全血胶体金免疫层析法检测HBsAg的临床应用评价

目的 :对全血胶体金免疫层析试纸法检测乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)的临床应用进行评价。方法 :用全血胶体金免疫层析试纸法和ELISA法对定值HBsAg血清和 2 0 0份临床标本同时测定并观察全血胶体金免疫层析试纸法检测HBsAg的灵敏度、重复性、测定范围和稳定性。结果 :全血胶体金免疫层析试纸法检测HBsAg的下限为 1ng/ml,但对 <10ng/ml的HBsAg重复性不够 ,检测上限至少达 1万ng/ml。与ELISA比较 ,一般不出现假阳性。对抗原量过大的标本 ,金标法结果准确 ,但对抗原含量低的标本 ,可出现假阴性。结论 :全血胶体金免疫层析试纸法适用于急诊、现场采血前献血员的筛查和婴幼儿 ,但单独用于HBsAg检测 ,可出现低浓度的漏检。     

农药醚菊酯荧光定量免疫层析检测试纸研制

目的建立一种基于荧光微球的定量免疫层析检测试纸卡,用于农药醚菊酯(etofenprox)的快速定量检测,并对所制备的试纸卡性能进行评价。方法采取竞争抑制免疫层析模式,通过优化试纸各要素,研制醚菊酯检测试纸,并对其标准曲线、检测限、定量限、特异性、准确度、精密度等方面进行性能评价。结果所制备的试纸卡标准曲线回归方程R~2值达0.980 1,检测限达1.057 ng/ml;定量限达1.890 ng/ml;与类似农药交叉反应率小于0.10%;添加回收率为98.60%～106.50%;批内和批间变异系数均小于10.00%。结论所研制的醚菊酯荧光定量免疫层析试纸卡各项指标均达到要求,具有特异性好、灵敏度高、检测快速、简便的优点,可以应用于醚菊酯残留检测。     

寨卡病毒NS1抗原的金标免疫层析检测试纸条研制

目的研制一种快速检测寨卡病毒(ZIKV)NS1抗原的胶体金免疫层析试纸条。方法以胶体金标记的抗寨卡病毒NS1单克隆抗体为特异性识别及信号产生的探针,抗寨卡病毒NS1单抗和羊抗鼠多克隆抗体IgG分别固定于硝酸纤维素膜,作为检测线和质控线以制备金标免疫层析试纸条。通过肉眼对检测线上条带进行判断、读取灰度值比等方式对试纸条结果进行分析。通过检测逐级稀释的寨卡病毒NS1抗原标准品,考察该试纸条的灵敏度。进一步通过检测分别感染了寨卡病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、日本脑炎病毒的细胞上清及血清样品,评价该试纸条检测的特异性。考察存储温度及放置时间对试纸条检测寨卡病毒NS1样品的影响,评价该试纸条的稳定性。结果所研制的试纸条在寨卡病毒NS1抗原标准品浓度为100 ng/mL时能够有效检测寨卡病毒培养上清,并与感染了登革病毒、基孔肯雅病毒以及日本脑炎病毒的细胞上清及血清样品均无交叉反应。此外,室温(22～25℃)或4℃储存条件下存放时间为36周的试纸条检测效果未受影响。结论本研究研制的金标免疫层析试纸条特异性好、稳定性高,快速、简便,该方法在即时检测、大样本疾病初筛等应用领域具备一定潜力。     

D-二聚体胶体金免疫层析定量检测方法的初步建立

目的建立一种检测D-二聚体的胶体金免疫层析定量检测方法,为临床检测D-二聚体提供一种简便、快速、准确的检测方法。方法根据免疫学中双抗体夹心和免疫层析的原理,研制定量检测样本中D-二聚体的胶体金试纸条,在金标定量仪上建立标准曲线,从灵敏度、特异性、线性、精密性、稳定性和方法学对比等方面对该方法进行评价。结果本试纸条的线性范围为0.156 25~10μg/ml,回归方程Y=92.907 X+307.88,R2=0.982 68;批内变异系数(CV)为3.78%和2.81%,批间变异系数(CV)为4.95%和4.07%;与纤维蛋白原无交叉反应性;在37℃条件下保存1周;与IL公司ACL-TOP700检测系统免疫比浊法的相关性良好,回归方程Y=0.959 64 X+0.026 45,相关系数R2=0.985 93。结论本研究初步建立了检测D-二聚体的胶体金免疫层析定量检测方法,为临床检测D-二聚体提供了一种新的技术和方法。     

