少,可见破碎和残余的LB.SP-A从24 h至48 h表达显著增强(P<0.01),于36 h达最高值(6.94±0.80,P<0.01),72 h 下降至最低点(3.87 ±0.50,P<0.01).结论 ALI时AEC-Ⅱ形态变化与肺组织SP-A含量变化是时间依赖性的.AEC-Ⅱ损伤早期伴有肺组织SP-A的代偿性增加.AEC-Ⅱ损伤加重时LB出现特征性变化,可能与SP-A的代偿有关.ALI晚期,AEC-Ⅱ的严重损伤与SP-A的下降密切相关.     

表皮细胞生长因子促进大鼠肺泡Ⅱ型细胞肺水转运动能的研究

目的观察经气管滴入表皮细胞生长因子(EGF)后正常大鼠肺泡液体清除率(ALC)的变化,探讨EGF对肺泡Ⅱ型细胞(AT2 )肺水转运功能的影响.方法在国内首次建立了以125I白蛋白为示踪剂进行肺灌注检测ALC的方法.将36只SD大鼠随机分为6组,其中5组动物经气管滴入EGF(100 μg/kg),分别于48、72、120、168和240小时各测量1小时的ALC,对照组以生理盐水代替EGF,同时监测ALC测量期间的血气变化.结果对照组ALC为(21.68±3.65)%.气管滴入EGF后48、72和120小时组ALC显著升高,分别为(43.3 3±13.21)%(P<0.01)、(42.52±10.05)%(P<0.01)和(34.35±3.76)%( P<0.05);168小时后恢复正常水平.48小时组和72小时组在肺灌注后60分钟的动脉氧分压也明显高于对照组(P均<0.05).结论EGF可增加AT2的液体转运能力,促进清除肺泡内液体,从而改善肺泡的氧气交换,有可能用于肺水肿和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的治疗.