少突胶质前体细胞的培养、鉴定及巨噬细胞移动抑制因子对其促增殖作用研究

目的少突胶质细胞是中枢神经系统的重要组成部分。本文探讨获取小鼠高纯度少突胶质前体细胞系的培养及鉴定方法,以及巨噬细胞移动抑制因子（MIF）对其增殖活性的调节。方法取新生（0-2 d）C57B6小鼠的大脑皮层进行混合胶质细胞培养,在9-10 d时采用振荡、差速贴壁的方法分离、纯化少突胶质前体细胞,然后用添加了神经营养因子（N2）、血小板衍生生长因子-AA（PDGF-AA）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的无血清培养基培养。倒置显微镜下每天观察细胞的生长情况,免疫荧光法对表面抗原进行细胞鉴定。然后按104个细胞/孔加入96孔板培养,细胞70%-80%融合时用不同浓度MIF处理细胞,48 h后用甲基噻唑基四唑（MTT）检测细胞增殖程度。结果获得纯度90%以上少突胶质前体细胞（OPCs）,少突胶质前体细胞NG2及血小板衍生生长因子受体（PDGFR）抗体阳性;胶质细丝酸性蛋白（GFAP）及髓鞘碱性蛋白（MBP）均为阴性。MTT检测结果显示低剂量的MIF能促进OPCs的增殖,并具有剂量效应关系;高剂量MIF则抑制OPCs的增殖。结论通过振荡及差速贴壁法并结合少突胶质细胞定向培养基可以成功获得高纯度的OPCs,MIF能以剂量效应关系促进OPCs增殖。为进一步深入探讨其相关机制及OPCs移植治疗脊髓损伤奠定基础。     

高纯度少突胶质前体细胞改良培养方法的建立

目的对传统培养方法进行改良,以获得更高纯度的少突胶质前体细胞（OPCs）。方法新生1～2d Sprague-Dawley（SD）大鼠的大脑皮质混合胶质细胞原代培养8d后,采用恒温摇床振荡分离法、差速贴壁法和胰酶消化法结合条件限定培养基纯化培养细胞,台盼蓝染色光学显微镜观察细胞形态;纯化培养2d后进行A2B5和DAPI免疫荧光染色鉴定和细胞纯度分析。结果光学显微镜观察发现纯化培养细胞的胞膜完整,细胞无损伤;免疫荧光染色后细胞纯度分析显示,A2B5染色阳性细胞占DAPI染核细胞的百分比为98.14%。结论通过对传统的混合胶质细胞培养及振荡分离和纯化方法的改进,能够培养出高纯度的OPCs。     

高纯度少突胶质前体细胞改良培养方法的建立

目的 对传统培养方法进行改良,以获得更高纯度的少突胶质前体细胞(OPCs)。方法 新生1~2 d Sprague-Dawley（SD）大鼠的大脑皮质混合胶质细胞原代培养8 d后,采用恒温摇床振荡分离法、差速贴壁法和胰酶消化法结合条件限定培养基纯化培养细胞,台盼蓝染色光学显微镜观察细胞形态;纯化培养2 d后进行A2B5和DAPI免疫荧光染色鉴定和细胞纯度分析。结果 光学显微镜观察发现纯化培养细胞的胞膜完整,细胞无损伤;免疫荧光染色后细胞纯度分析显示,A2B5染色阳性细胞占DAPI染核细胞的百分比为98.14%。结论 通过对传统的混合胶质细胞培养及振荡分离和纯化方法的改进,能够培养出高纯度的OPCs。     

