人全外显子组测序IDT捕获探针的性能验证

目的探讨已建立的二代测序技术进行人全外显子组测序项目对变异的检出性能。 方法对4例实验室能力比对验证样本和4例已知结果样本进行全外显子组检测,分析点变异和插入缺失变异,从检测准确度、检测灵敏度、检测特异性、精密度和可报告范围等方面进行性能评估。数据质量控制以目标区域覆盖率、捕获特异性和平均深度为基础。 结果数据输出量大于8G,实现了目标序列区域99.7%以上的覆盖率,捕获特异性86%以上,平均测序深度100×以上,Q30大于90%,对SNV的检出率达100%,50 bp以下Indel检出率达100%。 结论本标准操作在验证范围内对变异的检出能力达到应用的要求。     

液相蛋白芯片法检测胱抑素C的条件优化与方法学评价

目的 优化液相蛋白芯片检测胱抑素C(cystatin C,CysC)的条件并对其进行方法学评价。方法 采用液相蛋白芯片检测技术的双抗夹心法对CysC进行检测。在确定捕获抗体与检测抗体的最佳浓度组合的基础上，通过确定生物检测限与检测下限、绘制S型曲线和判断线性范围、建立标准曲线与回归方程对检测条件进行优化。对检测方法的正确度、精密度、可报告范围、分析特异性进行方法学评价。结果 液相蛋白芯片法检测CysC时捕获抗体与检测抗体的最佳浓度组合为26.6μg/mL与1∶800;检测下限和生物检测限分别为0.037和0.237 ng/mL;回归方程为y=-3.315x²+283.04x+160.89,R²=0.9921;该方法检测CysC的相对偏移为5.81%;稀释回收率为70.35%～84.91%(n=3);加标回收率为79.94%～122.41%(n=3);方法学比对实验的相关系数r=0.616,P<0.05,两种方法检测结果间的差异无统计学意义(t=0.948,P=0.358);批内精密度为3.54%～4.03%(n=10);中间精密度为12...     

CO2诱捕法与紫外线灯诱法在成蚊监测中的比较研究

目的研究CO2诱捕法与紫外线灯诱法在成蚊监测中的效果。方法 2007年5-10月份,在上海虹桥国际机场公共绿地内,采用CO2诱捕法与紫外线灯诱法每旬监测一次成蚊密度。结果 CO2诱捕法所捕获雌蚊总数占捕获总数的97.01%,捕获淡色库蚊雌蚊总数占捕获淡色库蚊总数的97.02%,分别高于灯诱法的90.14%和90.58%(χ总2=18.82,P<0.01;χ淡2=16.27,P<0.01);灯诱法捕获的淡色库蚊占捕蚊总数的98.90%,高于CO2诱捕法的94.02%(χ2=13.49,P<0.01);2种方法所监测的蚊虫季节消长趋势基本一致,CO2诱捕法能连续捕获白纹伊蚊,紫外线灯诱法只在某个时点捕获。结论 CO2诱捕法适用于常规监测和白纹伊蚊专项监测。     

外周血指标检测在急性出血性脑卒中深静脉血栓中的诊断价值

目的探讨外周血指标检测在急性缺血性脑卒中(AIS)深静脉血栓(DVT)中的诊断价值。方法根据血栓形成情况,将410例AIS患者分为血栓组(n=210)和无血栓组(n=200),另将180例体检健康者设为对照组,检测各组外周血P-选择素、D-二聚体、同型半胱氨酸(Hcy)和超敏C反应蛋白(hs-CRP)水平。结果血栓组平均年龄明显高于无血栓组(P<0.05);血栓组D-二聚体、P-选择素水平均明显高于无血栓组与对照组(P<0.05);血栓组的hs-CRP水平明显高于对照组(P<0.05);无血栓组的D-二聚体、P-选择素及hs-CRP水平明显高于对照组(P<0.05);三组Hcy水平无明显差异(P>0.05)。联合应用后,检测的灵敏度为70.6%,特异度为96.6%。结论 P-选择素和D-二聚体联合检测在诊断AIS DVT方面具有较高价值。     