应用抗SjP38的单克隆抗体建立血吸虫感染的胶体金免疫层析检测体系

目的 建立一种检测日本血吸虫感染的胶体金免疫层析方法.方法 将已获得的单抗用protein-G亲和层析纯化,通过间接ELISA测定每株单抗的亲和常数.按改良过碘酸钠标记法,8株单抗标记辣根过氧化物酶(HRP)后进行不同株单抗配对,选出亲和力高、稳定性强的单抗配对组合.胶体金标记株抗体,选择最佳反应模式,建立胶体金免疫层析方法,并对弓形虫感染鼠血样、血吸虫感染前和感染后2、3、、5、6周的鼠血样进行检测.结果 8株抗SjP38单克隆抗体经纯化后纯度达95%以上,其亲和常数介于1×10^-8mol/L～2.82×10^-10mol/L.根据配对实验,1A6与9H6、1A6与9G7、6G12与9H6、6G12与9G7以及9H6与9G7为最佳配对组合.标记1A6、6G12、9H6与9G7这株单抗后筛选出最佳反应模式,即以9G7为包被抗体,包被浓度为2.5μg/μl;当1A6为金标抗体,抗体稀释浓度为1:时,检测效果最佳.对rSjp38的最低检测量为12.5 ng/ml.抗检测感染3、、5、6周小鼠血清,阳性率分别为0%、50%、60%、80%,而弓形虫感染鼠和血吸虫感染前小鼠血样的检测结果为100%阴性.结论 通过抗体配对、最佳包被量和金标抗体稀释倍数条件的优化,建立了快速、简便、特异的胶体金免疫层析方法,自制的rSjP38试纸条能检测血吸虫早期感染鼠血清中的循环抗原SjP38.     

抗恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶单克隆抗体的研制与胶体金免疫层析方法的建立

目的 制备抗恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)的单克隆抗体(McAb),将其标记胶体金,建立一种诊断恶性疟的胶体金免疫层析方法。方法 用基因重组的GDH蛋白免疫Balb/C小鼠,采用杂交瘤细胞技术制备McAb,测定其免疫球蛋白亚类及其亲和力。用protein-G亲和层析纯化抗体并用胶体金标记,建立胶体金免疫层析方法,选择最佳反应模式对疟疾血样进行检测。结果 筛选出6株能稳定分泌抗GDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株,单抗亚类均为IgG₁,亲和常数(κ)介于1×10^-8~2.82×10^-10。以镜检法为参照,建立的胶体金免疫层析方法检测恶性疟的敏感性为86.66%,特异性为96.43%。结论 建立的胶体金免疫层析方法检测恶性疟快速、简便、可靠,有望开发成为恶性疟快速诊断试剂盒。     

LC-MS/MS法检测血液和尿液中东莨菪碱和阿托品

  目的  建立曼陀罗中毒人体血液和尿液中东莨菪碱和阿托品的LC-MS/MS检测方法。  方法  采用Shim-pack GISR-HP C18色谱柱,以乙腈-甲酸（0.1%）水溶液为流动相进行梯度洗脱,电喷雾离子源正离子多反应监测模式质谱分析,采用2个特征离子对和外标标准曲线法对曼陀罗中毒人体血液和尿液中东莨菪碱和阿托品进行定性定量分析。  结果  东莨菪碱和阿托品的定量离子对分别为m/z 304.25 [M+H]+→138.15和m/z 290.2 [M+H]+→124.15。东莨菪碱和阿托品在质量浓度1～100 ng/mL范围内线性良好（R≥0.999）,检出限（LOD）分别为:血液0.45 ng/mL和0.19 ng/mL,尿液0.38 ng/mL和0.16 ng/mL;定量限（LOQ）分别为:血液1.01 ng/mL和0.63 ng/mL,尿液1.07 ng/mL和0.38 ng/mL;提取回收率分别为:血液94.38%和94.49%,尿液94.96%和96.52%;基质效应为-3.51%～0.84%。2种目标物的准确度为89.38%～102.86%,日内和日间精密度均小于6%。  结论  建立的LC-MS/MS检测方法能快速、准确的测定生物检材中东莨菪碱和阿托品的含量。     