新生大鼠大脑O-2A细胞系的分离纯化和双向分化培养

目的在体外培养条件下获取纯度较高的O-2A细胞系细胞并探索其分化规律。方法根据星形胶质细胞、O-2A祖细胞的生长时间差异及细胞的粘附特性不同，采用振荡法和差速贴壁法，结合1型星形胶质细胞条件培养液，培养、分离纯化O-2A祖细胞。结果纯化的O-2A祖细胞胞体呈椭圆形，具有典型的双极突起；经免疫细胞化学染色鉴定，细胞的纯度达90％。在有血清的情况下，O-2A祖细胞定向分化为2型星形胶质细胞；在无血清的情况下，定向分化为少突胶质细胞。结论通过振荡法和差速贴壁法，结合1型星形胶质细胞条件培养液分离纯化培养的O-2A祖细胞具有双分化潜能。     

NKCC1抑制剂布美他尼对大鼠脊髓原代少突胶质前体细胞增殖的影响

目的 研究钠-钾-氯共转运体1(NKCC1)抑制剂布美他尼(Bumetanide)对脊髓原代少突胶质前体细胞(OPCs)增殖的影响及其机制.方法 振摇及差速贴壁法培养大鼠脊髓原代OPCs,使用NKCC1抑制剂布美他尼干预.免疫荧光法鉴定细胞及其NKCC1表达;EdU细胞增殖检测试剂盒检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期...     

脂多糖对部分神经胶质细胞NgR表达的实验研究

目的:观察脂多糖诱导早产鼠小胶质细胞和少突胶质前体细胞NgR的表达及变化,了解NgR表达在TLR-4介导的神经胶质细胞释放炎性细胞因子中的作用。方法:采用振荡和差速贴壁法体外纯化培养MG和OPCs,分别用特异性抗体CD11b和O4做细胞鉴定;用实时荧光定量PCR检测各组MG、OPCs的NgR和MG的TLR-4基因表达情况,并用ELISA测各组TNF-α的含量。结果:LPS诱导后较其他对照组及处理组MG的TLR-4表达水平和MG、OPCs的NgR表达水平均增高,差异具有统计学意义(P<0.05),各组MG经LPS诱导后较其对照组及处理组的TNF-α的含量增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:细菌感染使MG和OPCs的NgR表达增高;脂多糖诱导小胶质细胞表达大量TLR-4需要NgR的介导;TLR-4可能存在上调NgR基因表达的作用。     

少突胶质前体细胞分离培养方法的改进及其谱系限定细胞体外分化模型的建立

目的对少突胶质前体细胞(OPCs)的分离、培养及传代方法进行改良,并建立少突胶质谱系限制细胞的体外分化模型,以模拟体内OPCs的发育过程。方法通过非特异性差异黏附法与A2B5-IgM抗体免疫筛选法结合,从胚胎大鼠脊髓来源的细胞悬液中分离、纯化OPCs,用含成纤维细胞生长因子-2和血小板源性生长因子的培养液作扩增培养;再以三碘甲状腺氨酸和神经营养因子-3诱导OPCs分化,最终分化为成熟的少突胶质细胞(OLs)。OPCs及其分化细胞的特性通过形态学观察和免疫化学染色法鉴定。结果 95%以上的细胞具有双极或三极突起的典型OPCs形态,并表达A2B5;在一定的培养条件下,OPCs可持续扩增和反复传代,且扩增的OPCs仍能维持其特有的形态和自我增殖的特性;进入分化进程的细胞将依次表达O4、O1、受体反应蛋白及髓鞘碱性蛋白等特异性分化抗原。结论分离的OPCs在形态、增殖以及分化格局等方面均与存在于胚胎脑区的O2A前体细胞(体内OPCs)相类似。     

大鼠少突胶质前体细胞纯化及原代培养的新方法

【摘要】目的 建立简单、高效的少突胶质前体细胞（OPCs）分离培养方法。方法 取出生2天的SD大鼠大脑皮层,分离消化皮层细胞为单细胞悬液,采用A2B5免疫磁珠提纯OPCs进行体外培养,倒置显微镜观察细胞生长状况,并在第7天采用免疫荧光检测OPCs特异性标志A2B5和O4;培养7天后换为OPCs分化培养基诱导OPCs分化,分化培养7天后,免疫荧光法检测成熟少突胶质细胞特异性标志骨髓碱性蛋白（MBP）。结果 培养过程中观察发现,95%以上的细胞具有双极或三级突起的典型形态,免疫荧光显示纯化培养的OPCs 95%以上表达A2B5和O4;分化培养后95%以上的细胞为MBP阳性的少突胶质细胞。结论 采用磁珠法可以获得高纯度的OPCs,并且细胞具有分化为成熟少突胶质细胞的能力。     