全外显子测序分析Noonan综合征RAF1基因新发突变

目的应用全外显子测序技术对疑似Noonan综合征(NS)的危重早产儿及其父母进行基因诊断,探讨基因型与临床表型之间的关系。方法收集患儿及其父母的外周血标本及临床资料,应用Agilent Sure Select Human All Exome V5试剂盒进行全基因组外显子捕获,Illumina 550测序仪进行双端高通量测序,Sanger测序验证家系成员以明确突变遗传方式。结果全外显子测序发现NS患儿RAF1基因杂合错义突变c. 770CT,p. S257L、Sanger测序验证家系成员为新发突变。结合患儿特殊面容、双侧心房及右室增大、中度肺动脉高压(PAH)等临床症状诊断为Noonan综合征。结论应用全外显子测序技术能够快速发现Noonan综合征基因突变,对重症新生儿病例的明确诊断及临床遗传咨询具有重要意义。     

阿德福韦酯相关位点预存病毒变异的病原学及临床特征分析

目的了解慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者抗病毒治疗前阿德福韦酯(ADV)相关位点预存病毒变异的发生情况以及临床特点。方法采用基因测序的方法对211例拟行抗病毒治疗的慢性HBV感染者的血清样本进行P区病毒基因测序,同时检测HBV基因型、HBV血清学标志物、HBV DNA等。依据病毒检测结果分为预存病毒变异组和无变异组。结果 211例慢性HBV感染者中,检测出ADV预存病毒变异9例(4.27%),其中4例有不规范的核苷(酸)类似物用药史(ADV除外),变异位点以rtN238T为主(44.44%),且以多个位点变异(55.56%)、完全变异株和野生株共存(88.89%)为主;预存病毒变异组中男性及终末期肝病的构成比均高于无变异组(P<0.05,P<0.001);预存病毒变异组的年龄为(45.9±10.5)岁,无变异组为(35.6±10.2)岁(t=2.978,P=0.003);两组的HBV基因型构成、E抗原阳性状态及HBV DNA水平比较差异均无统计学意义。结论在未经ADV抗病毒治疗的慢性HBV感染者中存在ADV相关位点预存病毒变异,并可能与患者不规范应用抗病毒药物有关;HBV感染史较长、病情持续进展以及男性患者易出现ADV相关位点预存病毒变异;患者应该接受和执行规范的抗病毒治疗,以达到预防病毒变异,从而避免挽救治疗。     

罗哌卡因复合曲马多与芬太尼应用于子宫全切术后硬膜外镇痛的临床研究

目的:比较曲马多、芬太尼分别和罗哌卡因合用对于子宫全切术后硬膜外镇痛的作用,以期为临床安全合理用药提供依据。方法:选择ASAⅠ~Ⅱ级经腹子宫全切患者60例,随机分为三组。R组:0.15%罗哌卡因(n=20);F组:0.15%罗哌卡因+0.000 4%芬太尼(n=20);T组:0.15%罗哌卡因+0.5%曲马多(n=20)。三组术后均应用首剂镇痛药0.5%罗哌卡因6 m l硬膜外注入,连接一次性微量泵进行硬膜外镇痛。监测术后不同时间的VAS疼痛评分、心率、平均动脉压;观察恶心等不良反应和下肢运动阻滞情况以及肛门排气时间;总体满意度评分。结果:R组VAS评分明显高于F组以及T组,有显著性差异(P<0.05);F组和T组VAS评分无明显差异(P>0.05);F组恶心、呕吐发生率高于R组和T组(P<0.05);心率、平均动脉压各组间以及术前无显著性差异(P>0.05);F组和T组镇痛总体满意度优良率明显高于R组(P<0.05)。结论:曲马多、芬太尼分别与罗哌卡因合用均可达到有效的术后硬膜外镇痛效果,曲马多与罗哌卡因配伍副作用发生率较低,是一种更为为安全有效的硬膜外术后镇痛配方。     

儿科护理管理中细节管理的应用价值研究

目的探讨细节管理在儿童护理管理中的应用效果。方法该次研究对象选取该院儿科2018年4月-2019年4月收治的住院患儿86例,回顾性分析其临床资料,按照护理模式分组,其中对照组(n=40)采取常规护理模式,观察组(n=46)采取细节管理,比较两组护理效果。结果观察组护理质量良好率为100.0%,明显高于对照组80.0%,组间差异有统计学意义(P<0.05);观察组护理满意度为97.8%,明显高于对照组82.5%,组间差异有统计学意义(P<0.05);观察组无护理纠纷案例,护理失误发生率为2.2%,对照组均为15.0%,组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论细节管理应用于儿科护理管理中临床效果优良,可明显减少护理纠纷与失误事件,增强护理质量,提高护理满意度,值得推广。     