猪鼻支原体感染免疫胶体金快速检测卡的研制

目的研制一种特异、敏感、快速的人猪鼻支原体(M.hyorhinis)感染的胶体金免疫层析法检测卡(GICAs)。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记抗猪鼻支原体单克隆抗体(McAb),选择并优化层析条件,研制双抗体夹心模式的免疫胶体金检测卡,评价其灵敏度、特异性和稳定性。结果其灵敏度检测限可达到1.72×103CFU/mL,50ng/100μL支原体全菌蛋白,与其他细菌和支原体无非特异性反应,检测用时约10min,4℃可保存6个月以上。结论本文研制的GICAs检测猪鼻支原体特异性强、灵敏度高,无需特殊仪器设备,可用于感染的流行病学调查和临床诊断。     

干化学法与免疫胶体金法在尿液潜血检测中的应用对比

目的 对比并评价尿液潜血检测中干化学法、免疫胶体金法检测差异与临床应用价值。方法选取本院2017年1月至2019年12月收治的72例肾病患者,采集尿液样本,分别采用干化学法、免疫胶体金法进行尿液潜血试验,对比这2种方法在尿液潜血检测中的价值。结果 干化学法检测的阳性率81%(58/72)、阴性率19%(14/72);免疫胶体金法检测的阳性率93%(67/72)、阴性率7%(5/72);免疫胶体金检测法阳性率比干化学法高（P<0.05）;干化学法检测的准确度88%(60/72);免疫胶体金法检测的准确度99%(71/72);免疫胶体金法检测准确度比干化学法高（P<0.05）。结论 在尿液潜血检测过程中,免疫胶体金法的准确性高于干化学法。临床检测中可将免疫胶体金法与干化学法相结合,提高尿潜血检测的准确性,从而为患者疾病的诊断与治疗提供有效依据。     

三种隐血检测法的方法学评价及结果分析

目的：对血红蛋白单克隆抗体免疫胶体金法、血红蛋白与转铁蛋白联合免疫法、匹拉米洞化学法3种隐血检测法进行方法学评价,找出高临床符合度的隐血检测方法。方法：配制不同浓度的血红蛋白液,测出以上3种方法的最低检出限与最高检测浓度;利用5种常见动物的抗凝血评价隐血检测方法的特异性;收集住院患者粪便和胃液标本同时进行3种方法的隐血检测,内镜检查为金标准,计算临床灵敏度、临床特异性、阴性似然比、阳性似然比、尤登指数、临床符合率。结果：凯创试剂卡胶体金的检测范围为200 ng/mL至10 mg/mL,沃文特试剂卡胶体金的检测范围为300 ng/mL至2.5 mg/mL,匹拉米洞化学法的最低检测限为2 500 ng/mL,联合免疫法的最低检测限为10 ng/mL;凯创试剂卡胶体金、沃文特试剂卡胶体金、匹拉米洞化学法、联合免疫法检测粪便与胃液隐血临床符合率分别为96.0%、95.8%、79.5%、97.5%;92.9%、92.9%、94.6%、90.2%。粪便隐血检测的结果,4组间有明显的差异（P=0.000）,但胃液隐血检测结果组间无差异（P=0.083）。结论：粪便标本的隐血检测,联合免疫法的临床符合度优于血红蛋白免疫法,血红蛋白免疫法优于化学法;胃液标本的隐血检测,3种方法之间无明显差异。     

鱼类致病性迟钝爱德华氏菌胶体金快速检测试纸的研制

制备迟钝爱德华氏菌胶体金快速检测试纸并对其性能进行检测。以柠檬酸三钠作为还原剂制备胶体金颗粒,标记迟钝爱德华氏菌多克隆抗体,将羊抗兔IgG和纯化后的迟钝爱德华氏菌多克隆抗体包被于NC膜上作为质控线和检测线,以检测样品中的迟钝爱德华氏菌(E. tarda)。结果表明：所研制的试纸特异性良好,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌等常见细菌或病原菌进行测试未出现交叉反应;敏感度达到105 CFU/mL,反应时间仅为5~10 min,可以用于感染迟钝爱德华氏菌大菱鲆腹水的现场检测,具有操作     

斑点免疫金渗滤试验检测淋球菌抗原的应用研究

目的：建立一种简易快速的斑点免疫金渗滤试验（ＤＩＧＦＡ）用于检测淋球功抗原。方法：用抗淋球菌单克隆抗体为包被抗体,以胶体金标记兔抗淋球菌ＩｇＧ作探针,制成ＤＩＧＦＡ反应盒。持异性强。与脑膜炎球菌、葡萄球菌、肺炎球菌、大肠杆菌等无交交丸反应,淋球菌抗原最低检出量为６３．００ｎｇ／ｍｌ。经５１例临床分离株测定,敏感性为９８．０４％,特异性１００％。结论：检测淋球菌抗原的ＤＩＧＦＡ是一种简易快速、敏感、     