大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞的生物学特性

目的 探讨大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞在体外条件下的增殖及分化等生物学特性,为进一步研究脊髓脱髓鞘疾病的髓鞘再生奠定基础.方法 采用免疫吸附法原代培养大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞,并用免疫荧光染色鉴定其表面标志物A2B5及NG2;采用Alarm blue法检测其在体外的增殖能力,并绘制生长曲线;诱导原代培养的少突胶质前体细胞向成熟少突胶质细胞分化,并用免疫荧光染色鉴定成熟少突胶质细胞表面标志物MBP及GalC的表达情况.结果 免疫吸附法可以对大鼠脊髓组织中的少突胶质前体细胞进行有效的分离纯化,分离获得的少突胶质前体细胞A2B5及NG2表达呈阳性,Alarm blue法检测结果显示少突胶质前体细胞在体外具有良好的增殖能力,诱导分化实验证实少突胶质前体细胞可以分化为成熟少突胶质细胞并且MBP及GalC表达呈阳性.结论 采用免疫吸附法原代培养的大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞在体外具有良好的增殖能力以及分化为成熟少突胶质细胞的能力.     

大鼠脑皮质星形胶质细胞的纯化培养

目的获取纯度较高的大鼠脑皮质星形胶质细胞，用于进一步实验。方法取新生大鼠大脑，用酶消化结合机械吹打方法分离皮质细胞制成细胞悬液，差速贴壁法去除成纤维细胞，培养融合时，恒温摇床振荡法去除少突胶质细胞、小胶质细胞等，纯化后，观察星形胶质细胞生长变化规律，并通过GFAP免疫细胞化学方法鉴定星形胶质细胞。结果大鼠脑皮质细胞接种后24h全部贴壁，部分细胞已伸出突起；3～5d时细胞增殖最明显，细胞数目增加，体积增大，突起相互交织成网状；原代培养7～10d时细胞基本融合并开始分层生长。振荡纯化处理后，GFAP免疫细胞化学染色阳性细胞可达98％。结论用差速贴壁和恒温振荡方法可获得高纯度皮质源性星形胶席细胸．     

少突胶质前体细胞分离培养方法及其谱系限定细胞体外分化模型建立的改进

目的：对少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)的分离、培养及传代方法进行改良,探讨体外条件下OPCs的增殖与分化特性。方法： 取新生SD大鼠脊髓来源的细胞分离、纯化OPCs行原代培养,用含碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和血小板源性生长因子-aa(platelet-derived growth factor-aa,PDGF-aa)的培养液作扩增培养,MTT法检测OPCs的增殖能力;三碘甲腺原氨酸和睫状神经生长因子诱导OPCs分化,最终分化为成熟的少突胶质细胞(oligodendrocytes,OLs),并对分化细胞行形态学及免疫化学染色法鉴定。结果：95%以上的细胞具有双极或三极突起的典型OPCs形态并表达A2B5;MTT法检测显示OPCs在体外保持良好的增殖能力;细胞最终诱导分化为成熟的OLs并表达髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)。结论：OPCs在体外条件下可继续保持良好的增殖生长及定向分化能力。     