全外显子及靶向文库捕获测序在多囊肾病基因诊断中的应用比较

目的比较全外显子和靶向文库捕获高通量测序对多囊肾病相关基因的检测效率。方法对6份多囊肾病标本(包括一份低比例嵌合变异标本)分别进行全外显子捕获或靶目标捕获2种方法建立文库,Illumina Hi Seq 2000仪器连续双向测序。结果以PKD1、PKD2和PKHD1 3个基因作为目标序列,靶向捕获法平均测序深度为190倍,5倍以上测序深度占全部有效序列的85.59%,靶区域覆盖度95%以上,但PKD1第一外显子仍有200~300 bp区域不能覆盖;全外显子捕获法平均测序深度为28.34倍,5倍以上测序深度占全部有效序列的55.35%,目标区域覆盖度较低,PKD1外显子覆盖度小于40%。结论靶向文库捕获测序法具有较髙的敏感性、准确性,更适合PKD基因变异的检测,但高通量测序技术对PKD1基因检测仍有不足之处。     

NLR TLR7基因多态性与肠道病毒感染患儿预后及临床表型的相关性

目的 探讨中性粒细胞/淋巴细胞(NLR)及Toll样受体7(TLR7)基因单核苷酸多态性(SNP)与肠道病毒感染患儿不同临床表型及不同感染型别的相关性。方法 应用巢式RT-PCR进行肠道病毒分型；TapMan探针基因分型技术，对200例感染者和100名健康对照TLR7基因rs3853839位点进行基因分型，比较其等位基因频率的差异；检测相关SNP位点不同基因型携带与不同临床表型的相关性。结果 测序分析分型：EV71型8.5%(17/200)、CoxA16型17.5%(35/200)、CoxA6型28.5%(57/200)、CoxA10型22.0%(44/200),其他肠道病毒型23.5%(47/200);EV71感染者rs3853839基因型GC和CC的频率明显高于其他型别感染组(P<0.05);脑炎/无菌性脑膜炎组rs3853839基因型C的频率也明显高于其他症状组(P<0.05);重症组患儿NLR高于轻症组(P<0.05),NLR升高与疾病严重程度显著相关。回归分析确定NLR升高(HR=2.46,95%CI为1.99～4.669)。结论 TLR7基因rs38538...     

通过外显子组测序对1例孤独症谱系障碍患者的致病基因分析

目的 应用外显子测序技术对1例孤独症谱系障碍的男童进行外显子组测序分析,寻找致病基因。方法 选择1例就读于自闭症特殊学校的5岁男童,收集其临床资料,提取外周静脉血DNA,应用Nimblegen外显子序列捕获芯片及高通量测序技术对外显子区域进行测序。结果 通过全外显子组捕获测序发现了非同义突变11 309个,移码突变365个,同义突变23 075个,其中发现有4个基因的突变已有文献报道可能与孤独症谱系障碍的发病有关,这4个基因包括PTEN、AFF2、LAMB1、NRCAM。结论 应用外显子组捕获测序对该例孤独症谱系障碍的男童进行测序分析显示,大量单核苷酸多态性可能与该病的发生有关,也进一步证实了PTEN、AFF2、LAMB1、NRCAM这4个基因可能与孤独症谱系障碍的发生有关,有待进一步大样本研究及实验室研究验证其在孤独症谱系障碍发病中的具体机制。     