CGIA和ELISA诊断肝吸虫病的比较分析

目的 比较胶体金免疫层析法（CGIA）和酶联免疫吸附法（ELISA）诊断肝吸虫病的特异性和准确性，探讨其在肝吸虫病诊断中的应用。方法 采用CGIA和ELISA检测36例大便检出虫卵的肝吸虫病患者血清中的肝吸虫抗体。并设立健康人对照组和其它疾病患者作为阴性对照。结果 CGIA和ELISA对阳性标本检测的准确性分别为94．44％和97．22％；对阴性病例检测的特异性分别为98．06％和96．12％；对正常标本检测的特异性分别为97．78％和93．33％。结论 CGIA和ELISA对肝吸虫病患者血清抗体检测的准确性和特异性无显著性差异，两种方法的准确性和特异性均高，且操作简便，均可作为肝吸虫病的初诊及普查筛选方法。     

应用抗SjP38的单克隆抗体建立血吸虫感染的胶体金免疫层析检测体系

OBJECTIVE: To establish a colloidal gold immunochromatographic assay (GICA) for detecting Schistosome japonicum (Sj). METHODS: Eight monoclonal antibodies (mAbs) against Sj p38 antigen (1A6, 3C4, 3D12, 6F10, 6G12, 9H6, 9G7 and A5H) prepared previously were purified by protein-G affinity chromatography. The affinity constant (K(aff)) was determined by indirect enzyme-linked immunosorbent assay. All the mAbs were labeled with horseradish peroxidase by sodium oxidation method and the mAb pairs with high affinity and stability were identified according to their optical density at 450 nm (OD450). Four mAbs (1A6, 6G12, 9H6 and 9G7) were chosen for colloidal gold labeling. GICA was then performed by further optimization of the labeling and the conditions were determined. The sera of mice at different infection stages were examined with GICA dipstick, with the sera collected before infection and those of Toxoplasma gondii-infected mice as negative controls. RESULTS: The purity of the 8 mAbs was higher than 95% with K(aff) ranging from 2.8x10(-10) to 1x10(-8) mol/L. 9G7 coating (2.5 mg/ml) as the capture antibody and detection with 1A6 (diluted at 1:4) as the labeling antibody was determined as the best reaction model. With this combination, the positivity rates of the detection were 40%, 50%, 60% and 80% for mouse sera collected at 3, 4, 5 and 6 weeks after Schistosome japonicum infection, respectively, without positive results for the negative control samples. CONCLUSION: GICA established in this study is characterized by simplicity, rapidity and good sensitivity, and the prepared rSjP38 dipstick can test the circulating antigen SjP38 in early stage of infection.     

Development of novel-nanobody-based lateral-flow immunochromatographic strip test for rapid detection of recombinant human interferon α2b

Recombinant human interferon α2b (rhIFNα2b) is widely used as an antiviral therapy agent for the treatment of hepatitis B and hepatitis C. The current identification test for rhIFNα2b is complex. In this study, an anti-rhIFNα2b nanobody was discovered and used for the development of a rapid lateral flow strip for the identification of rhIFNα2b. RhIFNα2b was used to immunize an alpaca, which established a phage nanobody library. After five steps of enrichment, the nanobody I22, which specifically bound rhIFNα2b, was isolated and inserted into the prokaryotic expression vector pET28a. After subsequent purification, the physicochemical properties of the nanobody were determined. A semiquantitative detection and rapid identification assay of rhIFNα2b was developed using this novel nanobody. To develop a rapid test, the nanobody I22 was coupled with a colloidal gold to produce lateral-flow test strips. The developed rhIFNα2b detection assay had a limit of detection of 1 μg/mL. The isolation of I22 and successful construction of a lateral-flow immunochromatographic test strip demonstrated the feasibility of performing ligand-binding assays on a lateral-flow test strip using recombinant protein products. The principle of this novel assay is generally applicable for the rapid testing of other commercial products, with a great potential for routine use in detecting counterfeit recombinant protein products.     