大鼠寡突胶质前体细胞的体外培养、鉴定及其生物学特性观察

目的 探讨体外培养条件下寡突胶质前体细胞增殖、迁移及分化特性。方法 取新生1 d SD大鼠大脑皮质混合胶质细胞培养10 d,分离纯化寡突胶质前体细胞。通过BrdU掺入实验对其增殖能力进行测定,采用经典的Transwell模型和重聚球模型对其迁移能力进行检验,并在分化培养基中观察其分化成为成熟寡突胶质细胞的能力。结果 混合培养胶质细胞在培养10 d后出现明显分层现象。初次振荡后,小胶质细胞脱落显示大量聚集成团的寡突胶质前体细胞散布于星形胶质细胞表面。分离的寡突胶质前体细胞NG2、A2B5表达阳性;阿糖胞苷可抑制其增殖(P<0.01);PDGF可明显促进其迁移(P<0.01);在分化培养条件下,MBP阳性的成熟寡突胶质细胞增多(P<0.01)。结论 寡突胶质前体细胞在体外培养条件下可以保持其增殖、迁移和分化的基本特性。     

Differentiation of rat oligodendrocyte precursor cells in chemical conditional medium in vitro

Objective： To investigate in vitro differentiation of oligodendrocyte precursor cells （OPCs） into mature oligodendrocytes in chemical conditional medium. Methods： The mixed glial cells from cerebral cortices of 48-hour-old Sprague-Dawley （SD） rats were cultured in vitro. The OPCs were separated by shaking procedure around 9-10 d in the primary culture. Then the isolated OPCs were further transferred into the chemical conditional medium for cell differentiation. The pattern of OPCs maturation in vitro was continuously observed with contrast phase microscopy and mature oligodendrocytes were further identified by immunocytochemical assays. Results： OPCs grew well when co-cultured with glial cells and distinct cellular stratification formed about 9-10 d in the primary culture, which indicated the appropriate opportunity for the separation of OPCs. Following cultured in the chemical conditional medium, the OPCs progressively differentiated into the mature oligodendrocytes. These mature oligodendrocytes were also immunostained with the oligodendrocyte lineage-specific antibody, Oligo2. Conclusion： The OPCs isolated from the cerebral cortices of neonatal SD rats can progressively differentiate into mature oligodendrocytes in the chemical conditional medium in vitro.     

少突胶质细胞前体细胞移植治疗中枢神经系统脱髓鞘疾病的研究进展

脱髓鞘疾病是一类以髓鞘脱失为主要特征的神经系统疾病.脱髓鞘疾病可严重影响患者生活质量,并且目前鲜有令人满意的治疗方法.少突胶质细胞前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)是存在于中枢神经系统(central nervous system,CNS)中,具有迁移、增殖及分化为成熟少突胶质细胞(oligodendrocytes,OLs)能力的前体细胞.OLs是CNS中的成髓鞘细胞,因此OPCs与CNS中髓鞘的发生和损伤后再生都密切相关.近些年对OPCs发育和分化分子基础研究的深入直接推动了利用多能干细胞定向分化以及体细胞谱系重编程等手段获得OPCs的进步,使OPCs移植成为可能治疗CNS脱髓鞘疾病的新方法.本文对近些年的相关研究进行了综述.     

血管内皮生长因子促进少突胶质前体细胞增殖及其机制的初步研究

目的观察不同浓度血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对少突胶质前体细胞(oli-godendrocyte precursor cells,OPCs)增殖的影响,探索VEGF促进OPCs体外增殖与Notch信号通道上相关蛋白的关系。方法分离纯化培养OPCs,MTT法检测不同浓度VEGF(50、100、200 ng/ml)促进OPCs增殖的作用以及加入Notch通路γ-分泌酶抑制剂DAPT(VEGF 100 ng/ml+DAPT50μmol/ml)后OPCs增殖变化情况,RT-PCR、Western blot技术检测VEGF处理OPCs后Notch信号通道上Notch-1、Hes-1的基因表达和蛋白表达情况。结果 50、100、200 ng/ml VEGF处理组的细胞增殖率分别为(107±2)%、(124±2)%、(142±7)%,与空白对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05);VEGF+DAPT处理组的增殖率下降至(103±4)%(P<0.05)。RT-PCR及Western blot分析显示VEGF处理OPCs后,Notch-1、Hes-1蛋白在基因水平和蛋白水平表达均增加(P<0.05),γ-分泌酶抑制剂DAPT能抑制其表达(P<0.05)。结论 VEGF对OPCs具有促进增殖的作用,其促增殖作用与Nocth信号通路相关蛋白有关。     