无精子症患者基因检测分析

目的:利用全外显子测序技术,筛选无精子症患者相关基因,丰富男性不育基因库。方法:抽取20例无精子症患者外周血,提取DNA,使用杂交捕获方法构建DNA文库,采用高通量测序技术检测人类全外显子组中20099个基因的外显子区及旁侧内含子区(20bp),将测序数据与人类基因组hg19参考序列进行比对,筛选变异基因,变异位点进行Sanger测序验证。结果:共计筛选出26个基因43个变异位点,排除15个常染色体隐性遗传的单个变异位点及13个与精子运动相关的变异位点,剩余11个基因的15个变异位点可能与精子发生障碍相关,其中包括FAM71B、STARD9、CLTCL1、PCBP3、S100PBP等5个在睾丸组织高表达基因,SYCE3、EFCAB6、DDX4、KDM5D、RGS22、MTL5等6个基因可能与精子发生障碍相关。结论:通过研究筛选到可能影响男性不育的基因,为男性不育的基因诊断研究提供参考。     

纳米金基因芯片结合通用引物1次PCR法同时检测多个病原菌的研究

目的基于基因分型技术构建通用引物1次PCR法的样品制备技术,并结合纳米金基因芯片检测系统实现1次对多个病原菌的检测分析。方法针对rDNA保守序列设计通用引物,实现1次PCR完成对各靶细菌ISR序列的扩增;设计针对各靶细菌的特异探针,构建纳米金新型基因芯片,并用芯片进行实际检测。结果设计的通用引物可实现对12种待检靶细菌的正确扩增;选用的各探针特异性强、可靠性好;芯片具有较好的灵敏度、特异性及可靠性;检测敏感性达到50 fmol/L;临床检测显示本方法准确可靠。结论与多重PCR样品制备法芯片比较,本芯片检测的步骤和复杂性大为减低,且有较好的检测性能,可用于各靶病原菌的检测。     

Exome sequencing of hepatocellular carcinoma in lemurs identifies potential cancer drivers: A pilot study

Background and objectivesHepatocellular carcinoma occurs frequently in prosimians, but the cause of these liver cancers in this group is unknown. Characterizing the genetic changes associated with hepatocellular carcinoma in prosimians may point to possible causes, treatments and methods of prevention, aiding conservation efforts that are particularly crucial to the survival of endangered lemurs. Although genomic studies of cancer in non-human primates have been hampered by a lack of tools, recent studies have demonstrated the efficacy of using human exome capture reagents across primates.MethodologyIn this proof-of-principle study, we applied human exome capture reagents to tumor–normal pairs from five lemurs with hepatocellular carcinoma to characterize the mutational landscape of this disease in lemurs.ResultsSeveral genes implicated in human hepatocellular carcinoma, including ARID1A, TP53 and CTNNB1, were mutated in multiple lemurs, and analysis of cancer driver genes mutated in these samples identified enrichment of genes involved with TP53 degradation and regulation. In addition to these similarities with human hepatocellular carcinoma, we also noted unique features, including six genes that contain mutations in all five lemurs. Interestingly, these genes are infrequently mutated in human hepatocellular carcinoma, suggesting potential differences in the etiology and/or progression of this cancer in lemurs and humans.Conclusions and implicationsCollectively, this pilot study suggests that human exome capture reagents are a promising tool for genomic studies of cancer in lemurs and other non-human primates.Lay SummaryHepatocellular carcinoma occurs frequently in prosimians, but the cause of these liver cancers is unknown. In this proof-of-principle study, we applied human DNA sequencing tools to tumor–normal pairs from five lemurs with hepatocellular carcinoma and compared the lemur mutation profiles to those of human hepatocellular carcinomas.     

多色荧光探针的滚环扩增技术检测结核分枝杆菌耐药基因

本研究旨在构建基于核酸滚环扩增（RCA）的简便快速、超灵敏的光学生物传感技术,并将其运用于结核杆菌耐药相关基因的多重检测。本研究在2020年2月至2021年5月期间,于陆军军医大学第一附属医院检验科,针对异烟肼、利福平和链霉素耐药的高频基因突变位点katG315（AGC?ACC）、rpoB531（CAC?TAC）和rp...     