PCR-核酸试纸条快速鉴定皮氏罗尔斯顿菌

目的 基于PCR-核酸试纸条技术,建立快速检测制药用水中皮氏罗尔斯顿菌的方法。方法 利用煮沸法提取皮氏罗尔斯顿菌基因组DNA,以皮氏罗尔斯顿菌16S rDNA为靶基因使用NCBI primer-BLAST 5.0设计一对特异性引物,经克隆转入大肠杆菌感受态细胞DH5α,鉴定PCR产物;分别在引物的5’端标记FITC与Biotin;组装核酸试纸条,建立PCR-核酸试纸条的方法;优化反应体系中胶体金标记的链霉亲和素与抗体浓度的最佳工作量;并对试纸条进行反应原理验证及灵敏度、特异性、稳定性评价;对某生物科技有限公司制药用水检测出的7株皮氏罗尔斯顿菌进行实验并利用MEGA构建进化树,对污染溯源进行分析。结果 煮沸法提取基因组浓度较好,纯度1.8~2.0;PCR产物经克隆转化、测序比对,与GenBank已登记的皮氏罗尔斯顿菌16S rDNA相似度为100%;利用胶体金放大原理,每100 μL胶体金溶液中,加入3.5 μL链霉亲和素进行标记,硝酸纤维素膜上检测线为2.0 mg/mL抗FITC抗体,质控线为1.2 mg/mL生物素化BSA,与阳性扩增产物结合产生红色条带;按照优化条件进行试纸条组装,每100 μL样品展开液中加入8 μL PCR产物,反应5 min后观察结果;核酸试纸条特异性结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致,仅有皮氏罗尔斯顿菌为阳性结果,不动杆菌、气单胞菌、假单胞菌、非脱羧勒克氏菌均为阴性结果;核酸试纸条灵敏度评价,将DNA浓度降至10-5 ng/μL时,试纸条检测线仍有条带,较琼脂糖凝胶电泳结果灵敏度高1000倍;核酸试纸条稳定性评价,将试纸条在3、6、9、12月进行检测,稳定性较好。结论 建立PCR-核酸试纸条技术检测制药用水中皮氏罗尔斯顿菌,具有简单快速、特异性强、灵敏度高、成本较低等优点,适用于制药企业对制药用水的日常检测。     

全血快速检测甲胎蛋白胶体金免疫层析方法的研制和应用

目的:建立一种简便、快速、准确的检测甲胎蛋白(AFP)的方法。方法：采用单克隆抗体胶体金标记技术,运用双抗体夹心法免疫层析原理,建立全血快速AFP胶体金层析法。结果：与ELISA法进行对比,AFP全血试纸条的阳性符合率98．31％,阴性符合率96．46％,总符合率97．09％。结论：AFP全血试纸条具有快速简便,结果易判,无需仪器设备,末梢全血可即采即测等优点,能满足急诊检验的需要,尤其为大面积的体检普查,广大基层门诊推广提供了便利条件。     

基于荧光免疫层析法建立甲型流感病毒快速检测技术的研究

目的 基于荧光免疫层析技术平台,针对甲型流感病毒抗原,开发甲型流感病毒快速诊断试剂.方法 利用荧光微球标记甲型流感病毒单克隆抗体、生物素标记甲型流感病毒单克隆抗体以及包被亲和素和羊抗鼠IgG多克隆抗体的检测卡,构建甲型流感病毒检测体系.通过原料评价、校准曲线、空白限、准确度、线性范围、重复性、热稳定性及临床比对,验证试剂诊断性能.结果 本研究得到的荧光免疫层析试剂具有准确度高、检测范围宽、重复性和热稳定性好等优点,其正确率及敏感率均明显高于经典的胶体金试剂.结论 本研究应用将为国境口岸或医院的甲型流感病毒快速筛查提供方便、快捷、灵敏的技术手段.     

CMV抗体免疫金快速检测试剂盒的开发与初步应用

目的: 开发一种低成本、简单易用的基于免疫金渗滤法的试剂盒,以用于检测分析血清中的巨细胞病毒抗体. 方法: 将用人工合成的人巨细胞病毒(HCMV)抗原表位的线性肽和分支多抗原肽分别划线固定于硝酸素纤维膜上,制成免疫层析检测试纸条,血清中IgG与测试条上金标记物结合后沿硝酸纤维素膜移动,与膜上的固相抗原结合形成肉眼可见的红色带条并用GICA和ELISA试剂盒对比检测120份血清标本中抗HCMV抗体. 结果: 分支多抗原肽制成的免疫层析检测试纸条的灵敏度为97.9%,特异度为87.5%,两法符合率为95.8%. 结论: GICA检测血清中的抗HCMV抗体特异性强,灵敏度高,简便快速,有广泛应用价值.