少突胶质前体细胞与髓鞘形成及再生的研究进展

脱髓鞘病变可阻碍神经系统电传导,导致功能障碍。髓鞘再生由广泛分布于成体的少突胶质前体细胞(OPC)介导。理解少突胶质细胞生理学,了解髓鞘形成与维稳机制,了解在某些主要神经系统病变(如多发性硬化)CNS髓鞘再生失败与内源性OPC数量、迁移以及形成髓鞘能力的关系,对于改善髓鞘修复策略具有重要意义。     

大鼠雪旺细胞系RSC96条件培养液对少突胶质前体细胞的体外增殖作用

目的 观察大鼠雪旺细胞系RSC96细胞条件培养液(RSC96-CM)对少突胶质前体细胞(OPCs)增殖的影响,探讨其作用机制.方法 应用免疫粘附法从胚胎15d的SD大鼠脊髓分离OPCs,应用BrdU掺入实验检测OPCs的增殖,应用RT-PCR技术检测PDGF-AA和bFGF在RSC96细胞的表达,应用ELISA技术检测RSC96-CM中PDGF-AA和bFGF蛋白的浓度,以特异性抑制剂阻断观察PDGF-AA和bFGF在RSC96-CM诱导OPCs增殖中的作用,以特异性抑制剂观察ERK和JNK信号途径在RSC96-CM诱导OPCs增殖中的作用.结果 不同浓度的RSC96-CM培养的OPCs,其BrdU+细胞的比例与对照组相比均显著增加(P＜0.05),其中,在含50％ RSC96-CM的培养液中培养的OPCs的BrdU+细胞的比例达高峰.RT-PCR证实RSC96细胞显著表达PDGF-AA和bFGF的mRNAs,ELISA结果发现,RSC96-CM中PDGF-AA和bFGF的蛋白浓度分别是我们前期报道的B104CM中PDGF-AA和bFGF的蛋白水平的0.87倍和0.92倍.PDGFR的特异性抑制剂AG1295和bFGFR特异性抑制剂PD173074均显著降低RSC96-CM诱导的OPCs增殖;此外,Erkl/2特异性抑制剂U0126和JNK特异性抑制SP600125的预孵也显著降低RSC96-CM诱导的BrdU+ OPCs的比例(P＜0.01).结论 RSC96-CM显著诱导OPCs的增殖,其通过RSC96分泌的PDGF-AA和bFGF激活Erkl/2和JNK信号途径而发挥作用;RSC96-CM也可以作为OPCs常规培养的扩增剂.     

Inhibition of TROY promotes OPC differentiation and increases therapeutic efficacy of OPC graft for spinal cord injury

Objective:To observe the regulatory effects of TROY on neural myelination in central nervous system(CNS)and remyelination in response to spinal cord injury(SCI)by oligodendrocyte precursor cell(OPC).Results:TROY expression was detected by RT-PCR and Western blotting in OPCs as well as in differentiated premature and mature oligodendrocytes of postnatal mice.Pharmacological inhibition or RNAi-induced knockdown of TROY promotes OPC differentiation,whereas overexpression of TROY dampens oligodendrocyte maturation.Furthermore,treatment of co-cultures of DRG neurons and OPCs with TROY inhibitors promotes myelination and myelin sheath-like structures.Mechanically,protein kinase C(PKC)signaling is involved in the regulation of the inhibitory effects of TROY.Moreover,in situ transplantation of OPCs with TROY knockdown leads to notably enhanced remyelination as well as augmented recovery of motor function and nervous conduction in rats with SCI.Conclusions:Our results indicate that TROY negatively modulates remyelination in the CNS,and thus may be a suitable target for improving the therapeutic efficacy of cell transplantation for CNS injury.