荧光定量PCR方法快速检测人博卡病毒的研究

目的建立特异、快速、灵敏的、用于人博卡病毒核酸检测的荧光定量PCR方法。方法对博卡病毒的ns1基因应用Clustal W软件进行序列同源性比对,在保守区设计特异性引物和TaqMan探针,并对荧光PCR反应条件进行优化,验证方法的特异性,并将该方法与国际上通用的针对人博卡病毒ns1基因和np基因的普通PCR方法进行灵敏度比对;同时将该方法应用于疑似患者临床标本检测。结果该方法针对ns1基因进行扩增,对人博卡病毒核酸检测有高度特异性,与副流感1、2、3型,甲型、乙型流感病毒,呼吸道合胞病毒,腺病毒,冠状病毒229E、OC43,偏肺病毒以及鼻病毒等均无交叉反应。检测的灵敏度均比国际上通用的扩增ns1基因及np基因的PCR方法高10倍。用该方法从144份急性上呼吸道感染患者咽拭标本中检出了2份博卡病毒阳性,从病毒核酸提取至检测完成仅需3 h左右;用普通PCR仅能检出1份阳性标本,且耗时需5 h左右。结论该研究建立的TaqMan荧光定量PCR是一种快速检测人博卡病毒特异、敏感的方法,适用于临床早期诊断。     

Exome copy number variation detection: Use of a pool of unrelated healthy tissue as reference sample

An increasing number of bioinformatic tools designed to detect CNVs (copy number variants) in tumor samples based on paired exome data where a matched healthy tissue constitutes the reference have been published in the recent years. The idea of using a pool of unrelated healthy DNA as reference has previously been formulated but not thoroughly validated. As of today, the gold standard for CNV calling is still aCGH but there is an increasing interest in detecting CNVs by exome sequencing. We propose to design a metric allowing the comparison of two CNV profiles, independently of the technique used and assessed the validity of using a pool of unrelated healthy DNA instead of a matched healthy tissue as reference in exome‐based CNV detection. We compared the CNV profiles obtained with three different approaches (aCGH, exome sequencing with a matched healthy tissue as reference, exome sequencing with a pool of eight unrelated healthy tissue as reference) on three multiple myeloma samples. We show that the usual analyses performed to compare CNV profiles (deletion/amplification ratios and CNV size distribution) lack in precision when confronted with low LRR values, as they only consider the binary status of each CNV. We show that the metric‐based distance constitutes a more accurate comparison of two CNV profiles. Based on these analyses, we conclude that a reliable picture of CNV alterations in multiple myeloma samples can be obtained from whole‐exome sequencing in the absence of a matched healthy sample.     

用DNA microarray快速检测淋球菌耐喹诺酮类药物基因突变

研究DNA microarray的制备及其检测淋球菌耐喹诺酮类药物基因突变的准确性。方法根据淋球菌药敏及测序结果分别对淋球菌gyrA和parC基因的序列设计特异引物和探针并制作DNA microarray。对淋球菌临床拭子进行PcR扩增并荧光标记包含gyrA和parC基因的目的DNA片段，与芯片杂交，同时以测序法进行双盲淋球菌耐喹诺酮类药物基因突变的检测。结果87份泌尿生殖道试子全部可用DNA microarray检测出来，芯片检测结果与药敏结果符合率为100％，与测序结果符合率为97．7％。结论用DNA microarray来检测淋球菌gyrA和parC基因突变快速、特异性高和灵敏度高，可以应用于临床耐药性检测。     

焦磷酸测序与PCR产物直接测序在乙型肝炎病毒耐药基因检测中的敏感性比较

目的 通过与PCR产物直接测序比较,评价焦磷酸测序法在乙型肝炎病毒耐药基因检测中的应用价值.方法 选取临床使用拉米夫定抗病毒治疗慢性乙型肝炎患者,分别采用巢式PCR焦磷酸测序法与巢式PCR产物直接测序法检测拉米夫定相关耐药位点rtl80变异情况,比较两种方法的敏感性与特异性.结果 焦磷酸测序与PCR产物直接测序均能准确的检测出优势病毒株(占总群＞90％),焦磷酸测序中rt180M所占比例在90％～50％时,PCR产物直接测序法检出率下降至76.92％及50.00％;焦磷酸测序样本中rtl80M所占比例为50％～10％,PCR产物直接测序法对耐药基因的检出率降至15.38％～10.00％;准种(占总群＜10％)焦磷酸测序可以测出,但PCR产物直接测序法无法检测出.结论 焦磷酸测序的方法监测乙型肝炎病毒变异同PCR产物直接测序法相比,有更好的灵敏性,在抗病毒治疗过程中能够检测HBV准种及种群漂移,对于研究抗病毒疗效及耐药预测具有重要意义.